Name: 准备个人果蝇蛋钱伯斯实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学习果蝇卵室活体成像技术，用于研究mRNA定位和RNA转运机制。该方法通过显微注射荧光标记物，实现高分辨率动态成像，揭示细胞内组分相互作用，助力发育生物学研究。

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本工作由 I. Davis 的惠康信托高级研究员奖学金资助。

1. 果蝇 解剖前准备（根据普林斯顿大学 E. Gavis 的方法）
<ol>
	<li>丢弃稀疏培养瓶中的成虫，并在实验前将培养瓶转移至25 °C环境中。当新的成虫开始羽化后，等待两天。</li>
	<li>取一个含有约10 ml固体培养基的果蝇小瓶，以45度角加入0.5–0.7克干酵母（见表格）。不要将酵母覆盖整个果蝇培养基表面。</li>
	<li>向酵母中加入几滴水，足以润湿即可（图1A）。将小瓶保持在45度角，静置约3分钟，使酵母充分吸水（图1B）。</li>
</ol>
注意：也可在另一个容器中预先混合酵母糊，然后用刮勺将糊状物加入小瓶中。
<ol start="4">
	<li>通过注入CO2气体使试管中的果蝇麻醉。当果蝇停止活动后，将失去意识的果蝇倾倒至CO2操作垫上进行分选（图1C）。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用细头画笔挑选10–15只所需基因型的雌蝇和5只雄蝇（图1D）。雄蝇可通过其腹部末端存在一对钳状结构（抱器）以及深色突出的形态特征进行明显识别。</li>
	<li>将选好的果蝇加入已添加酵母的试管中（图1E）。置于25 °C条件下培养24–60小时。若需获得较高比例的早期至中期卵室，可缩短培养时间；若需获得晚期卵室，则应延长培养时间。</li>
</ol>
2. Drosophila 卵巢解剖
<ol>
	<li>在1.5号、22 × 50 mm的盖玻片上滴一滴卤代烷油（图2A）。将准备好的盖玻片置于一旁，避免妨碍后续操作。</li>
	<li>通过注入CO2气体麻醉酵母管中的果蝇，并将其轻倒于CO2操作垫上。</li>
	<li>使用尖头精细镊子夹住一只腹部膨大的雌蝇，夹取位置为腹部前端（不要夹在腹部与胸部之间）（图2B-C）。</li>
	<li>用镊子夹住雌蝇，在解剖显微镜下观察，显微镜距准备好的盖玻片约2-3 cm。</li>
	<li>继续保持在前端夹持，用另一把镊子去除雌蝇最末端的组织（图2D）。注意：肠道组织通常会随尾端组织一同被拉出。将去除的组织从镊子上擦拭干净。</li>
	<li>仍以前端夹持雌蝇，用擦净的镊子轻轻挤压或按摩其腹部，方向由前向后，手法类似于从牙膏管末端挤出牙膏。</li>
	<li>两个较大的不透明结构将从腹部被挤出，并黏附在镊子末端（图2E-F）。这两个结构即成对的卵巢。</li>
	<li>将卵巢轻轻触碰至下方盖玻片的卤代烷油中。</li>
	<li>重复解剖操作1-2次，共在盖玻片的油滴中收集4-6个卵巢（图2G）。</li>
</ol>
3. 分离卵巢管
注意：每个卵巢包含大约16个卵管，每个卵管由6到10个处于不同发育阶段的卵室组成，呈串珠状排列10。
注意：在分离卵巢管之前，调节体视显微镜的光源，使照明以浅角度照射样品。这能增强样品的对比度，便于观察早期卵室。
<ol>
	<li>在油中，用闭合的镊子去除后端（较老的阶段）连接组织，将两个卵巢分开（图3A）。</li>
