基于蛋白质组学的骨骼肌性别二态性研究

本实验的总体目标是确定骨骼肌蛋白质组谱图中差异的性别特异性。首先，将雄性和雌性小鼠的肱二头肌组织切碎并充分匀浆，以提取大部分蛋白质，从而实现这一目标。接着，将样品加样至等电聚焦凝胶条，蛋白质根据其等电点进行分离，随后进行SDS-PAGE，在第二维中按分子大小进行分离。经过染色和凝胶成像后，比较雄性和雌性肌肉样品的蛋白质组谱图，并切取在两种性别间丰度存在显著差异的蛋白点。

最后，将凝胶块中的蛋白质用胰蛋白酶消化。将产生的肽段从凝胶中提取出来，并进行纳米液相色谱-质谱分析以实现鉴定。最终，可通过二维凝胶电泳结合质谱蛋白质组学方法，获得两种或多种实验条件下蛋白质差异表达的结果。

尽管该方法可用于研究肌肉的性别特异性，也可应用于处于不同生理状态的其他细胞、组织、器官或体液。本实验操作将由史密斯学院蛋白质组学中心技术主任 Dr.Kalina Diva 演示。在分离、清洗并切碎小鼠骨骼肌后，按每克组织加入 45 µL 提取缓冲液的比例进行操作，该缓冲液及其他所有缓冲液配方请参阅书面实验方案。使用电动研磨器，在 4 °C 条件下，每次研磨 15 秒，共研磨 7 次，每次研磨之间需在冰上冷却 2 分钟。

在4°C条件下，以15,800 ×g离心样品30分钟。保留上清液并测量其体积。弃去沉淀，并加入三倍体积的冰以沉淀蛋白质。

每体积上清液加入冷的试剂级丙酮。涡旋振荡试管15秒，然后在15,800 G下离心10秒以形成沉淀。弃去上清液，用电动研磨棒和聚丙烯搅拌棒将沉淀重悬于提取缓冲液中，再加入三倍体积的丙酮，再次沉淀蛋白质。

重悬沉淀并加入裂解缓冲液后，测定蛋白浓度，或在零下20摄氏度保存样品。为进行蛋白质等电聚焦，从零下20摄氏度冰箱中取出一条预制IPG胶条，置于室温平衡10至15分钟。涡旋混匀样品，用移液器将600至800微克蛋白沿样品水化盘中通道的后缘呈直线加入，两端各留出约1厘米空间。

用镊子剥去 IPG 胶条的塑料覆盖膜，操作时仅触碰胶条两端，避免与凝胶部分接触。注意胶条上标记的正极端，并将其置于托盘的左侧。将 IPG 胶条的凝胶面朝下放置在样品上方。

避免在下方截留气泡。静置使其水化一小时。在条带上覆盖 2.5 毫升矿物油。

用盖子盖住托盘，并使其在室温下过夜复水。次日于室温条件下，在聚焦胶条通道两端各放置一条滤纸芯，并用 10 µL 去离子水润湿每条纸芯。取下 IPG 胶条，垂直持握约 10 秒钟。

为去除油分，用无尘纸轻轻擦拭塑料背衬。将IPG胶条点样面朝下放置，碱性端置于左侧。在聚焦盘中，用2.5毫升矿物油覆盖胶条。

将胶条放入 Protean IEF 电泳槽中，设置三步程序，细胞默认温度为 20 摄氏度，每根胶条最大电流为 50 微安，无需再水化时间。程序完成后，将胶条正面朝上转移至 11 厘米的平衡槽中。向槽道中加入 4 毫升还原缓冲液，在轻微振荡条件下平衡 10 分钟。

移除还原缓冲液，向通道中加入四毫升烷基化缓冲液，振荡平衡额外10分钟。将IPG胶条在1×SDS电泳缓冲液中短暂浸洗。接着，将胶面朝上放置于11厘米Criterion的背板上。

