在封装的细胞聚集跟踪缺氧信号
December 16th, 2011
封装在一个交联的聚乙二醇水凝胶的细胞照片的方法描述。使用荧光标记系统内缺氧的信号封装小鼠胰岛素（MIN6）聚合跟踪。这个系统允许在水凝胶支架和相关的缺氧信号串行检查细胞与细胞表型的变化。
该程序的总体目标是监测 PEG 封装的细胞聚集体中对缺氧的反应。第一步，用标记病毒感染分散的细胞，然后在摇床上培养以允许形成聚集体。接下来，线性钉子被功能化，PEG DM rimer 被纯化。
然后将细胞聚集体封装在 PEG DM 水凝胶中。最后，水凝胶在各种氧气条件下培养，同时荧光监测缺氧标志物信号。最终，可以通过简单的荧光显微镜观察细胞活的包膜聚集体中缺氧诱导因子活性的位置和程度。
这种方法可以帮助回答细胞封装和基于细胞的治疗递送领域的关键问题，例如缺氧发生在 3D 培养物中的什么位置，以及它如何影响细胞存活和功能？这项技术的影响延伸到再生医学方法和激素缺乏症的治疗，例如津贴糖尿病，因为缺氧对聚集和封装组织的主要影响。缺氧诱导因子 1 活性已被证明与 β 细胞分泌的胰岛素大幅减少相关，促使尝试解离初级孔眼并将其改造成假孔眼。
减小直径的骨料。我们的标志物可以指示缺氧诱导因子活性，在任何松散的包封材料中，细胞水平的聚集体。选择 PEG 作为胶囊材料是因为其良好的转移特性、细胞相容性以及易于功能修饰。
在40 毫升玻璃小瓶中用大约 308 微升冰毒、丙烯酸、酸酐称取 2 克 PEG，然后用硬塑料盖松散地关闭小瓶。在标准家用微波炉中将样品瓶高温微波 2 分钟。然后戴上耐热手套，彻底涡旋样品瓶，并将溶液再高温微波加热 5 分钟。
短暂地让样品瓶冷却到足以处理，然后在旋转样品瓶的同时打开盖子。在二氯甲烷中缓慢混合，根据需要涡旋样品，直到溶液看起来透明且均匀。接下来，将溶液滴加到 200 毫升搅拌的冷达乙醚中，以沉淀 PEG dm。
然后通过真空过滤收集 PEG DM 并使其干燥。PEG DM 干燥后，将其溶解在约 100 至 150 毫升的去离子水中。然后在透析管中用去离子水溶液透析 5 天，透析后截留分子量为 1000 道尔顿。
将溶液倒入适当的容器中，并在零下 80 摄氏度下冷冻过夜。然后将溶液冻干 4 天，生成纯化的白色 PEG DM 粉末，以从处理过的培养瓶表面释放细胞。首先，吸出培养基，用 37 度 CELs 不含钙、镁的 HBSS 冲洗细胞，然后吸出 HBSS。
现在加入 2 毫升 37 摄氏度行程和 EDTA 溶液，让细胞在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。然后用力震动培养瓶的侧面，在 8 毫升 37 摄氏度的培养基下将细胞释放到培养瓶中，并用力上下移液细胞悬液。注意不要引入气泡。
将细胞溶液转移到无菌的 15 毫升离心管中后，通过血细胞仪对细胞进行计数，以确定要感染的细胞总数。将所需体积的细胞悬液添加到六孔悬浮培养板的孔中，达到每孔 400， 000 个细胞，将每孔 50 微升 HBSS 分装到要感染的细胞中，放入 1.8 毫升微量离心管中。接下来，小心地将适量的病毒悬浮液移液到准备好的 HBSS 中。
现在向每个孔中加入适当体积的稀释病毒以达到所需的 MOI，然后向每个孔中加入培养基，使总体积达到 1.7 mL。最后，将板放在轨道摇床上 在培养箱内，将摇床设置为约 100 RPM 的低设置，以便培养基在孔周围轻轻洗涤，并让细胞聚集 24 至 36 小时。首先从 1 毫升塑料注射器上切下锥形尖端，然后将其打开的一端放在架子上，以创建一个将在其中形成水凝胶的容器。
接下来，将 20 微升光活性 PEG DM 溶液移液到注射器的开口端，放到柱塞上，确保体积覆盖整个柱塞表面。以小增量调整柱塞以获得平坦的流体表面。现在将移液器放回管架中，将管架置于紫外灯下约 8 分钟，以允许水凝胶交联。
在此期间，将含有所需数量的细胞和聚集体的移液管放入 1.8 mL微量离心管中。盖上试管，然后以 130 g 的离心速度离心细胞和聚集体 5 分钟。然后使用微量移液器小心去除上清液，不要干扰试管尖端的细胞沉淀。
当培养基头接近沉淀时，使用更细的 10 μL 移液器吸头将细胞聚集体均匀分散在整个凝胶前体溶液中，同时确保它们被完全封装。这是这个程序中最棘手的部分。执行此步骤时，请注意轻轻地重新研磨和转移沉淀。
现在，将细胞沉淀轻轻重悬于 20 微升光活性 PEG DM 溶液中。使用广口移液器吸头，将细胞悬液添加到交联水凝胶部分顶部的注射器中，将注射器再暴露在紫外线下 8 分钟，以完成水凝胶的构建。完成后，细胞应完全封装在圆柱形水凝胶中。
最后，将 1 毫升 HBSS 添加到 24 孔板的一个孔中，将 1 毫升培养基加入另一个孔中。然后将水凝胶从注射器中弹出到 HBSS 中，以短暂洗涤凝胶。将凝胶转移到培养基中，并在所需条件下培养板。
在培养过程中的任何时候，都可以使用荧光显微镜对细胞进行成像，以跟踪低氧信号传导位置的启动，将 24 孔板放在显微镜载物台上，将孔与物镜下的水凝胶居中。该信号具有足够的特异性以识别单个信号转导细胞，但分辨率可能不足以确定细胞内信号定位。在信号转导细胞中，信号通常在整个细胞质中均匀观察到。
该图显示了凝胶池内封装在 PEG 水凝胶中的 minx 聚集体的代表性示例。聚集体应完全封闭在基质中并均匀分布，以便更好地运输营养物质，如图所示。注意交联凝胶在整个过程中如何呈固体，呈进行反应的容器的形状。
在该图中，显示了 PEG DM 水凝胶中聚集的 min 6 个细胞中具有代表性的荧光缺氧信号传导，这些细胞被封装，然后置于 20% 氧气下孵育 44 小时。左图未显示缺氧信号传导，而封装的细胞然后在 2% 氧气中孵育 44 小时。如右图所示，也可以在其他细胞类型中追踪清晰普遍的信号缺氧。
该图显示了包封的间充质干细胞聚集体中代表性的缺氧信号传导。如最左图所示，在 2% 氧气下 12 小时时无法检测到荧光信号，然后如中间图所示，在 24% 氧气下 24 小时后更明显。最后，如右图所示，96 小时后高度表达，氧气为 2% 遵循此程序。
可以进行其他方法，如 Eliza、分泌蛋白分析和细胞活力测定，以将低氧信号转导与细胞表型相关联。随着这一发展，这项技术可以为组织工程和基于细胞的治疗递送领域的研究人员铺平道路，以探索支架和包封材料内细胞的生存功能和分化。
概述
本文描述了一种将细胞光封装在交联PEG水凝胶中的方法，能够跟踪封装的小鼠胰岛瘤聚集体中的缺氧信号。该技术允许对水凝胶支架内的细胞进行连续检查，并将缺氧信号与细胞表型的变化相关联。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞封装
- 缺氧信号
- 再生医学
背景
- 缺氧影响3D培养中的细胞存活和功能。
- 选择PEG是因为其良好的转移特性和细胞相容性。
- 了解缺氧对于针对激素缺乏的治疗至关重要。
- 缺氧诱导因子的活性与β细胞的胰岛素分泌相关。
研究目的
- 监测PEG封装聚集体中的细胞对缺氧的响应。
- 在活细胞聚集体中可视化缺氧诱导因子的活性。
- 探索基于细胞的治疗递送的意义。
使用的方法
- 用荧光标记病毒感染分散的细胞。
- 在摇床上培养细胞以形成聚集体。
- 线性PEG的功能化和纯化。
- 将细胞聚集体封装在PEG DM水凝胶中。
主要结果
- 在水凝胶中成功封装了细胞。
- 在不同氧气条件下通过荧光监测缺氧标记信号。
- 在细胞水平上可视化缺氧诱导因子的活性。
- 了解缺氧对细胞存活和功能的影响。
结论
- 该方法为研究3D培养中的缺氧提供了一个宝贵的工具。
- 它在再生医学和糖尿病治疗中有潜在应用。
