Name: 钙调蛋白结合蛋白的下拉 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习钙调蛋白下拉实验方法，利用钙依赖性结合特性研究蛋白质相互作用。该技术通过钙调蛋白琼脂糖珠高效分离结合蛋白，结合蛋白质印迹分析揭示钙信号通路机制。

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作者感谢Tiffany Cherry在优化本方案过程中提供的帮助。本研究由美国国家衰老研究所（AG032320）以及“推进威斯康星州更健康”项目资助。

请参见图1，了解从匀浆开始的实验基本示意图。从制备细胞提取物到洗脱CaM结合蛋白的预计时间为六至七小时。
1. 组织制备
<ol>
	<li>向海马体脑片注射含有表达目标重组蛋白质粒的病毒（本示例中为绿色荧光蛋白（GFP）标记的Ng），并在过夜孵育中使组织表达该蛋白。</li>
 <li>在病毒注射后约12至18小时（根据病毒表达时间而定），准备收集组织。加入1 mL解剖缓冲液（10 mM葡萄糖，4 mM KCl，26 mM NaHCO₃，233 mM蔗糖，5 mM MgCl₂）2，1 mM CaCl2，以及0.1%酚红，用5% CO₂气体饱和2 95% O2 将培养的组织/插入物转移至培养皿中，并加入2 mL解剖缓冲液至插入物中，使组织完全浸没。 </li>
 <li>使用解剖刀轻轻刮取海马组织，将其从插入膜上分离，收集5至10片组织切片。也可选择性地切除特定感兴趣区域（如CA1区）。使用倒置的巴斯德移液管将悬浮的组织转移至1.5 mL微量离心管中。 </li>
 <li>以1,500 rcf离心1分钟，使组织与解离缓冲液分离。小心吸除上清液，注意勿扰动沉淀。 </li>
 <li>对于每一片使用的切片，加入 30 至 60 μL （150 mM NaCl，20 mM Tris（pH 7.5），1 mM DTT）的匀浆缓冲液 1μg/mL 亮抑蛋白酶肽， 1μg/mL 化学阻滞剂， 1μg/mL 抑蛋白酶肽， 1μg/mL 将 pepstatin、1% Triton X-100 加入组织中，用研杵充分匀浆。</li>
 <li>为去除细胞碎片，将剩余的匀浆在1,100 rcf下离心10分钟，并小心吸取上清液，避免接触沉淀物造成污染。</li>
 <li>取上清液的10%作为输入样品（样品1）。在准备步骤3使用的CaM-Sepharose beads期间，将剩余上清液置于冰上保存。</li>
</ol>
注意：此处使用的组织为海马区脑片。然而，也可使用离体培养的神经元或其他任何细胞培养系统。若采用此类材料，请在以适当方法获取组织后，从步骤1.4开始操作。
2. 准备用于下拉实验的珠子
在处理磁珠时，为防止磁珠在管壁上干燥，应尽量回收磁珠并提高反应效率。为此，在离心前应将离心管平放旋转，使溶液润湿管壁上的磁珠。
<ol>
	<li>每次进行下拉实验时，将400 μL悬浮的钙调蛋白-琼脂糖微珠移入一个底部相对平坦的2 mL微量离心管中，以最大化溶液与微珠在孵育过程中的接触表面积和相互作用。</li>
 <li>在21,000 rcf下离心30秒，然后小心地通过抽吸去除上清液，注意不要扰动微珠。</li>
 <li>为洗涤微珠，向用于下拉Ca2+-CaM结合蛋白的微珠中加入含2 mM CaCl2的相应匀浆缓冲液，或向用于下拉ApoCaM结合蛋白的微珠中加入含2 mM EDTA（一种已知的Ca2+螯合剂）的缓冲液，每管100 μL。轻轻敲击管壁使微珠重新悬浮，然后在1,500 rcf下离心1分钟。小心地通过抽吸去除上清液，注意不要扰动微珠。</li>
</ol>
注意：进行所有吸液步骤时，建议使用具有细小开口的移液枪头（例如加样枪头），以便在不吸走微珠的情况下移除溶液。
3. 蛋白质与CaM-sepharose结合
<ol>
	<li>将上清液均分为两份，每份体积相等。根据实验条件，向每份上清液中分别加入适量的 CaCl2 或 EDTA，使其终浓度达到 2 mM。</li>
 <li>将步骤 1.7 中的上清液加入已用相应匀浆缓冲液洗涤过的磁珠中。轻轻敲击离心管以混匀。</li>
 <li>将样品在 4°C 条件下于摇床上孵育 3 小时。每隔约 30 分钟重新悬浮磁珠一次，以提高结合效率。</li>
 <li>将含有样品和磁珠的离心管在 1,500 rcf 条件下离心 3 分钟。</li>
 <li>取 50μL 上清液作为未结合蛋白样品（样品 2），然后小心吸除剩余上清液并弃去。</li>
 <li>使用 100μL 相应的匀浆缓冲液，按照步骤 2.3 所述方法洗涤磁珠三次。</li>
</ol>
4. 洗脱
<ol>
