Name: 巴西田间放生转基因 伊 蚊的大规模生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: 了解利用RIDL系统大规模培育转基因埃及伊蚊雄蚊的技术方法，包括人工膜喂血、性别分选和质量控制等关键步骤，为种群抑制策略提供高质量雄蚊生产方案。

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我们感谢巴西莫什梅德生物工厂、圣保罗州研究支持基金会（FAPESP）以及国家科学技术发展委员会（CNPq）提供的资金支持。&#160;我们还要感谢以下人员提供的帮助：Miriam dos Santos、Gildeane Silva、Gessilane dos Santos、Fabio Gonçalves、John Paul Oliveira、Luiza Garziera、José Carlos Valença。

昆虫饲养室要求
1. 概述
<ol>
	<li>大规模饲养包含多个阶段，每个阶段均在大规模饲养单元的不同区域进行。图1展示了饲养的主要阶段及其在大规模饲养设施中的位置。</li>
</ol>
2. 昆虫饲养室的生物安全考虑
<ol>
	<li>该项目已获得圣保罗大学动物伦理委员会的批准。&#160;巴西及所有必要的许可和批准均已获得。</li>
	<li>The RIDL&#160;系统采用条件性致死机制；膳食补充剂（四环素）可阻止RIDL的表达&#160;系统可实现昆虫的大规模饲养；在无四环素的条件下，蚊子将死亡。四环素在蚊子的繁殖场所中并不存在。 埃及伊蚊 在野外，逃逸个体产生的任何后代都无法存活。 &#160;这比使用通过其他方法灭活的野生型（WT）昆虫提供了更高的安全性即 辐射）。</li>
	<li>使用双门进出，并在昆虫饲养室设置“仅限授权人员进入”标识和防虫纱网。所有窗户应密封，以避免野生型昆虫污染种群，并防止饲养室内昆虫逃逸。</li>
	<li>当地法规和主管部门可能有特定的附加或替代性要求。应在早期阶段联系相关主管部门以获取信息或指导，并在建立RIDL之前取得所有必要的许可和批准。&#160;昆虫饲养室中的菌株</li>
	<li>昆虫大规模饲养室应仅用于RIDL&#160;饲养。不得存在其他品系或昆虫。这是为了避免对RIDL造成污染&#160;菌株及病原体污染可能影响雄性个体的适应性和存活率，从而降低释放雄性个体的生产力和有效性。</li>
</ol>
3. 昆虫饲养室设计
<ol>
	<li>图2展示了巴西Biofábrica Moscamed昆虫饲养室的平面布局。</li>
	<li>所有房间的温度保持在26 °C ± 2 °C，相对湿度约为70–80%，并采用荧光灯管提供12:12小时的光暗循环。</li>
	<li>该平面图可根据具体空间需求进行调整，例如，释放规模将决定整体面积。但卵的生产、幼虫饲养与分选、质量控制（QC）以及成虫释放应划分为四个独立区域：卵生产种群区、释放代饲养区、质量控制区和成虫释放储存区。</li>
	<li>卵生产种群室（约20 m2）用于为释放代生产卵。</li>
	<li>质量控制区用于开展实验，以检测操作流程及RIDL&#160;品系的适合度，包括&#160;孵化率、蛹数、蛹大小的测定，以及分选和去除雌性效果的评估。此外，还通过偏移测定法检测荧光标记和表型的存在，以评估野生型（WT）污染情况，并测量致死效应。</li>
	<li>释放代饲养室（约36 m2）需具备足够空间用于放置饲养盘以及幼虫和蛹的分选操作。饲养盘置于专门设计的铝制架子上。室内需配备较大的工作台和水槽用于饲养与分选，另需一个大型水槽用于清洗饲养盘和笼具。水槽的废水排放口安装了过滤捕获装置，以防止活体蚊虫通过下水道逃逸。&#160;</li>
