追踪封装细胞聚集体内的缺氧信号

本实验的总体目标是监测在PEG包封的细胞聚集体中，细胞对缺氧的反应。第一步，将分散的细胞用标记病毒进行感染，然后在摇床中培养以促进聚集体的形成。接下来，对线性PEG进行功能化修饰，并纯化PEG二聚体（PEG DM rimer）。

然后将细胞聚集体包埋于PEG DM水凝胶中。最后，在不同氧浓度条件下培养这些水凝胶，并通过荧光信号监测缺氧标志物。最终，可通过简单的荧光显微镜观察到存活的包埋细胞聚集体内缺氧诱导因子活性的位置和范围。

该方法有助于回答细胞封装和基于细胞的治疗递送领域中的一些关键问题，例如，缺氧在三维培养体系中的哪些位置发生，以及它如何影响细胞的存活与功能？该技术的影响延伸至再生医学策略及激素缺乏症（如因聚集体和封装组织中缺氧所导致的胰岛素缺乏症）的治疗。已有研究表明，缺氧诱导因子1的活性与β细胞胰岛素分泌显著降低相关，这促使研究人员尝试将原代胰岛解离并重组成类胰岛结构。

聚集体的直径减小。我们的标记物可在任何松散包封材料内的细胞水平上，通过聚集体指示缺氧诱导因子的活性。选择聚乙二醇（PEG）作为包囊材料，是由于其具有优良的传质特性、良好的细胞相容性，以及易于进行功能化修饰。

在40毫升玻璃小瓶中称取两克聚乙二醇（PEG），加入约308微升甲基丙烯酸酐，用硬塑料盖 loosely 盖紧小瓶。将小瓶放入普通家用微波炉中，高火加热两分钟。随后，佩戴耐热手套，充分涡旋混匀小瓶内容物，再将溶液放入微波炉中高火加热额外五分钟。

短暂冷却至可安全操作后，在旋转小瓶的同时打开瓶盖。缓慢加入二氯甲烷，必要时涡旋混匀，直至溶液呈现澄清均一状态。随后，将溶液逐滴加入200毫升搅拌下的冷乙醚中，使PEG dm沉淀析出。

然后通过真空过滤收集 PEG DM，并使其干燥。待 PEG DM 干燥后，将其溶于约 100 至 150 毫升去离子水中。随后将溶液装入截留分子量为 1000 道尔顿的透析袋中，对去离子水透析五天。

将溶液分装至适当的容器中，在负80摄氏度下冷冻过夜。然后将溶液冻干四天，以获得纯净的白色PEG DM粉末，用于从经处理的培养瓶表面释放细胞。首先，吸除培养基，用37摄氏度的无钙、无镁HBSS缓冲液冲洗细胞，再吸除HBSS缓冲液。

加入2毫升37摄氏度的胰蛋白酶和EDTA溶液，将细胞在37摄氏度孵育3分钟。然后用力轻敲培养瓶侧面以使细胞脱落，向培养瓶中加入8毫升37摄氏度的培养基，并剧烈吹打细胞悬液上下混合，注意避免产生气泡。

将细胞悬液转移至无菌的15毫升离心管后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要感染的细胞总数。加入适量的细胞悬液，使每孔含有400,000个细胞，接种于6孔悬浮培养板中。将每孔待感染的细胞悬液各50微升加入1.8毫升微量离心管中。随后，小心地将适量的病毒悬液加入已准备好的HBSS中。

然后向每个孔中加入适当体积的稀释病毒，以达到所需的感染复数（MOI），再向每孔中加入培养基，使总体积达到1.7毫升。最后，将培养板放入培养箱内的旋转摇床上，将摇床调至低速档（约100 RPM），使培养基轻柔地在孔内流动，让细胞聚集24至36小时。首先，剪下一毫升塑料注射器的锥形尖端，并将其开口端朝上放置于支架中，以形成用于制备水凝胶的容器。

接下来，将20微升光敏性PEG DM溶液用移液器加入注射器开口端的柱塞上，确保液体体积覆盖整个柱塞表面。以微小幅度调节柱塞，使液体表面保持平整。然后将移液器放回支架中，并将支架置于紫外灯下，照射约八分钟，以完成水凝胶的交联。

在此期间，用移液器吸取含有所需数量细胞和细胞团的液体，转移至1.8毫升微量离心管中。盖上管盖，然后在130 ×g 条件下离心5分钟，使细胞和细胞团沉淀。随后使用微量移液器小心吸除上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。

当移液头接近沉淀时，使用更精细的10微升移液枪头，将细胞聚集体均匀分散到凝胶前体溶液中，同时确保其完全被包埋。这是该实验步骤中最关键的部分。操作此步骤时，需小心轻柔地重悬并转移沉淀。

现在，用 20 微升的光敏性 PEG DM 溶液轻轻重悬细胞沉淀。使用宽口移液器吸头，将细胞悬液加入位于交联水凝胶部分上方的注射器中，再将注射器暴露于额外八分钟的紫外光下，以完成水凝胶的构建。完成后，细胞应完全包埋于圆柱形水凝胶内部。

最后，向24孔板的一个孔中加入1毫升HBSS，向另一个孔中加入1毫升培养基。然后将水凝胶从注射器中推出，放入HBSS中短暂清洗凝胶。将凝胶转移至含有培养基的孔中，并在所需条件下培养。

在培养过程中的任意时间点，均可使用荧光显微镜对细胞进行成像，以追踪缺氧信号启动的情况。将24孔板放置于显微镜载物台上，使含有水凝胶的孔位于物镜正下方居中位置。该信号具有足够的特异性，可用于识别单个信号转导细胞，但分辨率可能不足以确定细胞内信号的精确定位。在发生信号转导的细胞中，信号通常均匀分布于整个细胞质中。

该图展示了在凝胶腔室中被 PEG 水凝胶包封的 minx 聚集体的代表性示例。聚集体应完全包埋于基质中，并均匀分布，以利于营养物质的运输，如图所示。请注意，交联后的凝胶整体呈固态，并保持了反应所用容器的形状。

本图展示了在 PEG DM 水凝胶中聚集的 min six 细胞内典型的荧光缺氧信号，这些细胞被包封后置于 20% 氧气条件下孵育 44 小时。左侧所示细胞未显示缺氧信号，而被包封后在 2% 氧气条件下孵育 44 小时的细胞（如右侧所示）则呈现出明显且普遍的缺氧信号。该缺氧信号也可在其他细胞类型中进行追踪。

该图展示了包封的间充质干细胞聚集体中缺氧信号的代表性结果。如最左侧图像所示，在2%氧气条件下培养12小时后，荧光信号不可见；如中间图像所示，在2%氧气条件下培养24小时后，荧光信号变得更加明显；最后，如右侧图像所示，在按照本方案处理后，于2%氧气条件下培养96小时，荧光信号高度表达。

其他方法，如ELISA、分泌蛋白分析和细胞活力检测，也可用于关联缺氧信号与细胞表型。随着该技术的发展，其有望为组织工程和基于细胞的治疗递送领域的研究人员探索细胞在支架材料和包封材料内的存活功能及分化提供新的途径。