	<li>向珠子中加入50μL洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl），其中含有相反条件（10mM CaCl2 或 10mM EDTA）。例如，在含有Ca2+的缓冲液中进行匀浆和结合的样品，应使用含有EDTA的洗脱缓冲液进行洗脱，反之亦然。</li>
</ol>
可选：在将洗脱缓冲液加入珠子前将其预热至 37°C，可能提高得率。
<ol start="2">
 <li>将溶液与磁珠在室温下于摇床上孵育30分钟。每隔约5分钟轻轻敲击离心管，混匀磁珠。</li>
 <li>以1,500 rcf离心3分钟，然后小心吸取上清液50μL，用于收集结合的蛋白质（样品3）。注意勿扰动磁珠。</li>
 <li>向所有样品（即匀浆液、未结合蛋白、已结合蛋白以及仍与磁珠结合的蛋白）中加入蛋白质上样缓冲液。</li>
</ol>
注意：为了最大限度地提高洗脱效率（特别是在洗脱效率较低的情况下），在加热样品前向珠粒中加入50 μL相应的洗脱缓冲液（例如，向以CaCl2结合的珠粒中加入含EDTA的缓冲液），以帮助洗脱任何残留的结合蛋白，并重复步骤4.3中所述操作，以去除残留的结合蛋白。
5. SDS-PAGE 和蛋白质印迹
进行SDS-PAGE电泳，并通过Western印迹分析目标蛋白的表达情况，同时在相反条件下检测一种已知可结合钙调蛋白（CaM）的蛋白作为阳性对照。
6. 代表性结果
图2B展示了一个CaM下拉实验的示例，用于检测GFP标记的Ng蛋白与内源性Ng蛋白在CaM结合能力上的比较。为此，我们在离体海马脑片中过夜过表达GFP-Ng，随后将组织匀浆。将匀浆液与CaM-Sepharose微珠在含Ca2+或EDTA的条件下孵育。匀浆输入样本显示，除内源性Ng和钙/钙调蛋白依赖性激酶II（CaMKII）外，GFP-Ng也成功表达。正如基于已知内源性Ng结合特性所预期的那样（如图2A所示），GFP标记的Ng在无Ca2+条件下被洗脱（EDTA结合蛋白），而在有Ca2+存在时未结合（图2B）。相反，作为对照的CaMKII仅在有Ca2+时被洗脱（结合蛋白），在无Ca2+（EDTA）时则未结合。这表明CaM微珠功能正常，且洗脱过程高效。最重要的是，该结果表明GFP-Ng与ApoCaM的结合方式与内源性Ng相似，提示GFP标签并未改变我们所用重组蛋白的功能。
<img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="CaM pull-down 实验示意图：上样、蛋白结合、洗脱；离心、试剂使用。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 图1. CaM pull-down 实验流程示意图 
(A) 组织匀浆液经离心去除细胞碎片。取上清液约10%作为输入样品（1）。将剩余上清液等分至不同实验条件组，并分别加入相应试剂（CaCl2 或 EDTA），以检测在这些条件下蛋白的结合情况。将各上清液（分别含有 CaCl2 或 EDTA）加入预先准备好的 CaM-Sepharose 微球中，(B) 孵育以促进结合反应。去除未结合的蛋白（2），(C) 使用含与结合条件相反试剂的洗脱缓冲液（E.B.）将结合的蛋白（3）从微球上洗脱下来。这三种蛋白样品的组成可通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹（western blot）分析进行检测。
<img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="钙结合蛋白相互作用示意图及凝胶电泳结果，显示CaM、CaMKII、Ng。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 图2. A.) 拉下实验中Ca2+依赖性CaM结合与洗脱的示意图。图中给出了两种以Ca2+依赖方式与CaM结合的蛋白质示例。神经颗粒素（Ng）代表与无钙CaM（apo-CaM）结合的蛋白质，而CaMKII代表与富含Ca2+的CaM结合的蛋白质。图中显示CaM在与匀浆蛋白孵育前处于解离状态。当在高Ca2+浓度（2 mM）条件下或在Ca2+螯合剂EDTA（2 mM）存在下孵育时，这些蛋白质将相应地与CaM结合。在EDTA条件下，由于几乎不存在Ca2+，Ng会与CaM结合，并可在Ca2+存在时从CaM-琼脂糖珠上洗脱下来。然而，CaMKII仅在高浓度Ca2+存在时与CaM结合，一旦Ca2+被螯合，便会从CaM上解离。
 B.) CaM拉下实验的示例结果。该图展示了使用CaM-琼脂糖进行拉下实验后的预期结果，样品经Ng和CaMKII探针检测。在EDTA存在下与CaM结合的蛋白泳道中，内源性Ng和GFP-Ng均可见。当样品在Ca2+存在下与CaM孵育时，未检测到Ng结合，表明Ng仅与无钙CaM（apo-CaM）结合。而作为阳性对照的CaMKII则仅在Ca2+存在时与CaM结合。