	<li>所有用于饲养盘的水均通过排水管排出，排水管中设有带网筛的隔间，可防止任何发育阶段的昆虫逃逸。</li>
	<li>需设置专门区域用于储存待释放的成虫（成虫释放储存区，图2），该区域应配备货架，用于放置释放装置，以便成虫在释放前完成成熟过程。</li>
</ol>
大规模饲养RIDL的生产方法：
卵生产种群用于产生释放代（图1）中成虫所需的卵。这两种饲养方法有许多相似之处，但也存在一些明显差异。两种流程中相同的部分仅在卵生产种群部分进行描述。
卵子生产群体
4. 幼虫生产
雄性不育（OX513A RIDL）品系繁殖群用于为释放代生产纯合的OX513A RIDL&#160;卵8。严格的质量控制可确保所提供的卵具有良好的存活率、适应性以及品系完整性。
<ol>
	<li>孵化的刺激因素是处于低溶解氧水平的水中。为降低水中的氧气含量，将水加热至沸腾，立即取400 ml注入500 ml玻璃瓶（瓶口周长74 mm）中，旋紧瓶盖，室温下静置数小时使其冷却。</li>
	<li>加入1 g&#160;将卵放入装有沸水的罐子中，重新密封并静置一小时。将内容物转移至含有2 L水的托盘中，在昆虫饲养条件下静置过夜。</li>
	<li>将孵化出的幼虫放入已知体积的水中，使用磁力搅拌器和搅拌子充分搅拌，以便取样；但剧烈或长时间搅拌会损伤幼虫，应尽量减少。孵化幼虫的标准用水体积为1 L，但幼虫密度超过300个/mL时难以准确计数，且可能造成伤害。因此，每升水中孵化的虫卵数量不应超过约300,000个。&#160;水。</li>
	<li>通过取三份1 ml的样品，置于吸水海绵上方带有1 cm方格的吸水纸上，以吸收多余的水分，测定孵化率。 &#160;通过观察三个方格内孵化卵的缺失卵盖，统计孵化和未孵化卵的数量。预期孵化率约为80-90%。</li>
	<li>取四份1 ml的等分试样，分别放入四个黑色称量皿中（幼虫为白色，在黑色背景下更易观察），用肉眼计数各皿中存活幼虫的数量；建议使用计数器进行计数。根据每毫升平均幼虫数量，计算每个培养皿所需添加的水量，以获得每皿所需的幼虫数量。</li>
	<li>不同品系和物种的幼虫饲养密度可能存在显著差异。同时，比较RIDL也具有重要意义。&#160;成年雄性体型与野生型雄性相当；理想情况下应接近或大于野生型雄性体型的 RIDL&#160;能够与野生雄性成功竞争的雄性。因此，对于每种 RIDL&#160;幼虫的理想密度需要确定，需在饲养空间限制和生产规模之间进行权衡。我们发现，幼虫密度在0.1–2.5条/毫升范围内较为适宜。 &#160;产量与质量的良好结合；Medici 也对此进行了讨论23.</li>
	<li>将幼虫加入托盘中。在我们的设施中，使用的托盘尺寸约为 53 cm × 37 cm &#160;8厘米（长×宽×高）以及达到生产所需幼虫密度的水量。</li>
	<li>向培养皿中加入四环素储备液（3 mg/ml 水溶液），按1:100稀释，以获得所需的终浓度30 &#181;g/ml</li>
	<li>用薄片状鱼食喂养幼虫（<a href="http://www.sera.de">www.sera.de</a>每日一次，研磨成细粉。 表1 显示了在上述昆虫饲养条件下，按每只幼虫每天毫克数计算的典型饲喂方案。在适宜的分选日前，持续饲喂幼虫。</li>
</ol>
5. 幼虫与蛹以及雌/雄蛹的分选
<ol>
	<li>孵化8天后，将幼虫与蛹分离，以区分幼虫和蛹。随后对蛹进行雄性性别筛选。使用一种称为平板分离器的装置24,25 能够区分幼虫、雄性蛹和雌性蛹。 图3 展示了使用该板式分离器将幼虫与雄性和雌性蛹分离的方法。</li>
