通过跨物种移植分析神经嵴细胞的迁移与分化

本实验的总体目标是将鹌鹑胚胎的背侧神经管外植体移植到一个发育阶段相匹配的鸡胚胎中，以示踪神经嵴细胞的迁移与命运。首先，撕开宿主鸡胚胎的IGN膜形成一个小孔，以接触到神经管。然后将供体鹌鹑胚胎从其蛋中取出，为后续的外植体切除做准备。

下一步，从宿主胚胎的神经管中切除目标区域。随后，从供体神经管中切除相似区域用于移植。接着，将供体神经管移植到宿主神经管中。

最后，将嵌合胚胎培养至所需发育阶段，以检测到达目标器官的神经嵴来源细胞。最终，可通过免疫荧光显微镜观察供体来源的神经嵴细胞在宿主胚胎内向不同部位的迁移与分化情况。该方法的可视化演示至关重要，因为显微解剖与移植步骤需要极为精细的操作技巧，难以通过文字描述掌握。

首先用温水清洗鸡卵表面的碎屑。将卵水平放置在托盘上，然后用铅笔标记朝上的侧面，以标明胚胎将要定位的区域。对于供体胚胎的X ovo制备，将鹌鹑卵钝端朝上进行孵育。

接下来，将鸡蛋放入38摄氏度的湿润培养箱中，并开启摇摆功能。待鸡蛋完成培养后，用70%乙醇喷洒其顶部进行消毒，然后迅速用无尘纸巾擦拭干净，以避免乙醇通过蛋壳被吸收。将每枚已消毒的鸡蛋放置在独立的蛋托上，蛋托可参考图中带有折叠无尘纸巾的培养皿。随后使用已灭菌的AA镊子，在鸡蛋尖端上方的蛋壳表面轻敲出一个小孔。

使用一个5毫升注射器，并安装一根18.5号的皮下注射针头。然后将针头斜面朝向蛋的尖端，垂直插入蛋壳上的孔中。为避免因负压意外损伤蛋黄，先用70%乙醇按前述方法清洁小孔，再用透明胶带封住小孔。

然后用双A镊子在水平支上表面标记处轻轻敲击出另一个孔，位置接近但不完全在顶端。接着，将弯曲虹膜镊的一侧平行于蛋的方向插入孔中，通过夹紧蛋壳并以环形动作操作，从而去除蛋壳。

在鸡蛋上打破一个直径约两厘米的窗口，移除并丢弃蛋壳碎片。胚胎应呈现为位于蛋黄上方的不透明圆盘状结构。若发现蛋黄表面仅有微小白色斑点或缺乏外胚层，则表明为未受精卵，应予以丢弃。

现在，在佩戴适当的护目镜后，从针头基部开始，将一支26号半规格的皮下注射针在45度角处弯折。将弯折后的针头斜面朝上连接至一支1毫升注射器，吸取稀释的印度墨水。在囊胚边缘以外的位置刺破卵黄膜，并将针头尖端滑入胚胎下方，靠近卵黄表面，但不要插入胚胎层内。

然后注入适量墨水以勾勒出胚胎轮廓，并避免注入气泡。小心抽出针头。现在使用体视显微镜和热负荷较低的光源，例如图中所示的光纤鹅颈灯。

根据哈姆布格尔和汉密尔顿分期法对胚胎进行分期，并在蛋壳上记录分期结果。随后在胚胎表面滴加两到三滴温热的无菌林格溶液，以防止脱水和污染。

然后用封口膜覆盖在蛋的表面，暂时封闭窗口。接着，准备用于移植的鹌鹑蛋。从孵育箱中取出蛋之前，先在培养皿中加入林格氏液。

然后用弯头镊子在鸡蛋的钝端打开，露出胚胎。使用解剖剪，在胚胎外的绒毛膜和表层胚外膜上剪出四个切口，形成一个方形，确保所有切口相互连接。接着用弯头虹膜镊子轻轻夹住其中一个切口的边缘，将胚胎从蛋中提起，并转移至已准备好的培养皿中。

最后，用5号镊子轻轻去除卵黄膜，然后在解剖显微镜下对胚胎进行分期。移除宿主鸡胚上的石蜡膜。接着使用 sharpened tungsten needle（钨针），在神经管目标区域的VII膜上撕开一个小孔。

向胚胎中加入一滴林格氏液。接下来，对于单侧移植（如本视频中所进行的操作），使用拉制的玻璃针在神经管的中脑区域仔细进行横向的头端和尾端切口，切口不得超过管腔范围。然后在背侧神经管与侧部中胚层之间进行双侧切割。

最后，小心地将切下的外植体从神经管分离，然后用玻璃微量移液管吸取将其从胚胎中移除。首先，使用一个发育阶段相匹配的鹌鹑胚胎。然后，切取与刚才所示相似大小的神经管区域，并将供体外植体吸入含有林格氏液的玻璃微量移液管中。

将X外植体转移至鸡胚宿主的切除区域附近。然后使用拉制的玻璃针，将外植体轻轻引导并调整方向，使其进入消融区域。小心地向胚胎添加数滴林格溶液，以防止脱水。

最后，用封箱胶带密封窗口，确保胶带完全封闭窗口区域的鸡蛋，将鸡蛋放回培养箱中继续培养至目标发育阶段。在培养kyira期间，关闭摇床功能，可每天手动轻轻翻转X两次，以提高其存活率。若目标为较晚的发育阶段，此图为代表性图像，显示重新孵育6小时至HH 11期后神经管移植区域的预期结果，表明移植的鹌鹑供体组织已成功整合入宿主鸡胚的神经管中。在HH 11期对移植区域进行的横切面观察显示，神经嵴细胞以hnk标记，并有一部分正从神经管向外侧迁移。

参与神经嵴细胞迁移流以及神经管形成的鹌鹑细胞可被QCPN清晰标记。在后续发育阶段，可追踪来源于鹌鹑神经嵴的细胞到达其最终靶组织。如本图所示，在上颌突的鸡胚间充质中可见QCPN标记的细胞散布其中。在E5阶段，QCPN抗体可方便地与其他抗体联合使用，以检测来源于鹌鹑的神经嵴细胞的分化情况。

在宿主环境中。如图所示，由鹌鹑神经嵴细胞衍生的三叉神经感觉神经元通过 QCPN 和 TUJ1 抗体进行标记。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如免疫组织化学和原位杂交，以回答更多问题，例如神经嵴细胞会发育形成哪些组织，以及神经嵴细胞在分化为不同组织时表达哪些基因。