准备个体 果蝇 用于活体成像的卵室

以下实验的目的是记录活体果蝇U位点的动态过程。首先从饲喂良好的两天龄雌性果蝇中分离完整的卵巢，然后从卵巢中取出单个细管，以对卵室进行成像。

然后，如果它们表达了合适的荧光蛋白，可直接对单个卵室进行成像，或在成像前进行进一步操作，例如显微注射荧光标记物。最终，通过分析视频序列，可以揭示细胞内组分之间的动态相互作用。该方法已帮助我们回答了RNA转运和局部翻译领域中的一些关键问题。

例如，在活体观察中，决定生物体构型的蛋白质表达是如何在时间和空间上受到调控的？通常，初次接触该方法的人会遇到困难，因为该方法需要极快的操作速度和熟练的技巧。通过练习，才能获得更好的结果。

该方法的可视化演示至关重要，因为卵室的操作难以通过文字传达，且需要操作者具备娴熟的技术和稳定的手法。开始此操作时，先在盖玻片上滴加一滴卤代碳油，并将其放置一旁备用。随后用二氧化碳麻醉准备好的果蝇。

使用锋利的细头镊子夹住雌蝇腹部前端，避免夹在腹部中央。将雌蝇保持在已准备好的盖玻片上方约2至3厘米处。

使用另一对镊子，移除雌性个体最尾端的组织。通常包括肠道组织，需用干净的镊子操作。从腹部前端向后端轻轻按摩，如同挤压牙膏管一般。

卵巢呈大型不透明结构，会粘附在镊子末端。通过将卵巢接触载玻片上的卤代碳油来收集。重复此过程，直至收集到4至6个卵巢。

在分离气管之前，调节显微镜的光源，使光线以浅角度照射到载玻片上，从而在组织上形成对比明显的阴影。解剖果蝇时，使用合适的工具至关重要。

我们使用的探针不要过于锋利，以免损伤组织，但也要足够钝，以便夹住我们所用的镊子。同样，镊子也不要太尖锐，以免损伤组织，但需足够精细，以便操作时不会使工具弯曲。在整个操作过程中，保持工具清洁也非常重要，因此我们需定期用闭合的镊子对工具进行清洁。

通过去除后端连接的组织将两个卵巢分开。后端含有最成熟的卵室。将卵巢水平放置，使最年轻的卵室朝向你的优势手一侧。

然后用解剖针或钨针轻轻抓住末端残留的结缔组织，将卵室逐个分离。从Jamar期至10期的卵室会彼此分开，但较老的卵室仍会附着在卵巢上。用探针小心地将15至25个分离的卵室移至油滴中央。如果需要解剖多个卵巢，应选择另一只果蝇的卵巢。

弃去多余的卵巢组织，并迅速操作，因为卵母细胞会因应激而开始出现表型变化。从卵巢中解剖出来40分钟后，用清洁的器械将多余的卵巢组织从油中移除，用于中期卵母细胞注射；将卵泡垂直于盖玻片的长轴方向排列。以分离晚期卵室。

需要采用不同的方法抓取卵巢后部，操作方式如前所述。将解剖探针从镊子附近的卵巢后端插入，为避免刺破卵室，应将探针插入至晚期卵室之间的间隙中。

将解剖针穿过卵巢，直至其从早期卵室处穿出。操作正确时，探针会去除固定末端丝状结构和晚期卵室的结缔组织。重复此步骤，直至末端丝状结构在盖玻片上散开。

当卵室不再相互堆叠时，此步骤完成。使用解剖探针将晚期卵室分开，以便成像并定位第14期。颈部卵室使用镊子夹住其背侧附属结构。

通过短暂高速离心准备待注射的溶液，以使可能堵塞注射针头的固体沉淀物沉降至管底。然后使用上样尖端将注射针装上溶液，并小心地将装好溶液的注射针连接到注射装置上。

现在将一小块玻璃放置在样品旁边，并将玻片固定在显微镜载物台上。该玻璃将作为屏障以打断或解除连接。拔掉针头的电源。

为实验准备显微镜和显微注射装置。操作时注意不要折断针尖。如果可能，使用具有定位访问功能的自动载物台，标记所有八期和九期的卵母细胞以进行注射。

现在，降低注射针直至接触到油层。在标记的点列表中选择第一个点，并聚焦于细胞。手动降低注射针，使其与细胞处于同一焦平面。

使用操纵器控制装置，移动注射针的针尖，直至其进入U位点。快速刺入的动作通常比缓慢操作更易成功。进入位点后，从针头中推出少量液体，并通过肉眼评估其效果。

需要重复操作。如果注射成功，细胞内的细胞质将被移位。所注入液体的精确量难以定量。

为增加注射体积，可调节注射脉冲的压力或持续时间。可折断针尖以略微增大针孔，或在选择下一个标记前直接使用多次注射脉冲。将注射针在油中抬高至足够高度，以免其碰撞到其他细胞。

针头在卵室内部反复穿刺或停留过久会严重损伤卵室。因此操作需迅速，注射时间应少于10秒。

如果出现错误，应移动到下一个标记位置。不要在已损坏的视野上浪费时间。当针头堵塞时，将针头移至碎玻璃处。

将玻璃和针头置于同一焦平面后，轻轻将针头推入玻璃中。通过按压注射按钮并观察是否有液体从针尖流出，以检测针头是否堵塞。当所有超声（US）位点注射完成后，手动将针头从油中移出，并将其移出显微镜的光路范围。

确保其处于安全方向，以避免眼睛损伤，并关闭光源。为了加快荧光成像速度，这是必要的。如果卵室分离与细胞注射之间间隔超过一小时，细胞将难以注射，并表现出与应激相关的表型变化。

粗暴操作细胞或注射过量液体也可能引发类似问题。表达嵌合荧光蛋白的卵室无需注射即可直接进行成像。利用完整的体外合成组织分离方案，可对内源性 RNA 进行 MS2 标记并取得良好的成像效果。

Alexa、5 46 kin、RNA 被注射到一个 ME 31 BGFP 卵室中，该 RNA 定位于细胞的背侧前部，并在细胞核周围形成一个帽状结构。一旦掌握，该技术可以从解剖到成像开始在大约 10 分钟内完成。在尝试此操作时，应快速但小心地处理组织。观看本视频后，您应能充分理解如何在活体果蝇细胞中记录动态过程。