	<li>使用底部带网筛的量匙，用500只或更多的蛹进行校准，然后用其设置饲养笼，并估算所产生的雄性和雌性蛹的总数。</li>
	<li>分选的第一天（第8天），大多数蛹为雄性，因此将已分选的幼虫放回托盘，继续饲养至第二天，此时大多数蛹为雌性（图4).</li>
	<li>每天重复上述2.1-2.3步骤中的分选过程，直至所有幼虫化蛹或至工作周结束。</li>
	<li>将1,000只雄性蛹（使用量匙）放入笼中，第9天时向同一笼中加入3,000只雌性蛹（我们使用高30 cm、直径30 cm的PVC管，顶部加装网筛并设有网状开口以便操作；也可使用BugDorm提供的30 cm × 30 cm × 30 cm塑料饲养笼）。</li>
	<li>让成虫交配至少2天，并在湿润的棉球上提供蔗糖溶液（10%） 随意 在吸血前收集卵，持续两周（约两个 gonotrophic 周期），每周进行两次血液饲喂。每笼 3,000 只雌蚊可平均获得约 143,000 枚卵（平均每只雌蚊产卵 48 枚）。若每周需生产 400 万枚卵，则每周需设置约 28 个蚊笼。</li>
</ol>
6. 血液喂养
<ol>
	<li>一种铝板饲喂系统每周为笼具提供两次血液。在铝板（10 cm × 10 cm × 3 mm）的一侧，使用帕拉膜（Parafilm）在表面形成一个血液储存袋图5）。为促进取食，将加热后的豆袋置于饲血板上方以加热血液。豆袋由约250克小麦粒装入布袋制成，在微波炉中加热约10秒。我们用于饲喂的血液取自当地屠宰场；由于这些动物（主要是山羊和绵羊）供人类食用，均经过病原体检测以确保安全。</li>
	<li>雌蚊吸血后第三天，为其提供产卵场所供其产卵。产卵场所为一个圆形塑料容器，内装约 &#188; 用清水浸湿的滤纸覆盖容器内壁。两天后移除产卵位点。为获得最大产卵量，需确保滤纸覆盖容器内所有可用表面，并始终保持湿润。</li>
	<li>移除卵纸并将其置于吸水纸上，在昆虫饲养条件下干燥；卵需要在高湿度（超过70%）环境中至少进行48小时的预处理。&#160;卵产下后，只要保持高湿度，可在昆虫饲养室中存放长达3个月，孵化率仅略有下降。25.</li>
	<li>产卵种群需要具备足够规模，以满足每周释放计划所需的卵量。上述设施在每周设置28个笼具的情况下，可生产约400万枚卵。建议储备足够的卵，以确保至少可维持4周的释放代及产卵种群的供应。</li>
</ol>
释放生成
7. 幼虫生产
释放代的孵化、饲养和分选过程与之前所述的卵产量群体方法相同。然而，生产规模要大得多，因此需要更多的托盘和更多的人力投入。
8. 分选幼虫、雄性蛹和雌性蛹
<ol>
	<li>幼虫、雄性蛹和雌性蛹的分选方法与卵产量实验中所述方法相同。</li>
	<li>在分选出雄性蛹后，释放前必须检查是否存在雌性污染；雌性比例不应超过1%。取三份各500个蛹的样品（三个随机取样的蛹量勺），统计其中雌性蛹的数量。雌性蛹通常体型大于雄性，且可通过生殖瓣形态的差异进行鉴别（图6）27。若发现雌性比例超过1%，应重新分选并再次检查。</li>
	<li>仅使用第8天和第9天的雄性蛹用于释放；其余幼虫和蛹均需进行高压灭菌处理。在巴西，此类废弃物必须按照医疗废物的方式处理，但其他国家的规定可能有所不同。由于质量控制、饲养条件以及大规模操作带来的污染风险较高、质量控制较低等原因，不得将释放代次中的雌性蛹和幼虫用于卵产量种群的维持。</li>
</ol>
释放前成虫储存：将雄虫放入释放装置中，使其羽化并成熟后再进行释放。本方法未涵盖释放装置的具体细节，但我们使用的释放装置容量约为1000只雄虫。释放方法的详细信息（释放装置和释放系统）不在本方法的讨论范围内。