	<li>将单个卵巢调整方向，使最老的阶段位于左侧，最年轻的阶段位于右侧。卵巢中年轻阶段的卵室呈透明状，并形成卵巢较尖的一端。</li>
	<li>用惯用手持一对镊子，轻轻夹住卵巢的后部，最好夹住残留的连接组织部分。用镊子固定卵巢位置的同时，使用解剖探针（或钨针）逐一分离出单个的卵管（图3B-D）。</li>
</ol>
注意：单个卵管会在早期阶段（卵原区至10期）之间断裂，因为较晚的阶段体积过大，无法从完整的卵巢中分离出来。
注意：若用解剖探针刺破晚期卵母细胞，会导致细胞质泄漏到油中，从而使单个卵巢管的提取变得非常困难。一旦刺破晚期卵母细胞，应更换为一个新的卵巢样本。
<ol start="4">
	<li>当卵管从卵巢中分离后，使用解剖探针将其拖至油滴中心，并根据实验需要调整其方向。注意：在油中的卵管会自然沉降并附着于玻璃表面。</li>
	<li>重复此操作（3.3–3.4）步骤，直至获得 15–25 根独立的卵管。注意：此过程可能需要解剖多个卵巢。整个过程应耗时少于 15 分钟。</li>
</ol>
注意：建议从多只果蝇中各解剖一个卵巢，而不是从较少的果蝇中解剖出两个卵巢，以增加实验中果蝇的样本量（n值）。
注意：粗暴操作卵原小叶将导致卵母细胞不健康，并可能在实验中产生人为假象。
注意：卵母细胞在从卵巢解剖分离后40分钟会因应激开始表现出表型变化（比较图7E与7F）。
<ol start="6">
	<li>当卵管处于合适的方向时（图3E），使用解剖探针和闭合的镊子将多余的卵巢组织移出油滴。可将镊子上的组织擦拭到纸巾上。</li>
</ol>
4. 分离单个晚期卵室（根据普林斯顿大学 E. Gavis 的方法）
<ol>
	<li>用优势手持镊子夹住分离的卵巢后部，最好夹住结缔组织的残余部分。用镊子固定卵巢位置的同时，将解剖针从靠近镊子的卵巢后端插入（图4A）。插入解剖针时应避开任何卵室，将其插入晚期卵室之间的间隙。</li>
	<li>将解剖针沿卵巢拉过，直至其从早期卵室端穿出（图4B）。操作正确时，解剖针会去除固定卵巢管和晚期卵室的结缔组织。</li>
	<li>重复步骤4.2，直至卵巢管在盖玻片上散开。注意：当卵室不再相互堆叠时，此步骤即已完成。</li>
	<li>使用解剖针将晚期卵母细胞分开，以便于成像观察（图4C）。</li>
</ol>
注意：解剖晚期卵室时刺破卵母细胞，其影响不如解剖早期卵室的单个卵管时刺破卵母细胞那样严重。
注意：对于14期卵室，使用镊子夹住背侧附属结构以确定方向。
5. 注射液的制备
注意：注射中期卵母细胞时，应将卵管垂直于盖玻片的长轴方向放置。
<ol>
	<li>开启成像显微镜（本实验中使用 Applied Precision 公司的 DeltaVision Core 系统），并加载相应的成像设置（图 5A-B）。</li>
	<li>开启显微注射装置（图 5C）。</li>
	<li>使用上样尖端将注射针上样（图 5D-E）。待注射的溶液应先高速短暂离心，以避免可能堵塞注射针的沉淀物。</li>
	<li>将已上样的注射针安装到注射器上，注意避免针尖断裂（图 5F）。</li>
	<li>为便于疏通堵塞的针尖，可在含有卵泡的油滴一侧放置一小块尺寸为 2×10 mm 的盖玻片碎片。确保该玻璃碎片被油完全覆盖。此玻璃碎片可用于顶撞针尖，以击碎或疏通堵塞物。</li>
</ol>
6. 荧光RNA的注射
开始前：设置注射装置和显微操作器控制，使注射针位于视野中心上方。
<ol>
	<li>将待注射的样品固定在显微镜载物台上。</li>
	<li>选择 20x 物镜。也可使用更高或更低放大倍数的物镜。</li>