- 进一步的研究可能增强对基于细胞的治疗的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Monitoring hypoxic signaling in encapsulated cell aggregates addresses a critical challenge in cell-based therapies: ensuring functional viability of transplanted tissues under diffusion-limited conditions. This method enables early detection of oxygen deprivation impacts on insulin-producing cells, supporting predictive confidence in therapeutic efficacy. By correlating HIF-1α activity with functional readouts, it aids in de-risking encapsulation strategies for diabetes and regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking hypoxia-inducible factor activation to functional decline in insulin secretion.
- Operational Value: Provides a quantifiable fluorescent readout for pathway clarification in encapsulated beta-cell models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying oxygen thresholds that compromise cell function prior to in vivo testing.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized hydrogels with encapsulated aggregates for reproducible oxygen-gradient screening.
- Quantitative Output: Enables spatial and temporal mapping of hypoxic signaling via fluorescence microscopy.
- Platform Utility: Facilitates assay standardization across oxygen conditions to evaluate encapsulation material performance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models the avascular microenvironment encountered by encapsulated pancreatic islets in type 1 diabetes therapy.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase hypoxia assessment to preclinical validation of graft survival and function.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs material selection and geometric design to mitigate hypoxia-induced functional loss in therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypoxia assessment after aggregate formation and prior to functional screening, supporting lead identification of encapsulation formulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on oxygen-dependent pathways in encapsulated beta-cell aggregates.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible hydrogels for evaluating compound or material effects under controlled hypoxia.
- Analytics: Provides HIF-1α-driven fluorescence as a quantitative biomarker for comparing oxygen conditions and encapsulation efficacy.
- Translational Research: Connects in vitro hypoxia signaling to preclinical outcomes by correlating marker activity with insulin secretion data.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for evaluating encapsulation materials across cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing ambiguity in hypoxia-mediated functional decline.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined encapsulation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying hypoxia-related risks early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of encapsulation strategies based on functional preservation under low oxygen.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and hydrogel fabrication.
- Depends on UV crosslinking infrastructure and fluorescent microscopy capabilities.
- Necessitates standardization of oxygen-controlled culture systems for cross-team comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the hypoxia reporter to primary or stem cell-derived aggregates.
- Practical limitations include signal resolution constraints for subcellular localization and dependency on viral transduction efficiency.
