Name: 杂交原位和蚊虫唾液腺，卵巢，胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习原位杂交技术用于蚊虫唾液腺、卵巢及胚胎中特定转录本的定位与积累模式分析。该方法结合反义RNA探针杂交和显色抗体染色，帮助研究人员在功能基因组学领域深入理解基因表达调控机制。

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作者感谢 Marika Walters 在开发杂交技术方面提供的建议 原位 软组织方法及Yury Goltsev对杂交实验方案的讨论 原位 的 Anopheles gambiae 胚胎，随后经过调整和修改，用于建立本文所述的杂交实验方案 原位 的 伊蚊 和 库蚊 胚胎。我们还感谢Adam Paré和David Kosman提供的有益建议。感谢Osvaldo Marinotti参与科学讨论并对实验方案文本进行编辑。

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</ol>

作者无披露信息。

杂交 原位 此处介绍的针对完整蚊虫组织和胚胎的比色染色方案，是一种用于定位特定器官和细胞类型中转录本的有用技术。这些操作步骤相较于我们先前报道的方法有所改进，不仅简化了繁琐的洗涤步骤，还提供了更详尽的技术细节和试剂来源信息。 
根据我们的经验，与基于荧光的检测方法相比，比色法检测杂交信号在灵敏度和信号清晰度方面更具优势。此外，比色法可避免胚胎本身具有自发荧光所带来的信号分辨问题。当靶向低丰度转录本且出现明显背景染色时，杂交信号的检测会受到限制。将杂交温度提高至 65 °C 可降低背景杂交信号，但不能替代设计特异性靶向的唯一RNA探针这一关键步骤。
 该方案已用于执行杂交 原位 埃及伊蚊唾液腺整体装片，以及卵巢和胚胎的 冈比亚按蚊，斯氏按蚊，埃及伊蚊 和 致倦库蚊该方法也适用于其他蚊虫组织，可能还适用于其他昆虫的组织。此外，我们首次编制了三种媒介蚊虫胚胎发育分期的比较指南， 埃及伊蚊、冈比亚按蚊和白纹伊蚊已有针对这三种物种特定品系在特定饲养条件下的观察报道。需要注意的是，不同蚊虫品系的发育时间进程可能因品系差异以及饲养条件不同而有所变化。杂交实验 原位 补充正在进行的蚊子及其他节肢动物转录组分析工作，可能为这些生物中基因表达调控提供更全面的认识。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td> </td></tr><tr><td>1M Tris-HCl </td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>pH8.0</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td> </td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td> </td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td>比标准管更透明，便于观察样品</td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>DEPC 水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td> </td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td> </td></tr><tr><td>5.25% 次氯酸钠</td><td>Austin&amp;#8217;s</td><td></td><td>A-1 品牌</td></tr><tr><td>T3 RNA 聚合酶-Plus</td><td>Ambion</td><td>AM2733</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>Ambion</td><td>AM2082</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td> </td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性聚乙烯移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td> </td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td> </td></tr><tr><td>高效液相色谱级甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td> </td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M87-500</td><td> </td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>18 × 18 mm</td></tr><tr><td>正庚烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-1</td><td> </td></tr><tr><td>对二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>O5082-500</td><td> </td></tr><tr><td>Pyrex 9 孔点样板</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td>100 × 85 mm</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32730-0025</td><td> </td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td> </td></tr><tr><td>Superfrost/Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 × 75 × 1.0 mm</td></tr><tr><td>Davlyn 红色透明衬里假发胶带</td><td>Hair Direct</td><td>RED-75R12</td><td>聚酯/皮肤基材，0.75 英寸 × 12 码卷</td></tr><tr><td>TOPOTA 克隆试剂盒（用于测序，含 One Shot Top10 化学感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;）</td><td>Invitrogen</td><td>K457501 K457540</td><td>20 次反应 &lt;br/&gt; 40 次反应</td></tr><tr><td>超声处理的鲑鱼精子 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>抗地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段</td><td>Roche Applied Science</td><td>1093274</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>DIG RNA 标记混合物</td><td>Roche Applied Science</td><td>1277073</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>NBT/BCIP 储存液</td><td>Roche Applied Science</td><td>1681451</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Western 封闭试剂</td><td>Roche Applied Science</td><td>11921673001</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Saatilene Hitech 聚酯网（330.130）</td><td>Saati Print</td><td>330.34 UO PW</td><td>330 根/英寸，34 微米丝径，橙色</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G6279-1</td><td>PBT 中 70%</td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td> </td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500</td><td> </td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Ted Pella</td><td>18508</td><td>10 ml 棕色安瓿瓶分装</td></tr><tr><td>16 盎司带盖 Solo 纸容器</td><td>The Paper Company</td><td>SOLOKH16AJ8000</td><td> </td></tr><tr><td>带未固定螺旋盖的硼硅酸盐玻璃闪烁小瓶</td><td>VWR International</td><td>66022-128</td><td>20 ml，每箱 500 个</td></tr><tr><td>Sealed Air 气泡膜蜂窝缓冲材料</td><td>VWR International</td><td>500018-081</td><td>每卷 10 英尺，厚度 0.188 英寸</td></tr><tr><td>鸡血清</td><td></td><td></td><td>从幼鸡的翅静脉或心脏穿刺采集全血。血液在 37 &amp;deg;C 孵育 1 小时至凝固，然后冰上放置 30 分钟。收集血清，3000 × g 离心 10 分钟。收集上清液（澄清血清），-20 &amp;deg;C 保存备用。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 4.&lt;/strong&gt; 原位杂交专用试剂与设备表 &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt;。</td></tr></tbody></table>