</ol>
注意：如果使用具有定点访问功能的自动载物台，建议在开始之前标记所有8-9期的卵母细胞以供注射。这有助于方便地访问和注射选定的卵母细胞。
<ol start="3">
	<li>将注射针缓慢下移，直至接触油滴表面。确保针尖位于物镜正上方中心位置。</li>
	<li>关闭室内光源，打开显微镜的明场照明。从已标记的位点列表中选择第一个位点（卵母细胞）。通过目镜观察，对卵母细胞进行调焦（图6A）。</li>
	<li>手动降低注射针，使其与卵母细胞处于同一焦平面，并可在卵母细胞旁清晰可见。</li>
	<li>使用操纵器控制装置，将注射针尖移动至卵母细胞内部。快速刺入的动作通常比缓慢推进更易成功。进入细胞后，从针尖推出少量液体，肉眼观察其效果，必要时重复操作。若注射成功，卵母细胞内的细胞质将发生位移；若无明显变化，需重复注射。无需通过荧光成像来判断物质是否已注入。注射完成后，将针头从卵母细胞内退出（图6B-G）。</li>
	<li>精确量化注射液体的体积较为困难。如需增加注射量，可调节注射脉冲的压力或持续时间，轻微折断针尖以略微扩大开口，或采用多次注射脉冲。</li>
</ol>
注意：若操作得当，整个注射过程应在10秒内完成。对卵母细胞进行反复穿刺或在细胞内长时间滞留针头，将导致卵室严重受损。
<ol start="8">
	<li>在选择下一个标记的卵母细胞之前，将注射针在油中抬高至足够高度，以避免在移动路径中接触其他卵母细胞。</li>
	<li>到达新的卵母细胞后，重复步骤 6.6。以此方式继续操作，直至完成所有所需卵母细胞的注射。</li>
</ol>
注意：若在注射过程中出现失误，请移至下一个已标记的卵母细胞。不要在已损坏的卵母细胞上浪费时间。
注意：在注射过程中，针头可能会发生堵塞。此时，将针头移至盖玻片油滴中玻璃碎屑的附近。使玻璃碎屑与针头处于同一焦平面，轻轻将针头撞击玻璃碎屑（图6H）。通过按压注射按钮，观察是否有液体从针尖流出，以检测针头是否已疏通。
<ol start="10">
	<li>当所有卵母细胞注射完成后，手动将注射针向上移动，从油中取出，并将其调整至显微镜光路之外。确保其处于安全方向，以避免造成眼部损伤。</li>
</ol>
注意：如果卵室分离与卵母细胞注射之间间隔时间过长，卵母细胞将难以注射，并表现出与应激相关的表型变化。粗暴操作卵母细胞或注射过量液体也可能导致类似问题（比较图6I、J、K）。
7. 活体成像实验设计
<ol>
	<li>从列表中选择第一个已注射的卵母细胞。通过荧光成像一帧图像（如图6G所示）来确认注射是否位于卵母细胞内。</li>
	<li>设置实验参数，包括：激发波长、发射光路、激发时间、Z轴层扫以及采集间隔时间。注意：有关此内容的更多信息，请参见Parton R. 等人 (2010)2。</li>
	<li>采集数据集。</li>
</ol>
8. 代表性结果
体外合成的Alexa-546 grk RNA被注射到Me31B::GFP卵室中（图7A）。该RNA定位于卵母细胞的背侧前部，并在细胞核周围形成帽状结构（图7B）。有关RNA定位的更多示例，请参见MacDougall N. 等（2003）11。
表达荧光标记蛋白（Tau-GFP，图7C）或RNA标记系统（grk*mCherry，图7D）的中期和晚期卵母细胞无需注射即可进行成像。
<img alt="果蝇遗传学研究装置，配备显微镜；检查并分选果蝇以进行性状分析实验。" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图 1。
 
