Name: 在封装的细胞聚集跟踪缺氧信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学习使用PEG水凝胶光封装技术追踪小鼠胰岛素瘤细胞聚集体的缺氧信号。该方法通过荧光显微镜可视化缺氧诱导因子活性，为再生医学和糖尿病治疗研究提供重要工具。

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感谢科罗拉多大学博尔德分校Kristi Anseth实验室慷慨提供MIN6细胞。本项目由美国国家科学基金会（NSF）提供资助。

1. PEGDM 的合成与光敏性 PEGDM 大分子单体溶液的制备
<ol>
	<li>称取 2g PEG（线性，10,000Da）至一个带硬质塑料盖的 40mL 玻璃小瓶中。</li>
	<li>加入约 308μL 甲基丙烯酸酐，并将瓶盖 loosely 盖上。</li>
	<li>将小瓶放入普通家用微波炉中，高火加热 2 分钟。佩戴耐热手套，充分涡旋混匀后，再以高火加热 5 分钟。</li>
	<li>短暂冷却小瓶至可用戴手套的手操作。打开瓶盖，边轻轻旋转小瓶边缓慢加入二氯甲烷。加入至溶液呈现澄清均一状态，必要时涡旋混匀样品。所用二氯甲烷总体积应为 1.5 - 2 mL。</li>
	<li>将上述溶液逐滴加入 200 mL 冷却并持续搅拌的乙醚中，使 PEGDM 沉淀析出。</li>
	<li>通过真空抽滤收集 PEGDM 沉淀，并使其自然干燥。</li>
	<li>将 PEGDM 溶解于适量去离子水中（通常为 100 - 150 mL）。</li>
	<li>将溶液装入截留分子量为 1,000 Da 的透析袋中，对去离子水透析 5 天，每天更换一次水。</li>
	<li>将透析后溶液分装至适当容器中，于 -80°C 冷冻过夜。再冷冻干燥 4 天，得到纯化的白色 PEGDM 粉末。不使用时，将粉末储存在 4°C 环境中。</li>
	<li>为制备光敏性 PEGDM 溶液，首先配制 0.5 重量百分比的光引发剂储备液：将 Irgacure 2959 溶解于去离子水中。充分涡旋混匀后避光保存。</li>
	<li>在 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中配制 10 wt% PEGDM 和 0.025 wt% Irgacure 2959 的混合溶液。充分涡旋以确保 PEGDM 完全溶解。我们通常每次配制 1mL 该溶液。</li>
	<li>使用 0.2 μm 注射式滤器将溶液过滤至 1.8 mL 微离心管中，以实现溶液灭菌。用铝箔包裹离心管，于 4°C 储存。</li>
</ol>
2. MIN6 细胞的培养、感染与聚集
<ol>
	<li>MIN6 细胞在添加了 10% 胎牛血清（FBS）、7 mM 葡萄糖、100 单位/毫升青霉素/链霉素和 0.5 μg/mL 两性霉素 B 的 RPMI 1640 培养基中培养，培养环境为 37°C、5% CO2 的湿润环境。</li>
	<li>为从处理过的培养瓶表面释放细胞，先吸除培养基，用 37°C 无钙/镁的 HBSS 洗涤细胞，吸除 HBSS，然后加入 2 mL 37°C 的胰蛋白酶-EDTA 溶液，使细胞孵育 3 分钟。</li>
	<li>用力轻敲培养瓶侧面使细胞脱落，随后加入 8 mL 37°C 培养基，并剧烈吹打细胞悬液上下混合，注意避免产生气泡。</li>
	<li>将细胞悬液转移至无菌的 15 mL 离心管中，使用血细胞计数板或其他细胞计数方法进行细胞计数。</li>
	<li>在准备用标记病毒感染细胞时，首先确定需要感染的细胞总数，并计算为达到所需感染复数（MOI）（每细胞 50 至 100 个感染性颗粒）所需的病毒悬液体积。</li>
	<li>将病毒悬液用移液器小心地加入装有预分装体积 HBSS 的 1.8 mL 微量离心管中，以 HBSS 稀释病毒。每孔聚集细胞加入 50 μL HBSS 为宜。</li>
	<li>通过在离心管中反复吹打使细胞充分分散，然后将适量体积的细胞悬液加入 6 孔悬浮培养板的各孔中，使每孔含有 400,000 个细胞。</li>
	<li>向每孔加入适当体积的稀释后病毒，以达到所需的 MOI。</li>
	<li>向每孔加入培养基，使总体积达到 1.7 mL。</li>
	<li>将培养板置于培养箱内的轨道摇床上，将摇床调至低速设置，使培养基在孔内轻柔流动（约 100 rpm）。让细胞聚集 24–36 小时，应形成直径约为 75–175 μm 的细胞聚集体。</li>
</ol>
3. 细胞在 PEGDM 中的包封
<ol>
	<li>细胞可以以分散状态（步骤 2.4）或在聚集后（步骤 2.10）进行包封。由于水凝胶前体 PEGDM 溶液为液态，在交联和水凝胶形成之前，细胞可能发生沉降。如果预计沉降发生较快（例如较大的聚集体），可采用两步法生成水凝胶，使细胞沉降至凝胶的中心平面。适用于分散细胞的一步法水凝胶合成流程如（图 2）所示，两步法流程也一并展示（图 3）并在下文（3.2–3.9）中详细说明。</li>
	<li>通过将 1 mL 塑料注射器的锥形尖端剪去，并将其开口端朝上置于支架中，制备用于形成水凝胶的容器。</li>