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<li>Bargielowski, I., Alphey, L., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+of+mating+and+insemination+capacity+of+a+genetically+modified+mosquito+Aedes+aegypti+OX513A+compared+to+its+wild+type+counterpart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cost of mating and insemination capacity of a genetically modified mosquito Aedes aegypti OX513A compared to its wild type counterpart.</a> PLoS One. 6 (26086), (2011).</li>
</ol>

作者与Oxitec存在雇佣关系和/或持有Oxitec Ltd.的股权。Oxitec Ltd.与牛津大学拥有与本文主题相关的知识产权。&#160;

RIDL&#160;是一种有效且环境安全的蚊虫控制方法3,29-31。该技术可纳入综合害虫管理计划&#160;，且与大多数现有的控制方法兼容，包括幼虫杀灭剂、孳生地减少和成虫杀灭剂。本方法描述了如何每周生产多达570,000只RIDL&#160;雄性蛹，用于埃及伊蚊（Ae. aegypti）的防控；据我们所知，这是首次报道在此规模上生产转基因蚊子。20世纪60年代和70年代曾为野生型埃及伊蚊（Ae. aegypti）开发过一些可比的生产系统25，但此后尚未有同等规模的生产报道。在巴西，从2011年2月至2012年2月期间共释放了约1100万只雄蚊。所需释放雄蚊的数量取决于多种因素，包括野生种群的规模、释放雄蚊的扩散能力、释放后雄蚊的存活率及其交配竞争力，以及环境条件。&#160; 以往研究表明，RIDL&#160;可使蚊子种群数量减少至少80%9。
在大规模生产中，需要在生产规模和成本与雄蚊质量之间取得平衡。例如，增加幼虫密度可以通过减少所需空间、降低劳动力投入和缩短化蛹时间来提高生产能力32。然而，过高的幼虫密度可能导致雄蚊体型变小、寿命缩短以及交配能力下降32,33。在昆虫不育技术（SIT）项目中，释放雄蚊的质量最终将通过其在野外与雌蚊交配的能力来评估。必须进行广泛的田间评价，以评估其相对于野生型雄蚊的交配竞争能力9,10。这通常使得准确判断哪些因素构成“高质量”雄蚊变得不切实际。然而，在大规模批量饲养过程中，保持生产过程的一致性和质量（在可常规评估的范围内）至关重要。这要求对所有操作流程保持高度警惕和标准化，因为微小的波动也可能产生显著影响。L1幼虫的分装是一个关键步骤，充分说明了这一点。将正确数量的幼虫分配到饲养盘中，对于生产高质量蚊虫至关重要。饲喂方案是针对特定数量的幼虫精确设计的。幼虫数量过少或过多将导致饲喂过度或不足，从而影响幼虫存活率、蛹的大小以及化蛹时间。如果说批量饲养技术存在秘诀，那就是确保生产周期中的每一个微小步骤都能持续、精确地执行，并实施严格的质量控制，正如本文所述。

蚊子可传播多种病原体，导致人类患上多种疾病，而控制这些蚊子数百年来一直是一场持续不断的斗争。基于化学和生物方法的昆虫控制策略虽已取得一些显著成效，但在许多情况下，长期控制效果并不可持续。例如，巴西曾在20世纪50年代成功根除Ae. aegypti，但过去40至50年间该蚊种再次入侵。造成这一现象的原因众多，包括杀虫剂抗性的产生、环境破坏、防控项目&#160;实施不力15-20，以及缺乏充分监测或应对措施导致的快速再入侵。
人们正在寻求新的技术和方法，以期赢得这场对抗蚊虫的战斗。&#160;分子技术的最新进展推动了基于昆虫不育技术（Sterile Insect Technique, SIT）的新型创新蚊虫防控方法的发展1-3。一种名为RIDL&#160;（携带显性致死基因的昆虫释放技术，Release of Insects carrying a Dominant Lethal）4 的防控方法即以SIT为基础，但采用基因手段避免了辐射不育的需要。目前已针对多种害虫物种构建了RIDL&#160;品系，包括Ae. aegypti5-8。一种Ae. aegypti的RIDL&#160;品系已在开曼群岛成功进行了田间试验9,10；目前全球多个国家正在计划或已开展进一步的田间应用。&#160;利用RIDL&#160;压制蚊虫种群需要大量高质量的雄性成虫进行人工繁育3,14。
对于一项SIT项目&#160;通常只释放雄性个体被认为更为理想，因为雌性蚊子会叮咬并传播疾病。此外，释放的不育雄性可能会受到同时释放的雌性干扰，从而降低防控项目的成效&#160;效果。在大规模田间试验中，释放仅含雄性的经辐照地中海实蝇，其效果被证明比雌雄混合释放高出3至5倍。21.
在一种 RIDL 中&#160;大规模繁殖项目中，生产待释放雄性个体需经历多个阶段。 &#160;首先是生产释放代所需的卵图1）。接下来的步骤是将卵培育至蛹期或成虫期，期间需将幼虫与蛹分离，并将雄蛹挑出。 &#160;从雌性蛹中分离。大规模将雄性与雌性分开需要两性在某一特定生活史阶段存在可用于批量分选的差异22。在 埃及伊蚊 （以及其他蚊虫物种）雄性和雌性蛹之间存在显著的大小差异，这一特征可用于性别分离技术。经分选后的 &#160;RIDL&#160;随后在控制项目中释放雄性个体&#160;以蛹或成虫的形式11,12.
以下描述了OX513A品系（一种RIDL）大规模饲养的方法&#160;菌株 埃及伊蚊， 用于释放。所述方法涵盖了生产卵和RIDL所需的技术&#160;用于控制项目的雄性个体。