<img alt="使用移液管在载玻片上固定果蝇的过程；包括镊子；显微镜装置。" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图 2.
 
<img alt="显微镜：细胞转移过程、显微注射装置、高精度细胞操作步骤。" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3.
 
<img alt="组织解剖过程和细胞分离实验的显微镜图像，样本 A-C 已标记。" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4。
 
<img alt="用于光学激发与显微注射技术的显微镜装置。" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图 5.
 
<img alt="胚胎显微注射流程；明场显微镜观察、基因表达分析、发育研究。" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6。
 
<img alt="荧光显微镜图像；细胞结构、蛋白质；细胞生物学中的比较分析。" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
图 7.

<ol><li>Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+and+the+development+of+biology+in+the+20th+century%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century.</a> Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).</li>
<li>Parton, R. M., Valles, A. -M., Dobbie, I. D., Davis, I. Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParton%2C+RM+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory%22">Live Cell Imaging: A Laboratory</a>. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 387-418 (2010).</li>
<li>Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+messages%3A+the+intracellular+localization+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Moving messages: the intracellular localization of mRNAs.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).</li>
<li>Jansen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Message+on+the+Move%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Message on the Move.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).</li>
<li>Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gurken+and+the+I+factor+retrotransposon+RNAs+share+common+localization+signals+and+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery.</a> Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).</li>
<li>Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Squid%2FhnRNP+helps+Dynein+switch+from+a+gurken+mRNA+transport+motor+to+an+ultrastructural+static+anchor+in+sponge+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Squid/hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies.</a> Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).</li>
<li>Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+fluorescently+labeled+endogenous+gurken+mRNA+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila.</a> J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).</li>
<li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+endogenous+mRNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).</li>
<li>Bertrand, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+gurken+%28TGFalpha%29+mRNA+localizes+as+particles+that+move+within+the+oocyte+in+two+dynein-dependent+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps.</a> Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+migrating+border+cell+cluster+in+living+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers.</a> Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+bicoid+mRNA+anchoring+highlight+conserved+mechanisms+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition.</a> Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

活细胞成像是一种用于实时观察细胞过程的强大检测方法。除了简单的明场观察外，对目标蛋白和RNA添加荧光标记已带来诸多突破。本文概述了一种可用于单个活卵母细胞成像的实验方案，该方法可与遗传学和生物化学检测手段联合使用。
 在本方案中，我们还介绍了如何通过显微注射对活体卵母细胞进行实验性操作。可注射的物质有多种选择，包括 体外 合成荧光标记的RNA以检测二级结构指导RNA定位的能力（Ball和Davis，未发表），以及抑制蛋白质功能的抗体 6未来的研究可能会将其他标记成分和细胞机制引入活体卵母细胞，从而能够验证分子机制。 
 在处理活细胞时，保持组织的活性和健康状态至关重要。在本实验方案中，我们指出了若干可能导致卵室受到应激的步骤。例如，尽管油相介质在成像方面具有优势，但长时间在油中培养可能会对卵室造成应激。这种应激可通过明场曝光下观察细胞核形态与位置、卵母细胞膜的变化来轻松监测：在应激状态下，卵母细胞膜会发生扭曲并出现出泡现象（可对比图7E（无应激）与图7F（有应激））。第9期卵室可在数小时内维持RNA定位和边界细胞迁移12。然而，第7/8期卵室在卵巢从雌性果蝇体内取出约40分钟后，便会在卤代碳油中开始出现不良效应。由于在第11至14期时滤泡细胞已开始分泌卵壳，因此晚期卵室在油相或水相培养基中均可正常发育13。已有报道指出，在水相昆虫培养基中添加胰岛素可使第9期卵母细胞维持活性长达6小时14，并可使生殖腺体维持活性达14小时15。在所有情况下，均应避免对卵室进行剧烈操作，因为这会增加卵母细胞的应激并降低其存活率。通过减少成像的卵室数量，并谨慎轻柔地处理每一个卵室，是确保最佳存活率的最佳方法。

<table><tbody><tr><td colspan="4">解剖所用工具应保持清洁，但无需高压灭菌。使用前用乙醇擦拭工具，并使其自然晾干。</td></tr><tr><td>细尖画笔（艺术家用貂毛圆头笔，00号或0号）</td><td>任意供应商</td><td></td><td>高质量的画笔至关重要</td></tr><tr><td>Halocarbon Products Corporation，Series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td></td><td>欧洲经销商：&lt;br/&gt;Solvadis (GMBH)&lt;br/&gt;务必通过向油中通入空气进行氧合处理。</td></tr><tr><td>盖玻片 - No. 1.5，22 × 50 mm</td><td>International - No1 - VWR 目录号=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser - 22 - 40mm - MNJ 400-070T</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 - Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td>“Biologie”型号的尖端也可使用，但更易损坏</td></tr><tr><td>解剖探针</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>CO2垫板</td><td><a href="http://www.flystuff.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Genesee Scientific</a></td><td>59-114 （789060 Dutscher）</td><td>欧洲经销商：&lt;br/&gt;Dutscher &lt;a href="http://www.dutscherscientific.com"&gt;www.&lt;strong&gt;dutscherscientific&lt;/strong&gt;.com&lt;/a&gt;/&lt;br/&gt;也可相对容易地自行定制果蝇垫板</td></tr><tr><td>KimCare</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 - DeltaVision</td><td>Applied Precision</td><td>DC-CORE</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Burleigh</td><td>Burleigh PCS-5000 系列，TS-5000-300</td><td>http://www.ldgi-burleigh.com/ （原 Exfo）</td></tr><tr><td>注射装置</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1</td><td>经改装，可适配 Eppendorf Femtotips 吸头</td></tr><tr><td>注射针</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>不同应用宜选用不同类型的针尖</td></tr><tr><td>上样吸头 20&amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>干活性酵母</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s </td><td>#2192</td><td></td></tr></tbody></table>

