Name: 3维建模和成像集体细胞的侵袭 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学习三维基质侵袭实验技术，利用Matrigel和共聚焦显微镜研究肿瘤细胞侵袭机制。该方法可定量定性分析先导细胞与跟随细胞在侵袭过程中的动态作用，为癌症治疗策略提供重要依据。

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本研究的经费来自英国癌症研究基金会（Cancer Research UK）。

1. 使用逆转录病毒对细胞进行荧光蛋白标记
<ol>
	<li>接种逆转录病毒包装细胞（例如 Phoenix) 在 0.25 × 10 处取出6 每孔细胞数，6 孔板 含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养皿</li>
	<li>48小时后，根据试剂说明书使用Effectene将逆转录病毒DNA转染细胞。</li>
	<li>24小时后用培养基清洗孔板两次，然后每孔加入1.5 ml含10% FBS的DMEM。</li>
	<li>48 小时后用移液器吸取组织培养液中的包装病毒，并转移至 2 mL 微量离心管中。</li>
	<li>以1600 rpm离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>将上清液转移至洁净离心管中，于 -80°C.</li>
	<li>待进行逆转录病毒感染的细胞以 1.5 x 105 6 孔板每孔的细胞数及置于湿润培养箱中培养 37°C 过夜。</li>
	<li>第二天，移除细胞中的培养基，并加入 1 ml 病毒储备液，补充 4 μl 每孔加入 polybrene（2 mg/mL）。将培养板放回培养箱中。</li>
	<li>孵育5-6小时后，向每孔加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，并将培养板放回 37°C 过夜孵育。</li>
	<li>第二天，更换培养基，让细胞培养24小时后，加入相应的选择性培养基。</li>
	<li>当细胞达到汇合时（具体时间取决于细胞的生长速率和逆转录病毒转导效率，通常需要4–14天），用胰蛋白酶消化细胞，并以未转导细胞作为对照进行荧光分选，收集荧光信号高于未转导细胞的细胞，合并后分装并冻存于-80 °C80° C 以备将来使用。</li>
</ol>
2. 逆向 Matrigel 侵袭实验
<ol>
	<li>将一份完整的 Matrigel（即含有生长因子的 Matrigel）在冰上缓慢解冻（图 1A）。</li>
	<li>解冻后，用预冷的 PBS 将 Matrigel 按 1:1 比例稀释（在稀释前可将其他添加物以 2 倍浓度加入 PBS 中；图 1B）。为便于 Matrigel 在聚合前的操作，所有塑料耗材（如枪头、离心管等）均应预冷。</li>
	<li>根据需要将多个8微米孔径、6.5毫米直径的未包被Transwell小室插入24孔组织培养板的各孔中，然后小心地用移液器加样 100 μl 将稀释后的Matrigel加入各孔中，于37°C孵育约30分钟 37°C 以固化（图1C）。</li>
	<li>在此期间，准备一种或多种荧光标记的细胞悬液，浓度为 1 至 4 x 105 每毫升细胞数，根据细胞系的不同，从每个预处理条件下获取（例如gsiRNA、药物处理）置于其正常生长培养基中（图1D）。</li>
	<li>当 Matrigel 凝固后，将 Transwell 小室倒置并用移液器吸取 100 μl 将细胞悬液加入滤膜朝上的底面（图1E）。</li>
	<li>用24孔组织培养板的底部轻轻覆盖Transwell，使其与每滴细胞悬液接触（图1F）。</li>
	<li>将培养板倒置孵育4小时，以促进细胞贴壁（图1G）。</li>
	<li>此后，将培养板正置，并通过连续浸入2 × 1 ml无血清培养基中，依次洗涤每个Transwell（图2A）。</li>
	<li>将Transwell小室置于第三个孔中，加入所需的任何药物或处理物（图2B）。</li>
	<li>轻柔地用移液器吹打 100 μl 含10% FBS的DMEM培养基加上趋化因子（e.g. 将25 ng/ml的EGF加入Transwell中置于凝固的Matrigel/PBS混合物上方，盖上盖子，在3-5天内孵育 37°C 含5% CO₂2 （图2C）。</li>
</ol>
3. 染色与可视化
<ol>
