活细胞成像的移植细胞在一个三维矩阵表示荧光标记的蛋白质

该演示旨在对 3D 基质中活细胞中带有荧光标记的蛋白质进行成像。首先，生成表达荧光标记蛋白的稳定细胞系。将这些细胞接种到 3D 胶原蛋白基质中，然后使用共聚焦显微镜获取迁移细胞的延时图像。

最终，结果通过延时成像和 FP 分析阐明了迁移细胞内的蛋白质定位和动力学，以 3D 和实时方式观察蛋白质动力学和定位。为解决细胞迁移中的基本问题提供了一种途径。例如，细胞质蛋白如何调节粘附接触？

以及这些触点如何受到特定抑制剂的干扰。在 P 35 培养皿中，按照制造商的说明，使用 Lipo 2000 以 80% 至 90% 的 co flulysis 用感兴趣的质粒转染细胞。然后将细胞放入培养箱中。

第二天，将细胞分成两个 P 1 50 培养皿并孵育过夜。补充培养基，每毫升添加 50 微克 G 4 18。在抗生素选择下继续培养两周。

检查 G 4 个 18 个抗性菌落的培养物。然后使用倒置荧光显微镜。鉴定并标记 GFP 阳性菌落。

用 PBS 洗涤细胞两次。第二次洗涤后，留下一层薄薄的液体，以防止每个标记菌落的细胞干燥。用消毒棉签尽可能靠近边缘擦拭，然后将 10 微升胰蛋白酶移液到菌落上。

对每个菌落迅速重复。然后将板在 37 摄氏度下孵育以进行细胞分离。在显微镜下验证圆形外观。

向每个菌落中加入 10 μL 胰蛋白酶，移液以将细胞从板中完全分离。然后将每个细胞集落转移到 24 孔培养皿培养物的单个孔中，以扩增稳定的集落。接下来，使用标准 western blot 和免疫荧光评估菌落的蛋白质表达。

扩展选定的细胞系玻璃的表面改性。底部培养皿提供最佳的胶原蛋白结合。将 300 微升筒仓溶液移液到每个开口为 10 毫米的 P 35 培养皿的玻璃部分上。

在室温下孵育 1 小时。吸出溶液，用过滤水洗涤 3 次，每次 10 分钟。除去水分，将盘子放在 50 摄氏度的热板上 1.5 小时。

将盘子的顶部稍微放在盘子上，以便干燥。干燥的培养皿冷却后，将 300 微升 2% 戊二醛溶液移液到每个培养皿的玻璃部分。孵育 1 小时，然后用 PB S3 洗涤 1 次，每次 10 分钟。

通过在紫外线下照射 1 小时来对餐具进行消毒。首先通过离心沉淀 100 μL 荧光示踪剂颗粒。弃去液体并将颗粒重悬于 500 微升培养基中。

进行 5 次洗涤，然后将颗粒重悬于 30 微升培养基中。接下来，使用胰蛋白酶收获表达 GFP 的细胞，并将每毫升 200 万个细胞的悬浮液制备到依诺管中移液 240 微升生长培养基。加入 12.6 微升一磨牙堆、20 微升过滤水、50 微升细胞溶液和 10 微升荧光颗粒。

最后，加入 167 微升牛真皮胶原蛋白，一种溶液彻底混合溶液。现在将 80 μL 转移到准备好的筒仓培养皿的玻璃部分。在 37 摄氏度下孵育 50 分钟，使凝胶聚合。

然后小心地加入 2 毫升生长培养基。将显微镜室平衡至 37 摄氏度的稳态温度，补充细胞培养基。为了保持 DIC 成像的中性 pH 值，将培养皿的顶部更换为带有一条薄多开形状的玻璃顶部。

盖住培养皿的侧面，以防止油浸物镜蒸发。将一滴浸液滴在物镜位置。在显微镜载物台上含有培养皿的胶原蛋白凝胶，使培养皿与浸没液接触。

聚焦样品并搜索感兴趣的细胞进行成像，以最大限度地减少载物台漂移。让盘子静置约 45 分钟。在开始长时间捕获之前，请指定抑制剂添加实验的图像采集参数。

用所需工作浓度的药物制备补充培养基。补充细胞培养基以保持中性 pH 值，但不要使用 perfil 密封。将样品转移到显微镜上，并在药物治疗时进行成像。

暂停图像，捕捉并小心地取下盘子顶部，不要打扰盘子。吸出培养基并将含有药物的培养基移液到培养皿中。然后小心地把盘子放回去。

Top frap 设置因系统而异。因此，请查阅制造商的说明。首先设置活细胞成像的参数。

用于光漂白。在练习细胞上测试这些参数，以获得足够的激光功率来光漂白荧光信号而不会损坏细胞。接下来，在至少采集 5 帧的样品上开始图像捕获。

然后对感兴趣的区域进行光漂白。在恢复时间内继续捕获。使用统计分析软件测量光漂白前后光漂白区域的平均荧光强度。

将恢复曲线拟合到指数方程。从指数拟合曲线中获取半衰期和最终强度的参数。然后通过取最终荧光强度与初始荧光强度的比率来计算流动度。

这些 3D 活细胞图像显示了表达 GFP 肌动蛋白的健康上皮细胞。培养 4 天后，这些细胞在 3D 胶原蛋白基质中形成囊肿。一些细胞沿囊肿表面迁移，而另一些细胞则在囊肿内部迁移。

通过嵌入周围基质中的示踪剂颗粒的位移来分析由于迁移细胞施加的牵引力而导致的基质变形。RO 激酶抑制对牵引力的影响如下所示。示踪粒子运动显示为不同时间点的最大投影图像，并且每个时间点都经过伪彩色处理。

或者，单个示踪粒子的图像显示为蒙太奇，以显示示踪粒子的移动。随着时间的推移，该示踪粒子分别在添加 Y 2 7 6 3 2 之前和之后向迁移单元的后缘移动。frap 分析跟踪表达 GFP 肌动蛋白的细胞在三维基质中迁移，表明典型的荧光恢复在优化的激光设置中进行光漂白实验后，与背景水平相比，感兴趣区域的荧光强度明显减弱，同时保持细胞健康和未受损。

此图显示了恢复曲线与指数函数的拟合。掌握后，将细胞接种到基质中可能需要一个小时。不要忘记，使用三氨基丙基三甲基可能非常危险。

因此，请采取预防措施，例如在化学罩中工作。还要记住，在处理 3D 基质中的细胞时，要保持无菌条件。