<table><tbody><tr><td> &lt;p&gt;Vipan Premium&lt;/p&gt; </td><td>Sera GmbH</td><td>&lt;p&gt;190&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html&quot;&gt;http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;四环素&lt;/p&gt; </td><td>Sigma Aldrich</td><td>&lt;p&gt;T7660&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&amp;amp;N4=T7660|SIGMA&amp;&N25=0&amp;amp;QS=ON&amp;&F=SPEC&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&amp;amp;N4=T7660|SIGMA&amp;amp;N25=0&amp;&QS=ON&amp;amp;F=SPEC&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;平板分离器&lt;/p&gt; </td><td>J.W. Hock</td><td>&lt;p&gt;5412&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf&quot;&gt;http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Parafilm M&lt;/p&gt; </td><td>佩基尼塑料包装</td><td>&lt;p&gt;PM-996&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://www.parafilm.com&quot;&gt;www.parafilm.com&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;用于释放代饲养的托盘（53 cm x 38 cm x 8 cm）&lt;/p&gt; </td><td>Pleion</td><td>&lt;p&gt;0757&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1&quot;&gt;http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;荧光显微镜&lt;/p&gt; </td><td>徕卡显微系统</td><td>&lt;p&gt;MZ FLIII&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf&quot;&gt;http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;成虫饲养笼&lt;/p&gt; </td><td>BugDorm</td><td>&lt;p&gt;DP1000&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html&quot;&gt;http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-昆虫饲养笼-30x30x30-厘米-单个装-p-29.html&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td> &lt;p&gt;滤纸&lt;/p&gt; </td><td>CELAB</td><td>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;&lt;a href=&quot;http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html&quot;&gt;http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html&lt;/a&gt;&lt;/p&gt; </td></tr></tbody></table>

大规模生产用于巴西野外释放的基因改造埃及伊蚊（aedes aegypti）

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

为了战胜蚊虫，人们正在不断寻求新的技术和方法。近年来分子技术的进步催生了基于“昆虫不育技术”（SIT）的新型创新蚊虫控制方法1-3。其中一种名为RIDL&#160;（携带显性致死基因的昆虫释放技术）4的控制方法即以SIT为基础，但采用基因手段避免了辐射灭菌的需要5-8。携带RIDL&#160;基因的埃及伊蚊（Ae. aegypti）菌株已在开曼群岛的大规模实地试验中取得成功9,10；目前全球多个国家正在计划或已开展进一步的实地应用。
昆虫的大规模饲养已在多个物种中建立，饲养规模可达每周数十亿只。然而，在蚊虫中，饲养通常在较小规模下进行，大多数大规模饲养工作是在20世纪70年代和80年代完成的。对于RIDL&#160;项目，希望尽可能减少释放雌性蚊虫，因为它们会叮咬并传播疾病。在大规模饲养项目&#160;中，生产待释放雄蚊包括多个阶段：产卵、将卵饲养至化蛹，然后在释放前将雄蚊与雌蚊分离开。这些雄蚊随后用于RIDL&#160;防控项目&#160;，以蛹或成虫形式释放11,12。
使用 RIDL 技术抑制蚊子种群&#160;需要饲养大量高质量的成年雄性个体13,14. 以下描述了OX513A（一种RIDL）大规模饲养的方法&#160;菌株 埃及伊蚊 8, 用于释放及生产卵和大量饲养RIDL所需的技术&#160;用于控制项目的雄性个体。

预期的生产期化蛹结果如图4所示。雄性首先化蛹，化蛹高峰出现在孵化后第8天，雌性化蛹高峰则出现在第9天。测量该化蛹曲线对于确定雄性和雌性分选的最佳时间至关重要。
超过6个月对雌雄蛹进行分选的结果显示，雌性污染率平均为0.02%（图5；标准误SEM = 0.004%）。该污染率意味着在一个月的释放过程中仅释放了约400只雌蚊（共释放约两百万只雄蚊）。目前每周产卵量为400万枚，其中350万枚用于孵化以维持种群繁殖和生产，其余保存作为备用。约11%的卵用于建立产卵种群，其余用于释放代的生产。卵的平均孵化率为87.3%（SEM = 0.5%），从L1幼虫到雄蛹的平均产出率为29.5%（SEM = 1.2）。每周培育两百万只幼虫用于释放代种群，可产生约57.1万只雄蛹（SEM = 1.4万）。蛹期及成虫在羽化和释放过程中的平均死亡率为5%，因此每周可释放约54.3万只成年雄蚊（SEM = 1.3万）。预计通过进一步优化以减少浪费和储存损失，当前每周400万枚卵的生产能力可降低至约300万枚/周。整个生产过程共需6名工作人员，其中4人负责释放代的生产，另外2人负责卵种群的维护。

质量控制

质量控制对于维持成虫质量、提高饲养效率、节约人力和降低成本至关重要。

转基因表型调控
为了验证RIDL基因的表达，需进行两个对照实验：首先检测荧光标记的表达，其次检测在无四环素条件下RIDL致死性状的表达。所有幼虫均应表达荧光标记。为检查荧光标记是否按预期表达，使用配备DsRed2滤光片（Texas Red）的Leica MZFLIII体视显微镜检查2,000头一龄幼虫，以确定是否存在不发荧光的个体。在无四环素的情况下，RIDL基因会表达，预期有3-4%的个体可存活至成虫8。为验证此结果，每个释放批次额外设置一个不含四环素的饲养盘。与常规饲养的唯一区别是在第6天起将食物量减少2/3，因为死亡幼虫导致的食物残留积累可能引起过度的细菌生长。