	<li>表达荧光蛋白的细胞在共聚焦显微镜观察前可省略以下步骤</li>
	<li>如需对非荧光细胞在Matrigel中侵袭情况进行成像，将Transwell小室转移至新的24孔板中，并在每个Matrigel凝胶块上方加入1 ml浓度为4 μM的Calcein AM染色液，使液体溢出边缘，从而实现上下两面染色。Calcein AM（钙黄素乙酰氧基甲酯）是一种活细胞染料，可将整个细胞染成绿色，无需固定。</li>
	<li>在37°C、5% CO2的湿化环境中孵育1小时，此时细胞已充分染色，可进行共聚焦显微镜成像。</li>
	<li>或者，也可按照下文3.5至3.9所述方法对侵袭Matrigel的非荧光细胞进行固定和染色。</li>
	<li>将每个Transwell小室转移至新的24孔板中，加入1 ml含4% 甲醛/0.2% Triton-X 100的溶液覆盖样品。</li>
	<li>室温孵育0.5小时。</li>
	<li>移除固定液，并用1 ml PBS洗涤3次。</li>
	<li>使用100 μg/ml RNase处理30分钟以去除细胞质RNA，随后用PBS洗涤2次。</li>
	<li>为进行可视化检测，加入用PBS稀释的0.01 mg/ml碘化丙啶（PI），室温避光孵育0.5小时，再用PBS洗涤3次。此时，染色后的Transwell小室可在室温避光条件下保存至少1个月。</li>
	<li>共聚焦显微镜的具体成像方法取决于可用设备资源。使用倒置共聚焦显微镜时，将残留少量PBS的Transwell小室置于大尺寸盖玻片上（确保无气泡），置于非浸液式20倍物镜下，从Matrigel凝胶块底部开始，每隔10–15 μm采集一层光学切片。单个光学切片可用于定量分析侵袭程度（图3A），或通过Volocity等适当软件重建为三维结构（图3B）。</li>
</ol>
4. 典型结果
图3A展示了一个Z系列光学切片的示例。在此实例中，细胞经Calcein AM染色后，可见从滤膜向上侵袭的细胞数量随距离增加而减少。可通过分析每个区间内Calcein AM阳性像素与阴性像素的比值，或采用上述固定/染色方法并计数各位置PI阳性细胞核，来对侵袭程度进行定量分析。Calcein AM染色的一个优势在于，可利用Volocity等软件对细胞侵袭进行三维重建，从而直观展示侵袭模式（图3B）。若细胞通过表达荧光蛋白进行标记，则可在三维重建图像中可视化不同颜色标记细胞的位置，既可从侧面观察（图3C），也可通过在重建图像中进行切片观察（图3D）。
<img alt="色谱分析流程示意图；样品瓶准备、溶剂施加、分离过程。" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 建立反向侵袭实验的步骤示意图。A) Matrigel ECM 在冰上解冻。B) 用含有药物处理（浓度为最终浓度的两倍）的 PBS 以 1:1 比例稀释 Matrigel。C) 将 Transwell 小室放入多孔板中，并将 Matrigel 加入每个小室中。D) 制备所需浓度的细胞悬液。E) 待 Matrigel 凝固后，将多孔板倒置并移除，将细胞接种至 Transwell 小室底部滤膜上。F) 在倒置状态下，小心地将多孔板置于 Transwell 小室上方，使其与细胞悬液接触。G) 允许细胞在滤膜上贴附 4 小时。
<img alt="细胞培养制备示意图；显示移液操作；流程包括液体处理步骤。" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 反向侵袭实验示意图的延续。A) 待细胞贴壁后，将每个Transwell插入无血清培养基中两次，以去除未贴牢的细胞。B) 将洗涤后的Transwell放入最终培养孔中，孔内含有按需添加处理物的培养基。C) 将含有趋化因子（如10%胎牛血清）并按需添加处理物的培养基小心地铺加到Matrigel上。
<img alt="光学切片示意图；通过Matrigel在15 µm间隔进行侵袭分析，荧光成像。" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 反向侵袭实验结果的代表性图像。A) 使用Calcein AM染色的细胞侵袭Matrigel的光学切片，通过共聚焦显微镜以15 μm间隔采集。B) 由共聚焦Z轴序列图像堆栈重建的细胞侵袭三维结构，从侧面观察。转载自参考文献10。C) 表达GFP和RFP标记的细胞侵袭Matrigel的三维重建图像，从侧面观察。D) GFP和RFP标记细胞三维重建结构的光学切片。转载自参考文献10。

