用于肿瘤的4D活细胞成像的MAME模型：影响恶性进展的微环境相互作用

本实验的总体目标是构建一种三维共培养模型，称为乳腺结构与微环境工程模型（MAM），用于实时活细胞成像以观察细胞间的相互作用。该目标首先通过在盖玻片上包被成纤维细胞D-淬灭的I型胶原蛋白（DQ Collagen I）来实现，即I型胶原基质。

接下来是淬灭型胶原D。第四步，将重建的基底膜基质添加到已固化的DQ胶原I以及含有包埋成纤维细胞的胶原I基质之上。第三步中，将上皮细胞或肿瘤细胞悬液铺在盖玻片表面，使细胞能够黏附于DQ胶原I及重建的基底膜基质，随后加入培养基。

最后，使用共聚焦显微镜进行四维成像，该技术可在三个空间维度的基础上加上时间维度，对活体乳腺共培养物进行图像分析。最终，四维成像能够实现对乳腺肿瘤细胞与其他肿瘤微环境细胞之间动态相互作用的可视化和分析，这些相互作用可能影响向侵袭性表型的进展。与现有的活体成像等方法相比，该技术的一个主要优势在于，本模型中所观察到的细胞相互作用是同一物种的细胞之间的相互作用，即人类肿瘤细胞与人类肿瘤相关细胞之间的相互作用，而不是例如人类肿瘤细胞与小鼠间质细胞之间的相互作用。

通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为需要先在脑海中构想出主要核心培养物的组装方式，然后还需具备一定的技巧和实践经验才能成功。首先放置一个经过酒精灭菌的矩形塑料盖，然后将其滑入一个35毫米的培养皿中，或使用IBI树形35毫米μ培养皿。

然后将所需数量的成纤维细胞与DQ胶原蛋白混合。接着，使用100微升微量移液器，小心地吸取70微升成纤维细胞-DQ胶原蛋白混合液，并将其均匀铺布在盖玻片的整个表面，随后将培养皿置于37摄氏度、无二氧化碳的湿润培养箱中孵育30分钟。待基质凝固后，再将其转移至37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中平衡10分钟。

然后将培养皿置于通风橱中，直至其降至室温。在固化的DQ胶原上加入60 µL DQ Collagen IV 重组基底膜基质，再在其上加入含有包埋成纤维细胞的Collagen I基质。随后，使用移液枪头小心地将DQ Collagen IV 重组基底膜基质均匀铺展，注意避免刮伤成纤维细胞及下方的DQ Collagen I/Collagen I基质。

然后将培养皿和盖玻片转移至含5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中孵育10分钟，同时DQ胶原IV型重组基底膜基质正在凝固，消化细胞并计数，用于共培养。现在将50微升细胞悬液加入包被好的盖玻片上，并将培养皿放入37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育40至60分钟，使细胞贴附于DQ胶原IV型上。细胞贴附至基质后，加入2毫升含2%重组基底膜的培养基至35毫米培养皿中。

然后在 PBS 洗涤后，于所需的时段内孵育，再进行成像。将共培养物在含有 5 µM Cell Tracker Orange 的 MEGM 培养基中，于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 45 分钟。孵育结束后，再次用 PBS 洗涤共培养物，并将其在预热的 MEGM 培养基中于 37°C、5% CO₂ 培养箱中继续孵育 30 分钟后进行成像。在低倍镜下观察共培养物，例如在共聚焦显微镜上使用水浸物镜以 10× 放大倍数，以 10 µm 间隔在整个结构的全深度范围内采集光学切片。

使用光学切片，通过 Velocity 软件或类似程序对图像进行三维重建。对三维重建结果制作动态影像，以便观察结构、细胞间相互作用以及细胞与周围基质的相互作用。在此代表性示意图所示的皮肤共培养模型中，首先在 IBI 处理的 µ 预置培养皿中包被胶原蛋白，其中一组含有 DQ 胶原蛋白，另一组含有成纤维细胞（如图中品红色所示）。

然后加入一层含有DQ胶原蛋白四的重建基底膜。接着将红色的肿瘤细胞接种在上层，并覆盖2%的重建基底膜，进行体外培养。

每次更换培养基时，均叠加了由奶油色圆点表示的培养基。DQ胶原蛋白一型和四型的荧光切割产物以绿色表示。在本典型的MCF 10 DCIS与WS 12 TI共培养的23天过程中，此处及后续图中可见细胞增殖（红色），同时此处及后续图中也观察到DQ胶原蛋白四型和一型的降解（绿色），以及共培养体系中胶原基质体积减少所提示的基质降解。

相同的活体共培养物在23天内被持续观察，并在共培养的第3、16和23天通过共聚焦显微镜拍摄图像。Mame共培养物中的相互作用是动态的，并且会随时间发生变化。例如，如本3D细胞模型所示，在共培养第3天时，细胞刚开始在基质中增殖，此时仍相对稳定，这一点由缺乏绿色荧光得以证实。

然而，到第16天时，随着细胞持续增殖，它们也开始降解基质结构，这一点可通过DQ胶原蛋白的一型和四型裂解产物（绿色）观察到，同时细胞正在主动分解基质，基质与细胞共定位处呈现黄色荧光。到第23天时，与第3天共培养体积为110,000立方微米相比，快速增殖的细胞已使基质体积几乎降解了一半。从第16天至第23天，该体积已减少至仅46,250立方微米。

16 共培养中，可观察到红色 DCIS 细胞表面 DQ 胶原四的蛋白水解，以及在白色成纤维细胞附近的区域中 DQ 胶原一的弥散性蛋白水解。该共培养中使用的差异染色方法还可在其发育后观察两种细胞类型不同的迁移和增殖模式。该技术为乳腺癌领域的研究人员探索肿瘤大环境对癌症进展的影响铺平了道路，并实现了对癌细胞与周围基质细胞之间动态相互作用的活细胞成像。