准备个体 果蝇 用于活体成像的卵室

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

活细胞成像是一种重要的技术，广泛应用于多种作为模式系统的黑腹果蝇（Drosophila）组织，以研究诸如轴向特化、细胞分化和器官发生等科学问题1。实验样品的正确制备是一个关键但常被忽视的步骤。样品制备的目标是确保实验的生理相关性，并建立最佳的成像条件。为了维持组织的活性，必须避免脱水、缺氧、过热或培养基恶化等不利因素2。
 果蝇（Drosophila）卵室是研究体轴模式形成、mRNA 定位及细胞骨架组织等相关问题的经典模型系统，其应用范围不仅限于此3,4。对于早期和中期的卵室，使用卤代烃油封片是一种理想的处理方法，因其可允许氧气自由扩散，有效防止脱水与缺氧，同时具备优异的光学特性，适用于显微成像。通过将转基因引入卵室，或直接注射标记的 RNA、蛋白质或抗体，可实现对荧光蛋白的成像观察5-7。例如，在动物基因组中引入 MS2 构建体，可实现对卵母细胞中 mRNA 的实时观测8。这些构建体利用 MS2 噬菌体 RNA 干环结构与其外壳蛋白的特异性结合，实现 mRNA 在活体（in vivo）中的标记9。
 本文介绍了一种从雌性Drosophila中提取卵巢以及分离单个卵巢管和卵室的实验方案。有关Drosophila卵子发生过程的详细描述，请参见Allan C. Spradling（1993年，2009年重印）10。

Drosophila 卵室是研究 mRNA 定位机制的优良模型。为了捕捉定位过程背后动态事件的变化，需要对活体组织进行快速高分辨率成像。本文介绍了一种对活体样品进行解剖和成像的实验方案，可在最小干扰下完成操作。