饲养对照
从释放代中随机选取四个托盘，分别进行分拣和计数。每天记录每个托盘中雄性和雌性蛹的数量（图4）。若雄性和雌性数量与预期值存在偏差，则表明可能存在影响生产效率和/或适应性的潜在问题，可通过与卵群数据进行比较，以帮助确定问题来源。

蛹的测量
蛹的大小已被证明与成虫大小相关28。作为成虫大小的质量控制指标，需从释放代中每批分选当日至少测量30只雄性蛹的头胸部宽度；对于产卵种群，则还需测量雌性蛹。释放雄虫的平均头胸部宽度为1.05 mm（标准误SEM 0.005），产卵种群的雄性和雌性平均头胸部宽度分别为1.04 mm（SEM = 0.006）和1.29 mm（SEM = 0.006）；在白纹伊蚊（Ae. albopictus）的大规模饲养中也获得了类似结果24。
<img alt="卵的生产和雄性释放过程；图示显示了生命周期和大规模饲养策略。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 用于RIDL/SIT项目的蚊子大规模饲养各阶段。 卵生产种群具有高度的质量控制，以确保提供给释放代的卵的质量。卵在释放种群中培育至蛹阶段，随后将雄性与雌性分离。成年雄性个体则用于RIDL防控项目。
<img alt="显示工作区区域、货架、水槽、推车、冰箱和出入口的实验室工作流程图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于生产释放计划中 RIDL 雄性蚊虫的饲养设施示意图。 高质量的卵在卵生产种群室中持续产生，随后在释放代次室中培育至蛹阶段。幼虫和蛹被分离后，蛹通过性别分选获得雄性个体。雄性个体随后被放入释放装置中，并在成虫储存与释放室中发育为成虫，以备释放。
<img alt="使用电泳法进行蚊子性别分离实验；带标注装置的分步示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 
图3. 使用平板分离器分离幼虫、雄性蛹和雌性蛹26。 平板分离器利用幼虫、雄性蛹和雌性蛹之间的大小差异，对这三种不同的发育阶段进行分选；通常幼虫体型小于雄性蛹，而雄性蛹又小于雌性蛹。该装置由两块玻璃板组成；其中一块固定在倾斜的金属框架上，另一块置于第一块玻璃板之上，并可通过四个调节螺钉相对于下层板移动（A）。通过调节这四个螺钉，可使外层玻璃板与后板形成一定角度，从而在两板之间形成一个向下逐渐变窄的楔形空间。将幼虫和蛹倒入两块玻璃板之间（B），并用软管轻轻冲洗（C）。通过调节玻璃板的角度，可实现幼虫、雄性蛹和雌性蛹的分离（D）。在持续冲洗的同时逐步增大玻璃板的倾斜角度，可使幼虫首先被冲出（进入筛网），随后是雄性蛹，最后是雌性蛹。
<img alt="按孵化后天数统计的雄性和雌性化蛹率图表；发育生物学分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 4"> 
图 4. 大规模饲养的RIDL Ae. aegypti 的化蛹曲线。 该图表显示了在23周的观察期内，大规模饲养的RIDL雄性和雌性蛹的平均化蛹百分比，每周回收约135,000个蛹。误差线 = 平均值的标准误，n = 23。在首次收集（第8天）时，我们在5天内从托盘中回收的全部蛹中，平均获得59%的雄性和30%的雌性蛹。
<img alt="柱状图显示2012年12月至2012年5月期间雌性污染百分比呈下降趋势。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图5"> 
图5. 分选雄性蛹的平均雌性污染情况。 该图表显示了在孵化后第8天进行雄性分选过程中，连续六个月每月平均雌性污染百分比的变化情况。
<img alt="使用不同基底的材料测试过程；实验设备分析的实验室设置。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig6.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图6"> 
图6. 铝板式血液饲喂系统。 该铝板（B）表面覆盖一层帕拉膜（Parafilm）（A），将血液用移液器注入膜下形成的小袋中，然后密封（D）。将铝板置于笼具上方，并在其顶部放置加热过的豆袋（C）进行加热（E）。
<img alt="Microscope image of insect larvae showing dorsal and ventral views with scale for size comparison." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579fig7.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 区分雄性和雌性 埃及伊蚊 蛹  埃及伊蚊 蛹的性别可根据生殖突形状的差异进行可靠区分（位于蛹腹部末端桨状结构下方的腹节处）。此外，雄性个体通常比雌性个体小。
<img alt="幼虫摄食数据图表；11天内每只幼虫每日食物量（毫克）；研究分析" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3579/3579table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3579/3579table1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="表 1"> 
表 1. Ae. aegypti RIDL 幼虫的一般饲喂方案（每只幼虫每日摄食量，单位：mg）。 实际所需食物总量可通过将本表数值乘以每盘幼虫总数计算得出。