	<li>用移液器将 20 μL 光敏性 PEGDM 溶液移入注射器开口端，滴加至活塞上，确保液体覆盖整个活塞表面。通过小幅度调节活塞位置，使液体表面保持平整。</li>
	<li>将注射器置于支架中，并将支架置于紫外灯（365 nm，˜7 mW/cm2）下照射约 8 分钟，以实现水凝胶的交联。在此期间，可开始准备细胞。</li>
	<li>用移液器将含有目标数量细胞/聚集体的液体转移至 1.8 mL 微离心管中，盖上管盖，并在 130 g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>使用微量移液器小心吸除上清液，避免扰动管底的细胞沉淀。当液面接近沉淀时，使用更精细的 10 μL 吸头可能更为有利。</li>
	<li>用 20 μL 光敏性 PEGDM 溶液轻轻重悬细胞沉淀（若处理聚集体，建议使用宽口吸头），然后将细胞悬液加至注射器中先前交联的水凝胶部分之上。</li>
	<li>将注射器再暴露于紫外光下照射 8 分钟，以完成水凝胶的构建。完成后，细胞应被完全包封于圆柱形水凝胶内（图 3）。</li>
	<li>将水凝胶从注射器中推出，转移至 24 孔板中含 1 mL HBSS 的孔内，短暂清洗凝胶。随后将凝胶转移至 24 孔板中含 1 mL 培养基的孔内，在所需条件下进行培养。</li>
</ol>
4. 缺氧追踪
<ol>
	<li>在培养过程中的任意时间点，均可使用荧光显微镜对细胞成像，以追踪缺氧信号的启动。根据所观察的目标，可在多孔板中直接成像，或在将凝胶转移至显微镜载玻片后进行成像。Ds Red 的最大激发波长为 556 nm，最大发射波长为 586 nm。其发射荧光较强，因此尚未观察到明显的光漂白问题。蛋白表达启动与首次信号检测之间的滞后时间约为 12 小时。信号具有足够的特异性，可用于识别单个信号细胞，但分辨率可能不足以确定信号在细胞内的精确定位。在发生信号的细胞中，信号通常均匀分布于整个细胞质中。随着缺氧暴露时间的延长，信号强度也可能增强，但目前尚不完全明确这种增强是源于蛋白表达量的增加、总体蛋白积累，还是蛋白成熟延迟所致。</li>
</ol>
5. 代表性结果
图4展示了在PEG水凝胶中包封的MIN6细胞聚集体的一个代表性示例。图4中所示的交联凝胶将完全固化，其形状与反应所用容器的形状一致。用于移植时，表面光滑的凝胶更理想，有助于防止异物反应的发生。在凝胶内部，细胞聚集体应完全包埋于基质中并均匀分布，以利于营养物质的运输。
MIN6 细胞聚集体中缺氧信号传导的代表性图像见图5。感染了标记病毒的相同 MIN6 细胞聚集体分别在 20% O2（5a）或 1% O2（5b）条件下培养 44 小时后进行成像。
<img alt="HIF-1 转录调控示意图，HRE 三聚体结合，DsRED 表达，基因编辑。" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 1"> 
图 1. 我们的缺氧标记系统的活性示意图。通过腺病毒将 Ds Red DR 基因及其上游 HRE 启动子插入细胞，可在 HIF-1 的调控下实现缺氧诱导的荧光蛋白表达。
<img alt="静力平衡示意图；用于样品分离成层状组分的离心装置。" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. 单步法将分散的 MIN6 细胞包埋于交联 PEGDM 水凝胶中的操作流程图。每份凝胶中，将分散的细胞悬浮于 40μL 光敏性 PEGDM 大分子单体溶液中。将该混合液置于截去针头的 1mL 注射器中，在 365nm 紫外光照射下反应 10–12 分钟以形成水凝胶。反应完成后，将水凝胶圆片从注射器中取出，洗涤后转移至含培养基的多孔板中进行孵育。
<img alt="样品分离的离心过程示意图，展示试管设置和测量细节。" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 
图3. 聚集态MIN6细胞在交联PEGDM水凝胶中双步封装的流程图。对于每个凝胶，首先通过紫外光照射20μL光敏性PEGDM大分子单体溶液8分钟，形成半凝胶。然后将MIN6细胞聚集体小心地悬浮于另外20μL光敏性大分子单体溶液中，并将其加在已形成的半凝胶之上。再经额外8分钟紫外照射，形成完整凝胶，使细胞聚集体完全封装于凝胶的中层平面。
<img alt="显微镜下的细菌菌落生长；培养皿；微生物实验；细胞培养分析。" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 4"> 
图 4. 20倍放大下40μL水凝胶的图像。可见水凝胶内含有MIN6细胞聚集体（约400,000个总细胞）。水凝胶直径约为6mm（标尺=1mm）。
<img alt="细胞活力检测，活/死染色；荧光显微镜图像；细胞健康评估。" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 5"> 
图 5. 在 PEGDM 水凝胶中聚集的 MIN6 细胞的荧光缺氧信号。封装后在 20% O2 条件下培养 44 小时的细胞未显示缺氧信号（a），而在 2% O2 条件下封装并培养 44 小时的细胞则显示出明显且普遍的信号（b）。（标尺 = 100 μm）。

