活细胞成像观察在三维基质中迁移并表达荧光标记蛋白的细胞

本演示旨在对三维基质中活细胞内的荧光标记蛋白进行成像。首先，构建表达荧光标记蛋白的稳定细胞系。将这些细胞接种至三维胶原基质中，然后使用共聚焦显微镜采集迁移细胞的时间序列图像。

最终，通过延时成像和荧光蛋白分析，研究结果揭示了迁移细胞内蛋白质的定位与动态行为，实现了在三维环境中实时观察蛋白质的动态变化和定位。该方法为解答细胞迁移领域的基本科学问题提供了一条途径。例如，胞质蛋白如何调控黏着接触？

此外，这些相互作用如何受到特异性抑制剂的影响？在35 mm培养皿中培养细胞，当细胞融合度达到80%至90%时，按照生产商说明书，使用Lipo 2000将目的质粒转染至细胞中。随后将细胞放入培养箱中孵育。

第二天，将细胞分种到两个 P150 培养皿中，过夜培养。补充培养基，加入终浓度为 50 微克/毫升的 G418。在抗生素筛选条件下继续培养两周。

检查培养物中G四18抗性菌落，然后使用倒置荧光显微镜识别并标记GFP阳性菌落。

用 PBS 清洗细胞两次。第二次清洗后，保留一层薄液以防止每个标记的克隆干燥。用无菌棉签尽可能贴近边缘擦拭，并用移液器将 10 微升胰蛋白酶滴加到克隆上。

对每个菌落迅速重复上述操作。然后将培养皿置于37摄氏度下孵育，以使细胞脱落。在显微镜下观察，确认细胞呈圆形。

向每个克隆中加入10 µL胰蛋白酶，用移液器吹打使细胞完全从培养板上脱离。然后将每个克隆的细胞转移至24孔板中的单个孔内进行培养，以扩增稳定克隆。接着，使用标准的蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光方法检测克隆的蛋白表达情况。

扩增选定的细胞系，对玻璃表面进行修饰。底部培养皿可实现最佳的胶原蛋白结合。用移液器将300微升硅烷化溶液滴加到每个直径10毫米开口的P 35培养皿的玻璃部分。

室温孵育1小时。吸除溶液，用滤水洗涤3次，每次10分钟。去除水后，将培养皿置于50 °C的加热板上1.5小时。

将培养皿盖稍错开培养皿放置，以利于干燥。待培养皿干燥并冷却后，用移液器向每个培养皿的玻璃部分加入 300 µL 的 2% 戊二醛溶液。孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。

将培养皿暴露于紫外光下照射一小时，进行灭菌。首先，取100 µL荧光示踪颗粒，通过离心形成沉淀。弃去上清液，将颗粒重悬于500 µL培养基中。

进行五次洗涤，然后将颗粒重悬于30 µL培养基中。接着，用胰蛋白酶消化收获表达GFP的细胞，并将细胞重悬于离心管中，浓度为每毫升200万个细胞。用移液器加入240 µL生长培养基。依次加入12.6 µL 1摩尔HEPES溶液、20 µL过滤水、50 µL细胞悬液和10 µL荧光颗粒。

最后，加入 167 微升牛皮胶原蛋白溶液，充分混匀。然后将 80 微升混合液转移至已硅烷化处理的培养皿的玻璃部分。在 37 摄氏度下孵育 50 分钟，使凝胶聚合。

然后小心加入两毫升培养基。将显微镜培养室平衡至37摄氏度的稳定温度，并更换细胞培养液。为了在微分干涉差（DIC）成像过程中维持中性pH值，将培养皿的顶部更换为带有薄条状对二氯苯的玻璃盖。

用盖子覆盖培养皿侧面，以防止油浸物镜使用时液体蒸发。在物镜位置滴加一滴浸油。将含有胶原凝胶的培养皿置于显微镜载物台上，使培养皿与浸油液体接触。

聚焦样本并寻找需要成像的目标细胞，以尽量减少载物台漂移。让培养皿静置约45分钟。在开始长时间采集前，确定抑制剂添加实验的图像采集参数。

配制含有药物且达到所需工作浓度的完全培养基。更换细胞培养基以维持中性pH值，但不要用封口膜密封。将样品转移至显微镜，并在给药处理的同时开始成像。

暂停图像，捕获并小心取下培养皿盖，注意不要扰动培养皿。吸出培养基，用移液管将含药物的培养基加入培养皿中。然后小心地将培养皿放回原位。

不同的系统中，FRAP 顶部设置各不相同，因此请参考制造商的说明书。首先为活细胞成像设置参数。

进行光漂白时，先在练习用细胞上测试这些参数，以获得足够的激光功率，在不损伤细胞的情况下漂白荧光信号。随后，开始对样品进行图像采集，至少获取五帧图像。

然后对目标区域进行光漂白。持续采集恢复时间内的图像。使用统计分析软件，随时间测量光漂白区域在光漂白前后平均荧光强度的变化。

将恢复曲线拟合到指数方程。从指数拟合曲线中获得半衰期和最终荧光强度的参数。然后通过最终荧光强度与初始荧光强度的比值计算可移动组分的比例。

这些三维活细胞图像显示了表达GFP肌动蛋白的健康上皮细胞。经过四天的培养，这些细胞在三维胶原基质中形成了一个囊肿。部分细胞沿囊肿表面迁移，而另一些细胞则在囊肿内部迁移。

迁移细胞施加的牵引力会导致基质发生形变，通过分析嵌入周围基质中的示踪颗粒的位移，可对这种形变进行研究。此处展示了RO激酶抑制对牵引力的影响。示踪颗粒的运动以不同时相点的最大投影图像显示，每个时间点均采用伪彩着色。

或者，单个示踪粒子的图像以拼接图形式显示，以展示该示踪粒子的运动轨迹。随着时间推移，在分别添加 Y 2 7 6 3 2 之前和之后，该示踪粒子先后靠近并远离迁移细胞的尾缘。FRAP 分析用于追踪表达 GFP-肌动蛋白的细胞在三维基质中迁移的过程，显示典型的光漂白后荧光恢复现象。在优化的激光设置下进行光漂白实验后，目标区域的荧光强度相较于背景水平明显降低，同时保持细胞健康且未受损伤。

该图显示了恢复曲线与指数函数的拟合情况。掌握该技术后，将细胞接种到基质中大约需要一小时。切勿忘记，使用三氨基丙基三甲基可能具有极高危险性。

因此，请采取预防措施，例如在通风橱中操作。同时，在三维基质中处理细胞时，务必保持无菌条件。