<ol><li>Olson, M. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in cancer cell motility.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).</li>
<li>Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+factors+that+sustain+glioma+invasion+and+paracrine+biology+in+the+brain+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).</li>
<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hallmarks+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hallmarks of Cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Croft, D. R., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+conversion+between+rounded+and+elongated+modes+of+cancer+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement.</a> Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).</li>
<li>Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).</li>
<li>Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos-transformation+activates+genes+associated+with+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Fos-transformation activates genes associated with invasion.</a> Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).</li>
<li>Scott, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

Matrigel 侵袭实验传统上是将细胞置于一层细胞外基质蛋白上，通过底部滤膜的趋化因子诱导细胞迁移并穿过滤膜。侵袭能力的评分依据是计数滤膜下侧的细胞数量。尽管在实际操作中，这种方法与上述“反向”侵袭实验差异不大，但通过可视化细胞在 Matrigel 中向上并穿行的过程，可以获得关于侵袭过程的更多信息。例如，除了能够观察不同标记的细胞以分析集体侵袭中的前导细胞与跟随细胞（图 3C 和 3D）外，该方法还允许对细胞进行固定、通透化、染色，进而检测蛋白表达水平或亚细胞分布。该方法的分辨能力受限于表达荧光蛋白细胞的基础信号强度以及成像设备的灵敏度，尤其是在进行两种或更多颜色成像时。将 Matrigel 与染料淬灭型胶原（DQ 胶原）混合（该胶原被大量荧光素标记，荧光信号被淬灭，直到蛋白水解将胶原片段分离，降低局部荧光素浓度，从而恢复荧光）是该方法的另一种多色应用，可实现对侵袭细胞降解细胞外基质（ECM）过程的可视化。使用配备共聚焦成像和环境控制舱的高内涵筛选设备，可将此实验转化为实时的四维（4-D）侵袭分析，并可同时整合其他检测指标，如 ECM 降解。结合自动化技术，还可设计基于细胞的高通量筛选实验，用于筛选新型抗侵袭靶点的化合物文库。</p...

<table><tbody><tr><td>DMEM（Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21969</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺（100倍浓缩液）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25050-032</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>聚凝素（Polybrene）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>6.5 mm Transwell 小室，8.0 &amp;mu;m 孔径</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>完全 Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>钙黄绿素 AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP2MP</td><td></td></tr></tbody></table>

三维集体细胞侵袭的建模与成像

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

癌症恶性程度的一个决定性特征是侵袭和转移 1. 在某些癌症中（例如g胶质瘤 2），向周围健康组织的局部侵袭是导致疾病和死亡的根本原因。对于其他癌症（e.g乳腺、肺 等等），最终导致发病和死亡的是转移过程，即肿瘤细胞从原发性肿瘤病灶脱离，定植于远端部位，并最终导致器官功能衰竭。 3据估计，侵袭和转移导致了90%的癌症死亡病例。 4因此，为了改进诊断和治疗，人们对识别介导侵袭和转移的分子过程及关键蛋白质介质产生了极大的研究兴趣。 5.
癌症科学家面临的一个挑战是开发出能够充分模拟肿瘤侵袭过程的侵袭实验方法 体内 情况以实现准确的疾病建模 6二维细胞迁移实验仅能反映侵袭的某一方面，无法体现细胞外基质（ECM）蛋白重塑这一同样关键的因素。近年来，研究深化了我们对肿瘤细胞侵袭机制的理解，揭示出单个细胞可能以伸长型或圆形模式进行移动。 7此外，人们越来越认识到集体侵袭在癌症扩散中的作用，即细胞以条索状、片状和簇状形式侵袭，尤其在仍保持上皮特征的高度分化肿瘤中更为明显。 8.
我们介绍一种改进的方法9，用于研究候选蛋白在集体侵袭10过程中的作用。具体而言，通过构建分别表达不同荧光蛋白的细胞群体，可在分子水平上解析前导细胞与跟随细胞各自所需的活性及蛋白功能。RNA干扰（RNAi）技术可作为分子工具，用于实验性地拆解单个细胞侵袭以及集体侵袭中不同位置细胞所涉及的生物学过程。在本实验流程中，将不同荧光标记的细胞混合后接种于已预先填充Matrigel细胞外基质蛋白的Transwell小室底部，使其向上穿过滤膜并侵入Matrigel中。通过共聚焦成像获取的z轴层扫图像序列经三维重建后，可实现对集体侵袭细胞链的可视化，并分析荧光标记细胞在前导位置与跟随位置中的分布情况。