<ol><li>Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allotransplantation+of+the+pancreas+and+duodenum+along+with+the+kidney+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy.</a> Surgery. 61, 827-837 (1967).</li>
<li>Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Eng.+J.+Med.%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation.</a> N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).</li>
<li>Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microencapsulated+islet+cells+as+a+bioartificial+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Appli.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas.</a> Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).</li>
<li>Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microencapsulated+islets+in+agarose+gel+as+bioartificial+pancreas+by+studies+of+hormone+secretion+in+culture+and+by+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation.</a> Diabetes. 39, 224-225 (1989).</li>
<li>Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purity+of+alginate+affects+the+viability+and+fibrotic+overgrowth+of+encapsulated+porcine+iselt+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts.</a> Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).</li>
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<li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+%CE%B2-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments.</a> Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).</li>
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<li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH%2F3T3+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polymer+Edn%22%5BJournal%5D)">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).</li>
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<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li>
<li>De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+encapsulated+rat+pancreatic+islets+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia.</a> Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).</li>
<li>Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+hypoxia+with+insulin+secretion+using+a+fluorescent+hypoxia+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).</li>
<li>Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hypoxia-inducible+factors+%28HIF%29%2C+HIF+hydroxylases+and+oxygen+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing.</a> Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍的方法提供了一种快速、简便的技术，可在极少使用非生理条件的情况下实现细胞在聚乙二醇（PEG）水凝胶中的包封。PEG因其良好的生物相容性和易于修饰的特性，成为一种非常有用的包封材料。例如，通过简单调节光活性溶液中PEG的百分比，即可调控材料的力学性能（如压缩模量）和通过孔径大小决定的传质性能。此外，PEG还可通过引入侧链进行便捷的化学修饰。因此，PEG水凝胶不仅具有作为临床应用装置的前景，同时也是一种灵活的实验平台。 体外 研究
还介绍了一种用于追踪聚乙二醇（PEG）包封细胞中缺氧状态的方法。该方法在缺氧检测方面具有操作简便的优点，并可避免牺牲目标细胞。该技术可应用于多种类型细胞在多种条件下的检测，因而适用性广泛。例如，可在干细胞微团培养中追踪缺氧作为干细胞分化信号的过程。然而，该方法仅适用于分散的细胞系统，或细胞在分散后进一步聚集形成的系统。此外，在较大或较致密的组织中，荧光信号的检测可能较为困难。