杂交 原位 唾液腺、卵巢和媒介蚊虫胚胎

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

蚊子是多种病原体的传播媒介，包括节肢动物传播病毒、原生动物寄生虫和线虫。研究蚊子体内病原体与宿主相互作用组织以及生殖器官中表达的转录本和基因调控因子，对于开发阻断蚊媒疾病传播和干扰卵子发育的策略具有重要意义。已有多种工具被用于研究和验证基因表达的时间特异性和组织特异性调控。本文描述了为获取基因表达空间信息而开发的一系列实验方案，这些信息有助于我们更深入理解特定基因的表达位置及其产物的积累情况。所述方案已被用于验证转录本的表达，并确定其在与蚊媒病原体传播相关的组织（如雌性蚊子的唾液腺）以及与蚊子生殖和发育相关的卵巢和胚胎亚细胞结构中的积累模式。
以下步骤代表了一种经过优化的方法，可在不损失靶标特异性杂交信号的前提下，提高本实验方案中多个步骤的效率。A 部分介绍了 RNA 探针制备、软组织解剖以及固定和杂交的一般性操作流程，而 B 部分则详细描述了蚊子胚胎收集、固定、预杂交及杂交的特定操作步骤。

时间和空间上的基因表达分析在功能基因组学中具有重要作用。原位杂交可用于确定转录本在组织及亚细胞区室中的定位。本文概述了一种针对蚊子特定靶组织优化的原位杂交实验方案。