预先制备10.5%至14%的Tris-HCl-SDS聚丙烯酰胺凝胶，并轻轻推入，使其与SDS凝胶完全接触。确保两层凝胶之间无气泡残留。在IPG胶条上覆盖1毫升熔化的琼脂糖溶液，静置5分钟使其凝固。

然后将5 µL蛋白标记物加入单个加样孔中。在室温或4 °C条件下，用SDS缓冲液以200 V电压电泳。当染料前沿迁移至凝胶底部时，将凝胶从塑料模具中取出，并在考马斯亮蓝溶液中轻轻振荡过夜染色。

将凝胶在滞留液一中振荡处理两次，每次三小时，随后在滞留液二中过夜滞留。将凝胶储存于7%乙酸溶液中以备分析。成像后，对不同凝胶间的蛋白点模式进行比较分析，切下感兴趣的蛋白点，向凝胶小块中加入200 µL滞留液，涡旋混匀，并在室温下振荡孵育30分钟。

然后小心移除并弃去溶液，重复此步骤。向含有胶塞的离心管中加入 30 µL 新鲜配制的还原缓冲液，在 60 °C 下孵育 10 分钟。让样品冷却。

然后移除并弃去缓冲液。加入30 µL烷基化缓冲液，将样品在室温下避光孵育1小时，随后移除并弃去烷基化缓冲液。通过向每管中加入200 µL脱色溶液洗涤凝胶颗粒，将样品在37°C孵育15分钟。

移除并弃去固定溶液，重复洗涤。接着，向凝胶块中加入 50 µL 乙腈，室温孵育 10 分钟，使其收缩并干燥。然后小心吸去乙腈，并重复处理凝胶小块。

应呈现白色且体积较小。将凝胶小块置于浓缩仪中干燥10分钟。加入10 µL活化的胰蛋白酶溶液，使凝胶小块溶胀。

室温孵育15分钟。向各管中加入25 µL消化缓冲液。将样品在室温下振荡孵育过夜，超声处理10分钟，离心后将上清液转移至新管中。

为进一步提取肽段，向凝胶块中加入10 µL 0.1%甲酸，于室温下振荡孵育5分钟，随后对样品进行超声处理10分钟。收集上清液，并与之前保存的上清液合并。随后可对蛋白质进行脱盐处理，并制备用于高效液相色谱联用质谱分析。从未运动的雄性和雌性小鼠骨骼肌中提取蛋白质，并分离成二维图谱。

利用高分辨率数字成像技术对肌肉比较蛋白质组的第一层次进行可视化后，每个样本中可检测到约800个蛋白质点，如图所示。以雄性蛋白质组图谱作为基准，可以明显看出雌性中大量蛋白质点的丰度发生了变化：在雌性中丰度增加达到或超过两倍的蛋白质点以红色圆圈标出，而丰度减少达到或超过两倍的则以蓝色圆圈标出。对于变化超过两倍且在统计学上显著（n = 5只小鼠）的蛋白质点，其身份通过液相色谱串联质谱法进行氨基酸序列分析予以确定。

在此图中，x 轴代表雌性小鼠运动前状态，Y 轴代表单次运动后即刻（零小时）时间点的分组。结果显示，雌性小鼠在糖类能量代谢、相关酶类以及肌酸激酶同工酶形式方面均显著降低，提示肌肉中存在不同的能量供应系统。人类和动物在静息状态及运动后均表现出较高的血清肌酸激酶（CK）水平，但血清 CK 水平并不一定与肌原纤维的损伤程度相关。

肌酸激酶（CK）在雌雄小鼠肱二头肌中细胞丰度的性别二态性是一种新发现，可能解释生理状态下血清CK水平的差异。在完成本实验步骤后，可进一步采用定量免疫印迹等其他方法验证实验结果。观看本视频后，我们应能够充分掌握如何制备和分离样品以进行差异蛋白质组分析。