<table><tbody><tr><td>聚乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309028-500G</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685-100ML</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Emerson</td><td>MW8784SB</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-A236</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100-1L</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136-1L</td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Spectrum</td><td>132640</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco Corp.</td><td>7670521</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Welch Allyn</td><td>8917Z-01</td><td></td></tr><tr><td>光引发剂 Irgacure 2959</td><td>Ciba-Geigy</td><td>029891301PS04</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>VWR international</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>*</td><td>*定制配方</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-351</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3597</td><td>Napco Series 8000 WJ 带 O2 抑制功能</td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>VWR international</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Sanyo Denki</td><td>FLR40SBLB/M</td><td>可容纳两个40W、365nm黑光蓝紫外灯管</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010*</td><td>*订货号。&lt;br/&gt;型号 5810 R</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>TI-ND6-PFS</td><td>配备激发波长556nm/发射波长586nm的滤光片组</td></tr></tbody></table>

追踪封装细胞聚集体内的缺氧信号

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

在1型糖尿病中，自身免疫反应导致胰腺β细胞被破坏，从而丧失胰岛素生成能力，并可能引发致命性高血糖。作为外源性胰岛素注射的替代治疗方案，研究人员已探索了移植功能性胰腺组织的方法1,2。该方法有望更自然、长期地恢复血糖正常水平。为防止排斥反应，需保护供体组织免受宿主免疫系统的攻击，而封装技术是一种用于实现这一目标的方法。
来源于生物的材料，如海藻酸盐3和琼脂糖4，传统上被用于胶囊构建，但可能引发炎症或纤维化过度生长5，从而阻碍营养物质和氧气的传输。相比之下，合成的聚乙二醇（PEG）基水凝胶不发生降解，易于功能化，纯度高，孔径可控，且具有极佳的生物相容性6,7,8。此外，PEG水凝胶可通过简单的光交联反应快速形成，无需非生理温度条件6,7，本文即描述了这一过程。在交联反应中，光引发剂1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮（Irgacure 2959）在紫外光照射下发生降解，产生自由基，攻击二甲基丙烯酸酯化PEG（PEGDM）的乙烯基碳-碳双键，从而在聚合物链末端引发交联。该交联过程可在10分钟内完成。采用此类方法构建的PEG水凝胶已被证实可有效支持细胞生长7,9，且低浓度的光引发剂与短暂的紫外照射对包封组织的存活率和功能无不利影响10。尽管我们采用下述方法对PEG进行甲基丙烯酸化修饰，但PEGDM也可直接从Sigma等供应商处购买获得。
包封的固有后果之一是使细胞与血管网络隔离。因此，营养物质（尤其是氧气）的供应受到限制，仅能通过扩散实现。这种氧气供应减少的情况可能对β细胞产生特别影响，因为其胰岛素分泌功能高度依赖于氧气11-13。胶囊的组成和几何结构也会影响氧气的扩散速率和扩散距离。因此，我们还描述了一种用于识别PEG胶囊内缺氧细胞的技术。通过重组腺病毒感染细胞，可在细胞内缺氧诱导因子（HIF）通路被激活时产生荧光信号14。由于HIF是介导缺氧转录反应的主要调控因子，因此它们是检测缺氧信号的理想标志物15。该方法可实现对缺氧细胞的简便、快速检测。简而言之，该腺病毒携带一个由缺氧反应元件（HRE）三聚体调控的红色荧光蛋白（Ds Red DR，来自Clontech）基因序列。在低氧条件下，HIF-1的稳定化将驱动荧光蛋白的转录（图1）。有关该病毒构建的更多细节此前已有报道15。病毒以3.4 × 1010 pfu/mL的浓度分装于1.5 mL离心管中，每管150 μL，溶剂为含10%甘油的溶液，于-80°C保存。
我们实验室先前的研究表明，以聚集体形式包封的MIN6细胞在20%氧气条件下培养4周后仍能维持其活力。在2%或1%氧气条件下培养的MIN6聚集体则表现出坏死细胞的迹象（通过溴化乙锭染色检测，活力仍约为85-90%），并出现相对于20%氧气条件下细胞的形态学改变。在20%氧气条件下所呈现的光滑球形聚集体结构消失，聚集体更倾向于表现为无序排列的细胞团。尽管低氧应激并未导致细胞活力显著下降，但显然会影响MIN6细胞的聚集体形成及其功能，这一点可通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力的测定得以证实15。对在20%和1%氧气条件下包封细胞进行的Western blot分析还显示，低氧培养条件下的细胞中HIF-1α水平显著升高，且与DsRed DR蛋白的表达呈相关性。