活细胞成像是一种重要技术，广泛应用于多种作为模式系统的果蝇组织，以研究诸如轴向特化等生物学问题，……

以下实验的目的是记录活体果蝇U位点的动态过程。首先从饲喂良好的两天龄雌性果蝇中分离完整的卵巢，然后从卵巢中取出单个细管，以对卵室进行成像。然后，如果它们表达了合适的荧光蛋白，可直接对单个卵室进行成像，或在成像前进行进一步操作，例如显微注射荧光标记物。最终，通过分析视频序列，可以揭示细胞内组分之间的动态相互作用。该方法已帮助我们回答了RNA转运和局部翻译领域中的一些关键问题。例如，在活体观察中，决定生物体构型的蛋白质表达是如何在时间和空间上受到调控的？通常，初次接触该方法的人会遇到困难，因为该方法需要极快的操作速度和熟练的技巧。通过练习，才能获得更好的结果。该方法的可视化演示至关重要，因为卵室的操作难以通过文字传达，且需要操作者具备娴熟的技术和稳定的手法。开始此操作时，先在盖玻片上滴加一滴卤代碳油，并将其放置一旁备用。随后用二氧化碳麻醉准备好的果蝇。使用锋利的细头镊子夹住雌蝇腹部前端，避免夹在腹部中央。将雌蝇保持在已准备好的盖玻片上方约2至3厘米处。使用另一对镊子，移除雌性个体最尾端的组织。通常包括肠道组织，需用干净的镊子操作。从腹部前端向后端轻轻按摩，如同挤压牙膏管一般。卵巢呈大型不透明结构，会粘附在镊子末端。通过将卵巢接触载玻片上的卤代碳油来收集。重复此过程，直至收集到4至6个卵巢。在分离气管之前，调节显微镜的光源，使光线以浅角度照射到载玻片上，从而在组织上形成对比明显的阴影。解剖果蝇时，使用合适的工具至关重要。我们使用的探针不要过于锋利，以免损伤组织，但也要足够钝，以便夹住我们所用的镊子。同样，镊子也不要太尖锐，以免损伤组织，但需足够精细，以便操作时不会使工具弯曲。在整个操作过程中，保持工具清洁也非常重要，因此我们需定期用闭合的镊子对工具进行清洁。通过去除后端连接的组织将两个卵巢分开。后端含有最成熟的卵室。将卵巢水平放置，使最年轻的卵室朝向你的优势手一侧。然后用解剖针或钨针轻轻抓住末端残留的结缔组织，将卵室逐个分离。从Jamar期至10期的卵室会彼此分开，但较老的卵室仍会附着在卵巢上。用探针小心地将15至25个分离的卵室移至油滴中央。如果需要解剖多个卵巢，应选择另一只果蝇的卵巢。弃去多余的卵巢组织，并迅速操作，因为卵母细胞会因应激而开始出现表型变化。从卵巢中解剖出来40分钟后，用清洁的器械将多余的卵巢组织从油中移除，用于中期卵母细胞注射；将卵泡垂直于盖玻片的长轴方向排列。以分离晚期卵室。需要采用不同的方法抓取卵巢后部，操作方式如前所述。将解剖探针从镊子附近的卵巢后端插入，为避免刺破卵室，应将探针插入至晚期卵室之间的间隙中。将解剖针穿过卵巢，直至其从早期卵室处穿出。操作正确时，探针会去除固定末端丝状结构和晚期卵室的结缔组织。重复此步骤，直至末端丝状结构在盖玻片上散开。当卵室不再相互堆叠时，此步骤完成。使用解剖探针将晚期卵室分开，以便成像并定位第14期。颈部卵室使用镊子夹住其背侧附属结构。通过短暂高速离心准备待注射的溶液，以使可能堵塞注射针头的固体沉淀物沉降至管底。然后使用上样尖端将注射针装上溶液，并小心地将装好溶液的注射针连接到注射装置上。现在将一小块玻璃放置在样品旁边，并将玻片固定在显微镜载物台上。该玻璃将作为屏障以打断或解除连接。拔掉针头的电源。为实验准备显微镜和显微注射装置。操作时注意不要折断针尖。如果可能，使用具有定位访问功能的自动载物台，标记所有八期和九期的卵母细胞以进行注射。现在，降低注射针直至接触到油层。在标记的点列表中选择第一个点，并聚焦于细胞。手动降低注射针，使其与细胞处于同一焦平面。使用操纵器控制装置，移动注射针的针尖，直至其进入U位点。快速刺入的动作通常比缓慢操作更易成功。进入位点后，从针头中推出少量液体，并通过肉眼评估其效果。需要重复操作。如果注射成功，细胞内的细胞质将被移位。所注入液体的精确量难以定量。为增加注射体积，可调节注射脉冲的压力或持续时间。可折断针尖以略微增大针孔，或在选择下一个标记前直接使用多次注射脉冲。将注射针在油中抬高至足够高度，以免其碰撞到其他细胞。针头在卵室内部反复穿刺或停留过久会严重损伤卵室。因此操作需迅速，注射时间应少于10秒。如果出现错误，应移动到下一个标记位置。不要在已损坏的视野上浪费时间。当针头堵塞时，将针头移至碎玻璃处。将玻璃和针头置于同一焦平面后，轻轻将针头推入玻璃中。通过按压注射按钮并观察是否有液体从针尖流出，以检测针头是否堵塞。当所有超声（US）位点注射完成后，手动将针头从油中移出，并将其移出显微镜的光路范围。确保其处于安全方向，以避免眼睛损伤，并关闭光源。为了加快荧光成像速度，这是必要的。如果卵室分离与细胞注射之间间隔超过一小时，细胞将难以注射，并表现出与应激相关的表型变化。粗暴操作细胞或注射过量液体也可能引发类似问题。表达嵌合荧光蛋白的卵室无需注射即可直接进行成像。利用完整的体外合成组织分离方案，可对内源性 RNA 进行 MS2 标记并取得良好的成像效果。Alexa、5 46 kin、RNA 被注射到一个 ME 31 BGFP 卵室中，该 RNA 定位于细胞的背侧前部，并在细胞核周围形成一个帽状结构。一旦掌握，该技术可以从解剖到成像开始在大约 10 分钟内完成。在尝试此操作时，应快速但小心地处理组织。观看本视频后，您应能充分理解如何在活体果蝇细胞中记录动态过程。

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