为了利用RIDL®（携带显性致死基因昆虫释放）系统实现对埃及伊蚊（Aedes aegypti）的种群压制，需要大量释放雄性蚊子。这要求采用大规模饲养技术和设备，以建立可靠的系统，获得最大数量的高质量雄性蚊子。

大规模生产用于巴西野外释放的基因改造埃及伊蚊（Aedes aegypti）

研究人员正在积极探索新的技术和方法，以期在抗击蚊虫的斗争中取得突破。分子技术领域的最新进展已推动了……

通过使用携带可导致其后代死亡的基因修饰的昆虫，可以实现对埃及伊蚊的控制。当释放经过修饰的雄性蚊虫后，它们会与野生雌性交配，而这些交配所产生的雌性后代将无法存活。通过持续释放这种基因改造的不育雄性，即可实现对蚊群数量的控制。通过在食物中添加解毒剂，可以控制致死基因的表达，从而使携带该基因修饰的昆虫得以存活。为实现对埃及伊蚊种群的抑制，需释放大量经过基因改造的雄性蚊子。这需要采用大规模饲养技术，以获得数量最多且质量与适应性尽可能高的雄性蚊子。OX513A的大规模饲养可分为三个主要环节：卵的生产、雄性个体的培育，以及释放前雄性的羽化与成熟。这是巴西Moscamed用于生产OX513A雄性蚊子的后端设施示意图，在卵生产种群室中持续生产高质量的卵。这些卵随后在雄性生产区培育至化蛹阶段，之后对蛹进行性别分选。对于雄性个体，设有专门的区域进行质量控制工作。随后将雄性放入释放装置中，使其羽化并发育成熟后再进行释放。本视频中展示的技术适用于卵子生产和雄性个体生产区域。为了获得用于雄性个体生产的卵子，我们采用来自当地屠宰场动物血液的人工膜饲喂方法。该过程所需的材料包括生物膜和一个约10平方厘米、具有凸起纹路的Anin板。一侧放置一些血液和一个装有约 250 克小麦粒的豆袋。饲喂系统使用帕拉膜作为蚊子吸食血液的膜，以促进其吸血行为。帕拉膜覆盖在人皮肤上。然后小心地拉伸封片，以减小其厚度。接着将铝板的图案面三侧覆盖上封片膜，注意不要损坏封片膜，同时确保边缘密封良好。然后通过铝板和封片膜的开口侧加入血液。将血液填充至饲血器约三分之一处。然后小心地将生物膜密封固定，以防止血液泄漏。接着将饲血板放置在成虫饲养笼的顶部。将豆袋在微波炉中加热10秒，然后放置在平板上以加热血液。如有必要，可每隔10至15分钟重新加热一次豆袋。在喂血后第三天提供FU体位观察位点。卵巢位置位点是位于一个装有半杯水的圆形塑料容器内的滤纸。将该产卵位点放入成虫饲养笼中，使雌虫在其上产卵。两天后，取出卵纸并置于吸水纸上，在昆虫培养条件下干燥。干燥后，将卵从纸上取下。使用画笔轻轻将卵刷入一个大托盘中，注意不要损坏卵。若刷得过重，卵会通过筛网，以去除死亡的昆虫和其他碎屑，从而帮助防止霉菌形成。为了更准确地通过重量计数虫卵，将干燥的虫卵分装成每份一克的等分试样，相当于100,000个虫卵。使用分析天平将虫卵分装至小型塑料容器中，可在昆虫培养条件下于这些容器中储存长达六周。孵化虫卵时，将煮沸的水加入容器中，盖紧盖子并使其冷却。此过程可降低水中的氧气含量，从而诱导虫卵孵化。向容器中加入1克虫卵，然后重新密封盖子。将罐内物质转移至含有两升水的托盘中，持续一小时，并过夜放置。在昆虫培养条件下进行。孵化后的第二天，通过200目不锈钢筛网将幼虫从托盘中分离出来。筛网孔径约为0.075毫米。然后将幼虫放入一个2升的烧杯中，再加水至2升刻度。将烧杯置于磁力搅拌器上，并加入一个较大的磁力搅拌子。调节搅拌速度，以充分混匀幼虫为宜，但不宜过快。由于过度搅拌可能造成幼虫损伤，因此应尽量缩短搅拌时间，以最大限度减少损伤，确保质量控制。