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<li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Clin.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li>
<li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin%27s+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li>
<li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本实验方案利用钙调蛋白-琼脂糖珠（CaM-sepharose beads）研究钙调蛋白结合蛋白与Ca2+结合的依赖性。许多蛋白质以Ca2+依赖的方式与钙调蛋白（CaM）结合。鉴于钙调蛋白结合蛋白的数量众多，且在多种信号通路中发挥关键作用，这类相互作用具有重要意义。在本方案中，使用钙调蛋白-琼脂糖珠在有或无Ca2+的条件下，从组织匀浆中分离出钙调蛋白结合蛋白。这种简单方法的结果将有助于进一步理解蛋白质如何以Ca2+依赖的方式与钙调蛋白相互作用。该方法与蛋白质结合研究中常用的柱层析技术不同之处在于，钙调蛋白-琼脂糖珠处于溶液中，而非固定于基质中。
该方法的一个优势是无需使用层析柱，因为省去层析柱可节省时间，无需进行柱平衡或等待重力流穿。由于效率高，CaM沉淀法所需的组织量显著少于柱层析法，并且简化了样品制备过程，因为从蛋白质样品中分离细胞碎片仅需进行短暂离心即可完成所述的CaM-Sepharose沉淀。层析柱要求蛋白样品中不能含有任何细胞碎片，这可能需要额外的纯化步骤。该方法相较于其他沉淀技术（如免...

<table><tbody><tr><td>钙调蛋白-琼脂糖珠</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>抗CaMKII α抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6974</td><td></td></tr><tr><td>抗神经颗粒蛋白抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-425</td><td></td></tr><tr><td>凝胶上样移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-138</td><td>用于吸取上清液</td></tr><tr><td>微量离心管（2.0 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-146</td><td>用于涉及钙调蛋白-琼脂糖珠的所有步骤</td></tr></tbody></table>

钙调蛋白结合蛋白的下拉实验

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

钙（Ca2+)是一种通过多种机制调节细胞功能的关键离子。大量Ca2+ 信号转导通过一种名为钙调蛋白（calmodulin, CaM）的钙结合蛋白介导1,2CaM 参与调控几乎所有细胞过程的多个层面，包括细胞凋亡、代谢、平滑肌收缩、突触可塑性、神经生长、炎症及免疫反应。多种蛋白质通过与 CaM 相互作用来调节这些通路。其中许多相互作用依赖于 CaM 的构象，而 CaM 在结合 Ca²⁺ 后的构象具有显著差异。2+ (Ca2+- CaM）与结合钙离子后的CaM相对2+无钙状态（ApoCaM）3.
虽然大多数靶蛋白结合 Ca2+-钙调蛋白（CaM），某些蛋白质仅与脱钙钙调蛋白（ApoCaM）结合。其中一些蛋白质通过其IQ结构域与钙调蛋白结合，包括神经调节蛋白（neuromodulin）4神经颗粒蛋白（Ng）5以及某些肌球蛋白6这些蛋白质已被证实对突触前功能具有重要作用7，突触后功能8，以及肌肉收缩9分别。它们在有或无钙离子存在的情况下结合并释放钙调蛋白（CaM）的能力2+ 在其功能中起着关键作用。相比之下，许多蛋白质仅结合 Ca2+-钙调蛋白（CaM），并需要与CaM结合才能被激活，例如肌球蛋白轻链激酶10，Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶（CaMKs）11 和磷酸酶（例如钙调磷酸酶）12和血影蛋白激酶13，具有多种直接和下游效应14.
这些蛋白质对细胞功能的影响通常取决于其以依赖 Ca2+ 的方式与钙调蛋白（CaM）结合的能力。例如，我们检测了神经粒蛋白（Ng）与 CaM 结合在突触功能中的重要性，并研究了不同突变对该结合的影响。我们构建了在 IQ 结构域含有特定突变的 GFP 标签 Ng 载体，这些突变会改变 Ng 以依赖 Ca2+ 的方式与 CaM 结合的能力。对这些不同突变体的研究使我们深入理解了突触功能中涉及的重要过程8,15。然而，在此类研究中，关键是要证明突变后的蛋白质确实具有预期的、对 CaM 结合能力的改变。
本文介绍一种检测蛋白质在有或无 Ca2+ 条件下与钙调蛋白（CaM）结合能力的方法，并以 CaMKII 和神经粒蛋白（Ng）为例进行说明。该方法属于亲和层析的一种，称为 CaM 拉下实验（CaM pull-down assay）。该实验利用 CaM-Sepharose 微珠检测与 CaM 结合的蛋白质，以及 Ca2+ 对这种结合的影响。与柱层析及其他检测方法相比，该方法显著节省时间，且所需蛋白量更少。总体而言，该方法为研究 Ca2+/CaM 信号通路及与 CaM 相互作用的蛋白质提供了有力工具。

