三维集体细胞侵袭的建模与成像

该实验系统旨在表征特定蛋白质对侵袭过程的贡献。首先使用目的荧光蛋白对细胞进行逆转录病毒感染。同时在Transwell小室中制备Matrigel蛋白的三维基质，并将细胞悬液稀释至适当浓度。

利用Matrigel transwell系统，通过测试药物或处理条件检测细胞对趋化因子的跨膜迁移反应，并进一步采用共聚焦显微镜对细胞侵袭过程进行可视化和分析。最终，该方法可确定细胞侵入三维蛋白基质的程度和模式。与传统的Transwell侵袭实验等现有方法相比，该技术的优势在于能够同时提供细胞侵入三维蛋白基质的定量和定性数据。

我的合作者 Diane Creighton 现在将演示该方法：在含有 10% FBS 的 DMEM 中培养逆转录病毒包装细胞 48 小时。根据制造商的说明，用逆转录病毒 DNA 转染细胞。孵育 24 小时后，用培养基冲洗孔板两次，然后每孔加入 1.5 毫升含 10% FBS 的 DMEM，继续孵育 48 小时以收集包装好的逆转录病毒。

将组织培养基转移至两毫升微量离心管中，离心以沉淀任何细胞，并将上清液收集到干净的试管中。将该逆转录病毒原液于-80摄氏度保存。现在对逆转录病毒感染的细胞，吸去过夜培养的培养基，加入一毫升含有polybrene的逆转录病毒原液。

孵育六小时后，向孔中加入2毫升10%F-B-S-D-M-E-M，并将培养板置于37摄氏度的培养箱中。过夜后更换培养基，24小时后加入适当的筛选培养基，待细胞汇合后收获细胞，并以未转导的细胞作为对照，根据荧光进行分选。收集荧光强度高于未转导细胞的细胞，并将等份样品在-80摄氏度冷冻保存以备后续使用。

该方法依赖荧光蛋白的表达进行可视化，可揭示单个细胞的贡献。将完整的基质胶在冰上融化，然后用预冷的 PBS 等体积稀释。现在将未包被的 transwell 小室插入 24 孔细胞培养板中。

然后小心地将100微升稀释的基质胶移液至各孔中，并在37摄氏度下使其凝固。同时，用正常生长培养基制备荧光标记的细胞悬液。当基质胶完全凝固后，将Transwell小室倒置，并向滤膜朝下的底面加入100微升细胞悬液。

用24孔细胞培养板的底部轻轻覆盖Transwell，使其与每滴细胞悬液接触。将培养板倒置孵育4小时，以使细胞贴壁。随后将培养板翻转至正常位置，通过将每个Transwell浸入1毫升无血清培养基中两次，进行洗涤。

然后将Transwell置于另一个含有药物或处理试剂的孔中。用移液器轻轻将100微升含有趋化因子的培养基加入Transwell中，覆盖已凝固的Matrigel与PBS混合物。在37°C、5%二氧化碳条件下孵育3至5天，以观察非荧光细胞侵入Matrigel的情况。

将Transwell小室转移至新的24孔板中，每孔加入1毫升4微摩尔的钙黄绿素AM溶液，覆盖Matrigel凝胶栓，使溶液溢出至侧面，从而实现从顶部和底部染色。在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育1小时。随后通过共聚焦显微镜成像。

这种首次使用的生活方式染色方法可用于观察侵袭模式。将每个transwell转移至新的24孔板中，加入一毫升含4%多聚甲醛和0.2%吐温X-100的溶液，室温孵育半小时。用一毫升PBS洗涤三次后，加入RNAs A作用30分钟，再用PBS洗涤两次，最后以每毫升0.01毫克的浓度进行可视化观察。

将碘化丙啶用 PBS 稀释后，于室温避光孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤三次。在此阶段，经碘化丙啶染色的 transwell 小室可在室温避光条件下保存至少一个月。

第二种细胞染色方法需要固定，但可实现更快速的侵袭程度定量。将transwell小室连同少量残留的PBS置于倒置共聚焦显微镜载物台上，覆盖在大尺寸盖玻片上，使用非浸油20倍物镜，从Matrigel凝胶塞底部开始，每隔10至15微米采集一次光学切片。利用单个光学切片定量侵袭范围。此外，可使用Velocity等适当软件，基于该系列光学切片构建三维结构。细胞使用钙黄绿素AM（calcein AM）染色。

正如预期，从滤膜向上侵袭的细胞数量随距离增加而减少。这种侵袭能力可以被量化。细胞侵袭的三维重建图像可直观展示侵袭模式。

如果细胞通过表达荧光蛋白进行标记，则每种颜色细胞的位置可以在三维重建图像中显示，如此处的侧视图所示。此外，对重建图像进行切片分析有助于揭示分子机制。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用该细胞侵袭实验，获得比标准方法更深入的关于逃逸过程的信息。