肿瘤细胞侵袭三维细胞外基质的模型更能反映真实情况 体内 相比二维运动性实验，该方法能提供更接近真实情况的信息。通过将基质侵袭实验与荧光标记细胞的共聚焦成像相结合，可获得有关侵袭模式以及前导细胞与跟随细胞各自不同作用的详细信息。

癌症恶性程度的一个决定性特征是侵袭和转移1。在某些癌症（如胶质瘤2）中，肿瘤会向周围健康组织局部侵袭……

该实验系统旨在表征特定蛋白质对侵袭过程的贡献。首先使用目的荧光蛋白对细胞进行逆转录病毒感染。同时在Transwell小室中制备Matrigel蛋白的三维基质，并将细胞悬液稀释至适当浓度。利用Matrigel transwell系统，通过测试药物或处理条件检测细胞对趋化因子的跨膜迁移反应，并进一步采用共聚焦显微镜对细胞侵袭过程进行可视化和分析。最终，该方法可确定细胞侵入三维蛋白基质的程度和模式。与传统的Transwell侵袭实验等现有方法相比，该技术的优势在于能够同时提供细胞侵入三维蛋白基质的定量和定性数据。我的合作者 Diane Creighton 现在将演示该方法：在含有 10% FBS 的 DMEM 中培养逆转录病毒包装细胞 48 小时。根据制造商的说明，用逆转录病毒 DNA 转染细胞。孵育 24 小时后，用培养基冲洗孔板两次，然后每孔加入 1.5 毫升含 10% FBS 的 DMEM，继续孵育 48 小时以收集包装好的逆转录病毒。将组织培养基转移至两毫升微量离心管中，离心以沉淀任何细胞，并将上清液收集到干净的试管中。将该逆转录病毒原液于-80摄氏度保存。现在对逆转录病毒感染的细胞，吸去过夜培养的培养基，加入一毫升含有polybrene的逆转录病毒原液。孵育六小时后，向孔中加入2毫升10%F-B-S-D-M-E-M，并将培养板置于37摄氏度的培养箱中。过夜后更换培养基，24小时后加入适当的筛选培养基，待细胞汇合后收获细胞，并以未转导的细胞作为对照，根据荧光进行分选。收集荧光强度高于未转导细胞的细胞，并将等份样品在-80摄氏度冷冻保存以备后续使用。该方法依赖荧光蛋白的表达进行可视化，可揭示单个细胞的贡献。将完整的基质胶在冰上融化，然后用预冷的 PBS 等体积稀释。现在将未包被的 transwell 小室插入 24 孔细胞培养板中。然后小心地将100微升稀释的基质胶移液至各孔中，并在37摄氏度下使其凝固。同时，用正常生长培养基制备荧光标记的细胞悬液。当基质胶完全凝固后，将Transwell小室倒置，并向滤膜朝下的底面加入100微升细胞悬液。用24孔细胞培养板的底部轻轻覆盖Transwell，使其与每滴细胞悬液接触。将培养板倒置孵育4小时，以使细胞贴壁。随后将培养板翻转至正常位置，通过将每个Transwell浸入1毫升无血清培养基中两次，进行洗涤。然后将Transwell置于另一个含有药物或处理试剂的孔中。用移液器轻轻将100微升含有趋化因子的培养基加入Transwell中，覆盖已凝固的Matrigel与PBS混合物。在37°C、5%二氧化碳条件下孵育3至5天，以观察非荧光细胞侵入Matrigel的情况。将Transwell小室转移至新的24孔板中，每孔加入1毫升4微摩尔的钙黄绿素AM溶液，覆盖Matrigel凝胶栓，使溶液溢出至侧面，从而实现从顶部和底部染色

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基于完全人源肿瘤基质的三维球体侵袭实验

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分析三维培养物体外细胞侵袭的替代策略

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