在将虫卵置于吸水海绵上的白色吸水纸上孵化一小时后，以及次日，分别取三份每份1 mL的样品进行孵化率测定。吸水纸下方设有方格网，用于计数。从三个不同的方格中分别统计已孵化和未孵化的卵的数量。孵化后的卵很容易识别。由于卵的顶部缺少卵盖，孵化率通常在80%到90%之间。根据每毫升的平均幼虫数量，可计算出每盘需要添加的水量。为获得每盘所需的幼虫数量，需取三份各一毫升的等分试样，分别放入不同的培养皿中。再加入 10 至 20 毫升水以分散幼虫，便于计数。使用黑色背景对幼虫进行计数，因为幼虫呈白色，黑色背景有助于提高计数准确性。建议使用计数器、移液器并保持手部稳定以准确记录。将每毫升幼虫的总数、适量的水和幼虫分装到各个杯子中。注意每次均需从烧杯的同一位置取幼虫。随后将幼虫加入已预先加水的培养皿中。培养皿中含有浓度为 30 微克/毫升的解毒剂四环素。培养皿中幼虫的密度需根据深度、表面积以及成虫大小进行优化。我们发现最佳密度为每毫升 1 至 3 条幼虫。我们使用片状鱼粮喂养幼虫。将鱼粮在搅拌机中粉碎。为了获得均匀的细粉，每个生活阶段所需的饲料量略有不同。因此，饮食方案已针对每一天进行了优化，并且每个托盘使用特定的重量以减少劳动量。我们设计并制作了定量勺，可方便高效地分配所需的食物量。雄性果蝇的生殖器板在第7天开始出现，到第8天时，约70%的雄性果蝇已完成交配。雌性比雄性羽化更晚，但在第八天仍有一定比例的雌性存在。雄性蛹的分选在第八天和第九天进行。为了尽可能回收最多的雄性蛹，在分选前需将托盘中的内容物过筛并倒入量杯中，以备分选。分离器利用幼虫与雄性和雌性成虫在形态和大小上的差异进行分离。该仪器由两块平行的玻璃板组成。外层玻璃板可通过四个调节螺丝前后移动。调节螺丝可使外侧板倾斜，从而在两板之间形成向下逐渐变窄的楔形空间。在板式分离器下方放置容器以接住滴下的水。将培养皿中的幼虫和尿液倒入两块玻璃板之间的板式分离器顶部。雌性成虫体型大于雄性成虫，且在分离时位于上层。幼虫呈扁平状，比雄性成虫更纤细，通过加水冲洗并调节角度，可进一步向下分离。通过持续冲洗并调节板片角度，可进一步分离幼虫、雄性成虫和雌性成虫。利用底部调节螺钉，可将幼虫冲洗至容器中。移除装有幼虫的容器，然后将一个新容器放在平板分离器下方。随后可将雄性蛹冲洗至新容器中。注意不要让任何雌性蛹随雄性一同被冲洗过去。移除装有雄性粪便的容器，并更换为新的容器。最后，将雌性PPE冲洗至新鲜容器中。对雄性蛹进行质量控制，以检测是否存在雌性污染。分选后，取三份各500只雄性蛹，于显微镜下计数其中存在的雌性蛹数量。可通过观察生殖瓣形状来区分雌性。雌性生殖瓣比雄性的小得多，且呈圆形。如果雌性比例超过1%，应重新分选该批次并再次检查。分选后的雄性蛹将被分配至释放装置，在田间释放前使其羽化并成熟。连续六个多月对雌雄个体进行分选的结果。蛹的数据显示，雌性污染率平均为0.02%。该污染率仅相当于每月释放400只雌性。该图表显示了为期六个月生产期间的平均雄性和雌性蛹化数据。雄性主要在第8天化蛹，雌性则在第9天。通过拍摄漂浮在水中的蛹并使用希腊尺作为比例尺，测量并比较了蛹的大小。雄性个体的体型 consistently 小于雌性，且大小重叠极少，表明从卵生产设施获得的饲养参数稳定一致。在一个约19平方米的区域内，雄性生产区每周可产生超过400万枚卵。每周平均生产 571,000 只雄性个体。从卵到分选后雄性蛹的生产效率约为 26%。在羽化过程中损失了一部分雄性个体，每周释放的雄性总数平均为 543,000 只。

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