本文描述了一种将细胞光化学包埋于交联聚乙二醇（PEG）水凝胶中的方法。利用荧光标记系统，对包埋的小鼠胰岛素瘤（MIN6）细胞聚集体内的缺氧信号进行追踪。该系统可对水凝胶支架内的细胞进行连续观察，并将缺氧信号与细胞表型变化相关联。

在1型糖尿病中，自身免疫对胰腺β细胞的破坏导致胰岛素生成丧失，并可能引发致命性……

本实验的总体目标是监测在PEG包封的细胞聚集体中，细胞对缺氧的反应。第一步，将分散的细胞用标记病毒进行感染，然后在摇床中培养以促进聚集体的形成。接下来，对线性PEG进行功能化修饰，并纯化PEG二聚体（PEG DM rimer）。然后将细胞聚集体包埋于PEG DM水凝胶中。最后，在不同氧浓度条件下培养这些水凝胶，并通过荧光信号监测缺氧标志物。最终，可通过简单的荧光显微镜观察到存活的包埋细胞聚集体内缺氧诱导因子活性的位置和范围。该方法有助于回答细胞封装和基于细胞的治疗递送领域中的一些关键问题，例如，缺氧在三维培养体系中的哪些位置发生，以及它如何影响细胞的存活与功能？该技术的影响延伸至再生医学策略及激素缺乏症（如因聚集体和封装组织中缺氧所导致的胰岛素缺乏症）的治疗。已有研究表明，缺氧诱导因子1的活性与β细胞胰岛素分泌显著降低相关，这促使研究人员尝试将原代胰岛解离并重组成类胰岛结构。聚集体的直径减小。我们的标记物可在任何松散包封材料内的细胞水平上，通过聚集体指示缺氧诱导因子的活性。选择聚乙二醇（PEG）作为包囊材料，是由于其具有优良的传质特性、良好的细胞相容性，以及易于进行功能化修饰。在40毫升玻璃小瓶中称取两克聚乙二醇（PEG），加入约308微升甲基丙烯酸酐，用硬塑料盖 loosely 盖紧小瓶。将小瓶放入普通家用微波炉中，高火加热两分钟。随后，佩戴耐热手套，充分涡旋混匀小瓶内容物，再将溶液放入微波炉中高火加热额外五分钟。短暂冷却至可安全操作后，在旋转小瓶的同时打开瓶盖。缓慢加入二氯甲烷，必要时涡旋混匀，直至溶液呈现澄清均一状态。随后，将溶液逐滴加入200毫升搅拌下的冷乙醚中，使PEG dm沉淀析出。然后通过真空过滤收集 PEG DM，并使其干燥。待 PEG DM 干燥后，将其溶于约 100 至 150 毫升去离子水中。随后将溶液装入截留分子量为 1000 道尔顿的透析袋中，对去离子水透析五天。将溶液分装至适当的容器中，在负80摄氏度下冷冻过夜。然后将溶液冻干四天，以获得纯净的白色PEG DM粉末，用于从经处理的培养瓶表面释放细胞。首先，吸除培养基，用37摄氏度的无钙、无镁HBSS缓冲液冲洗细胞，再吸除HBSS缓冲液。加入2毫升37摄氏度的胰蛋白酶和EDTA溶液，将细胞在37摄氏度孵育3分钟。然后用力轻敲培养瓶侧面以使细胞脱落，向培养瓶中加入8毫升37摄氏度的培养基，并剧烈吹打细胞悬液上下混合，注意避免产生气泡。将细胞悬液转移至无菌的15毫升离心管后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要感染的细胞总数。加入适量的细胞悬液，使每孔含有400,000个细胞，接种于6孔悬浮培养板中。将每孔待感染的细胞悬液各50微升加入1.8毫升微量离心管中。随后，小心地将适量的病毒悬液加入已准备好的HBSS中。然后向每个孔中加入适当体积的稀释病毒，以达到所需的感染复数（MOI），再向每孔中加入培养基，使总体积达到1.7毫升。最后，将培养板放入培养箱内的旋转摇床上，将摇床调至低速档（约100 RPM），使培养基轻柔地在孔内流动，让细胞聚集24至36小时。