蚊子是多种病原体的传播媒介，包括节肢动物传播病毒、原生动物寄生虫和线虫。对转录本和基因……的研究

以下实验的总体目标是通过在C two中进行杂交，确定特定转录本在蚊虫组织和胚胎中的定位及累积模式。该目标首先通过固定蚊虫组织或胚胎来实现，以保存组织的超微结构和mRNA靶标，使其能够与反义RNA探针发生杂交。随后，反义RNA探针将与固定组织或胚胎中的靶转录本进行杂交。然后进行显色抗体染色方法，以检测目标 mRNA 的定位和积累模式。通过 C2 杂交及显色检测方法获得结果，显示 RNA 积累的空间分布模式。该方法有助于回答功能基因组学领域的关键问题，例如揭示基因产物在蚊子体内的积累时间和位置。该实验步骤还可帮助我们获得空间定位信息，以更深入地理解基因表达在繁殖发育及蚊媒病原体相互作用等生物学过程中的调控机制。为准备将地高辛标记的RNA探针与蚊虫组织进行杂交，首先解剖分离卵巢和唾液腺，随后固定组织，并根据需要使用蛋白酶K处理。组织固定后，将其在1毫升杂交溶液PBT或HIB PBT（1:1混合液）中平衡30分钟，期间持续振荡，待组织沉降后，尽可能吸除HIB PBT。然后向每个样品管中加入1毫升HIB。用密封的防空气保护材料（如气泡膜）包裹样品管，并将其放入杂交瓶中。用杂交瓶盖密封瓶子，并在55摄氏度下以旋转方式孵育30分钟。从孵育器中取出瓶子后，待组织沉降，小心倾去预杂交缓冲液，保留50微升溶液于管中，以防止样品损失。接着，向同一样品中加入50微升预热的高盐缓冲液，并将其置于设定为55摄氏度的加热块中，同时将先前制备好的RNA探针在85摄氏度下变性5分钟。然后立即将其置于冰上五分钟。接着，用移液器将RNA探针加入样品管中。RNA探针会漂浮在HI溶液的表面。轻轻弹动离心管以混匀。将样品置于杂交炉内固定的微量离心管架中，在55°C下轻柔孵育16至24小时。随后按照书面实验方案进行RNA处理及抗体染色。使用200微升移液器吸头将组织样本转移至Pyrex点板的各个圆底孔中，以固定样本。尽可能去除PBT，并用70%甘油水溶液覆盖样本。于4摄氏度下静置过夜，使甘油充分渗透样本。制备显微镜载玻片时，首先用无尘纸擦拭载玻片表面使其清洁。接着，用画笔将两段透明胶带平行贴在载玻片上，形成一条狭窄的通道。然后逐个拾取样品，并将其沿通道长度方向依次放置，确保每个样品在前、后、背、腹方向上的取向保持一致。放置每个样本后，使用Kimwipe棉签吸去组织周围多余的甘油溶液。去除多余的甘油对于防止在盖玻片下密封样本时产生气泡至关重要。小心地将盖玻片覆盖在含有已排列样本的通道上，然后使用透明指甲油轻轻点涂盖玻片的四个角，将其半永久性地固定在载玻片上。使用200微升移液器，缓慢将70%甘油从通道一端加入，以完全填充通道及盖玻片下方区域。用指甲油沿盖玻片的四边封固已固定的样品。在对样品进行成像前，需确保指甲油充分干燥。从一个含有300只交配后成年雌蚊的笼中收集胚胎，待其发育至所需阶段后，将胚胎从收集容器转移至用于八十年代胚胎的特氟龙网筛捕获管中。将收集管放入一个烧杯中，烧杯内加入足量的蒸馏水，使收集管内的液面达到其体积的一半。使用画笔将胚胎从特氟龙网膜上轻轻刷下，并转移至盛有水的收集管中。对于难以脱落的胚胎，可将特氟龙网膜从收集容器上取下，小心折叠成漏斗状，用一只手握住该网膜漏斗。用另一只手将水沿漏斗壁冲洗，以将胚胎冲入收集管中。该方法适用于异常胚胎，因为这些胚胎缺乏八细胞期胚胎表面存在的黏附物质，而这种物质能使卵附着在上方位置的基质上。准备40毫升的脱胶溶液，并将溶液倒入100毫米的培养皿中。向100毫升烧杯中加入50毫升蒸馏水，备用。接下来将胚胎放入盛有脱胶液的培养皿中。使用一次性聚乙烯移液管在轻轻旋转收集管的同时冲洗胚胎，使胚胎始终浸没在脱胶液中并保持搅动状态。脱胶是本实验方案中最敏感的步骤之一，若对80期胚胎使用次氯酸钠处理时间过长，将导致内壳膜无法正常形成。80期胚胎的脱胶时间最长不得超过35秒，而QX品系的胚胎75秒即可完成。在解剖显微镜下以低倍镜观察脱胶效果：80期胚胎应失去网状的外壳膜，仅保留黑色内壳膜光滑发亮的表面；异常胚胎则表现不同。一旦胚胎被包被，外绒毛膜的浮状物和脊状结构将消失。按照书面方案中所述步骤进行固定并破坏内绒毛膜。为剥离已破坏的内绒毛膜，使用大孔径的200微升移液器吸头，将一小片双面假发胶带置于直径三厘米的培养皿中央。将胚胎从甲醇转移至双面胶带上。静置一到两分钟，使胚胎沉降并粘附于胶带表面，倾去多余的甲醇，并让表面略微干燥一到两分钟。然后向培养皿中加入95%乙醇以进一步固定胶带上的胚胎，用移液器加入600 µL蒸馏水至乙醇中，轻轻涡旋混合。接下来，使用连接在1毫升注射器筒上的27.5号针头剥离破裂的内壳膜。用细尖的艺术家画笔将白色胚胎从黑色的内壳膜残余中释放后，立即将胚胎从胶带转移至培养皿的乙醇储液区。然后使用3毫米移液器吸头将胚胎转移至含有500微升100%乙醇的1.5毫升微量离心管中，最后用100%乙醇洗涤胚胎2至3次，并将胚胎置于穿孔的乙醇中，在-20摄氏度下保存。在本图中，对雌性埃及伊蚊（Aedes aegypti）整体封片唾液腺进行C两杂交实验，使用靶向淀粉酶1D7S2和D7L2的mRNA探针，结果显示这些转录本分别在近端侧叶、远端侧叶和远端侧中叶中积累。在本实验中，三种蚊虫物种的整体封片组织切片与特异性靶向各自同源Oscar转录本的mRNA探针进行杂交。此处对冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）和致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）的整体封片胚胎进行了C两杂交实验，采用靶向各自蚊虫Oscar同源转录本的反义RNA探针。观看本视频后，您应能充分理解如何在 C two 实验中进行杂交，以确定转录本在特定蚊虫组织或胚胎中的定位与积累情况。

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