钙调蛋白（CaM）下拉实验是研究CaM与多种蛋白质相互作用的有效方法。该方法利用CaM-琼脂糖 beads，可高效、特异性地分析CaM结合蛋白，为探索CaM在细胞功能中的信号转导提供了重要工具。

钙离子（Ca2+）是一种通过多种机制调节细胞功能的关键离子。大部分Ca2+信号转导是通过……介导的。

本实验的总体目标是检测那些以钙依赖方式与钙调蛋白结合的蛋白质。该目标通过以下步骤实现：首先收集目的蛋白质，然后制备钙调蛋白琼脂糖珠用于蛋白质结合。然后将蛋白质与钙调蛋白琼脂糖珠共同孵育。最后，洗脱以钙依赖方式与钙调蛋白结合的蛋白质。最终可通过蛋白质印迹分析获得结果，显示在有钙或无钙条件下与钙调蛋白结合的蛋白质。与现有的其他方法（如凝胶过滤层析和免疫共沉淀）相比，该技术的主要优势在于所需蛋白质样品量更少且耗时更短。该方法有助于解答牛modlin信号传导领域中的关键科学问题，例如：哪些蛋白质以钙依赖的方式与牛modlin结合，以及翻译后修饰如何影响这些蛋白质与牛modlin的结合能力。对该方法进行可视化演示至关重要，因为磁珠操作步骤十分关键，而关于磁珠重悬与保留的操作描述若无直观展示则难以准确理解和执行。为制备用于均一注射的器官型海马切片，需使用含有表达目标重组蛋白质粒的病毒转导组织。在此示例中，该重组蛋白为GFP标记的Neuro Grandin。在病毒注射后，让组织于约12至18小时的过夜时间内表达该蛋白，随后向培养皿中加入一毫升的解剖缓冲液。用刀片将带有插入物的培养组织转移至培养皿中，并向插入物内加入2毫升解剖缓冲液，使组织浸没。使用倒置的巴斯德吸管轻轻刮取组织，使其从插入物膜上脱落，收集5到10片器官型海马组织切片。将悬浮的组织转移至1.5毫升微量离心管中。接下来，将样品在1500 RCF下离心1分钟。通过小心吸除上清液，以分离组织与解剖缓冲液。注意不要扰动沉淀物。对于每个使用的切片，用剪去尖端的1毫升移液枪将组织加入30至60微升裂解缓冲液中，然后使用研磨杵充分匀浆，再将匀浆液转移回原来的离心管中。为去除细胞碎片，将剩余匀浆液在1100 RCF下离心10分钟，并小心吸取上清液，避免接触沉淀物造成污染。取上清液的10%作为输入样品分装保存。在制备钙调素血清珠期间，将剩余的上清液置于冰上保存以备后续使用。随后，每份免疫沉淀反应中，将400微升悬浮的钙调素血清珠溶液转移至一个底部相对平坦的2毫升微量离心管中，以最大化孵育过程中溶液与磁珠的接触表面积；轻轻旋转微量离心管使其侧向滚动，以润湿管内磁珠，然后在21,000 RCF下离心30秒。小心地通过抽吸去除上清液。洗涤时注意不要扰动珠粒，将珠粒重悬于100微升相应的匀浆缓冲液中，缓冲液中需含有2毫摩尔的氯化钙，用于沉淀钙结合钙调蛋白结合蛋白；或含有2毫摩尔的EDTA（一种已知的钙螯合剂），用于沉淀无钙状态的钙调蛋白结合蛋白。轻轻敲击离心管以重悬珠子。将珠子悬浮后，在1500 RCF下离心1分钟。用移液法小心吸除上清液，注意不要扰动珠子，以便使蛋白质结合到钙调蛋白球状颗粒上进行下拉。首先将SNAT分成两等份。根据每份样品的条件，向 supernatant 中加入适量的氯化钙或EDTA，使其终浓度为2毫摩尔。将sup

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钙调蛋白结合蛋白的下拉

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