首先，剪下一毫升塑料注射器的锥形尖端，并将其开口端朝上放置于支架中，以形成用于制备水凝胶的容器。接下来，将20微升光敏性PEG DM溶液用移液器加入注射器开口端的柱塞上，确保液体体积覆盖整个柱塞表面。以微小幅度调节柱塞，使液体表面保持平整。然后将移液器放回支架中，并将支架置于紫外灯下，照射约八分钟，以完成水凝胶的交联。在此期间，用移液器吸取含有所需数量细胞和细胞团的液体，转移至1.8毫升微量离心管中。盖上管盖，然后在130 ×g 条件下离心5分钟，使细胞和细胞团沉淀。随后使用微量移液器小心吸除上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。当移液头接近沉淀时，使用更精细的10微升移液枪头，将细胞聚集体均匀分散到凝胶前体溶液中，同时确保其完全被包埋。这是该实验步骤中最关键的部分。操作此步骤时，需小心轻柔地重悬并转移沉淀。现在，用 20 微升的光敏性 PEG DM 溶液轻轻重悬细胞沉淀。使用宽口移液器吸头，将细胞悬液加入位于交联水凝胶部分上方的注射器中，再将注射器暴露于额外八分钟的紫外光下，以完成水凝胶的构建。完成后，细胞应完全包埋于圆柱形水凝胶内部。最后，向24孔板的一个孔中加入1毫升HBSS，向另一个孔中加入1毫升培养基。然后将水凝胶从注射器中推出，放入HBSS中短暂清洗凝胶。将凝胶转移至含有培养基的孔中，并在所需条件下培养。在培养过程中的任意时间点，均可使用荧光显微镜对细胞进行成像，以追踪缺氧信号启动的情况。将24孔板放置于显微镜载物台上，使含有水凝胶的孔位于物镜正下方居中位置。该信号具有足够的特异性，可用于识别单个信号转导细胞，但分辨率可能不足以确定细胞内信号的精确定位。在发生信号转导的细胞中，信号通常均匀分布于整个细胞质中。该图展示了在凝胶腔室中被 PEG 水凝胶包封的 minx 聚集体的代表性示例。聚集体应完全包埋于基质中，并均匀分布，以利于营养物质的运输，如图所示。请注意，交联后的凝胶整体呈固态，并保持了反应所用容器的形状。本图展示了在 PEG DM 水凝胶中聚集的 min six 细胞内典型的荧光缺氧信号，这些细胞被包封后置于 20% 氧气条件下孵育 44 小时。左侧所示细胞未显示缺氧信号，而被包封后在 2% 氧气条件下孵育 44 小时的细胞（如右侧所示）则呈现出明显且普遍的缺氧信号。该缺氧信号也可在其他细胞类型中进行追踪。该图展示了包封的间充质干细胞聚集体中缺氧信号的代表性结果。如最左侧图像所示，在2%氧气条件下培养12小时后，荧光信号不可见；如中间图像所示，在2%氧气条件下培养24小时后，荧光信号变得更加明显；最后，如右侧图像所示，在按照本方案处理后，于2%氧气条件下培养96小时，荧光信号高度表达。其他方法，如ELISA、分泌蛋白分析和细胞活力检测，也可用于关联缺氧信号与细胞表型。随着该技术的发展，其有望为组织工程和基于细胞的治疗递送领域的研究人员探索细胞在支架材料和包封材料内的存活功能及分化提供新的途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

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追踪封装细胞聚集体内的缺氧信号

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