一种经过抛光和加固的减薄颅窗，用于小鼠大脑的长期成像

本实验的总体目标是在小鼠大脑皮层上制备一个稳定的薄颅窗，以实现对颅内环境无干扰的重复成像。首先安装头部固定装置，使动物头部能够在成像设备下稳定固定。随后，在大脑背侧表面的特定区域小心地磨薄颅骨，并使用细砂打磨颅骨表面。

然后用少量氰基丙烯酸酯胶水和盖玻片覆盖窗口，以加固窗口。最后一步是为动物进行双光子显微镜成像做准备。最终通过活体双光子显微镜可观察到精细结构，例如动脉、静脉毛细血管和神经元树突，可在数周时间内对皮层深度达250微米的结构进行成像。

该颅窗技术的主要优势在于覆盖大脑皮层的颅骨未被移除。首先，我们通过将颅骨磨薄以获得光学透明性，然后使用氰基丙烯酸酯胶水和盖玻片对颅骨进行加固。该方法适用于在麻醉状态或清醒自由活动状态下研究多种荧光转基因小鼠。

开始此操作时，先将所需的手术器械进行高压灭菌，然后根据随附文稿中的方法对一只约三至六周龄的小鼠实施麻醉。通过脚趾夹捏检查其反射，以确认小鼠已达到手术所需的麻醉水平。接着，将小鼠固定于立体定位仪中。

将小鼠体温维持在37摄氏度。使用反馈调节的直肠探针和加热垫。在其眼睛上涂抹眼用软膏以保持湿润。

然后使用小型电动剃刀剃除头皮毛发。随后用聚维酮碘清洁头皮，再用70%异丙醇擦拭。接着在显微镜下将一份无菌人工脑脊液预热至37摄氏度。

使用手术剪从整个颅骨背侧表面去除头皮。沿颅骨两侧横向修剪皮肤，直至颞肌边缘，并向后修剪至颈部肌肉区域。接着，使用手术刀片去除颅骨表面的薄层骨膜。

然后干燥并清洁颅骨。接着，在颅骨表面涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水。待胶水彻底干燥。

该胶层对于牙科水泥的正确粘附至关重要。在后续步骤中，进行清醒成像准备时，在对侧颅骨表面钻孔并植入两枚0 0 0号自攻螺钉。

然后将一个带有两个固定点的刚性定制连接器连接到颅骨上。这能显著减少自由度，并简化在纵向研究中对同一成像区域的重新定位。宽大的横杆也为电极放置和振动刺激提供了充足空间。

接下来，用一层牙科水泥覆盖整个颅骨表面，但避开窗口位置，确保皮肤所有暴露的边缘均被水泥覆盖。在磨薄颅骨之前，确保钻头锋利，避免重复使用。使用牙科钻机以低速在体感皮层上方磨薄一个 2 毫米 × 2 毫米的区域，钻头直径为 0.5 毫米。

然后，使用颅骨钻每次仅对颅骨表面进行数秒的磨薄，并定期滴加脑脊液（CSF）以防止过热。随后进一步减慢钻头转速，以极轻微的接触方式刮削颅骨表面。

钻头应以与垂直方向约30度的角度接近骨面。继续减薄骨质，穿过血管层，进入颅骨第二层。位于脑表面之上。

使用钻头时动作要小且受控，仅在横向施加力量。当骨层厚度约为 50 微米时，透过湿润的骨组织应能清晰看到剥离的血管。在此深度，骨组织内会出现微小的白色斑点，持续数秒后消失。

当干燥的颅骨表面湿润后，最终的骨层厚度应约为 10 至 15 微米。当骨层足够薄时，干燥颅骨表面湿润后骨中的小白点将不再可见。此时，用氧化锡粉末抛光窗口。

取少量粉末，用量约为窗口面积的四分之一，使用带有硅胶刷头的预制成型钻头在脑脊液（CSF）中搅拌形成浆液。对表面抛光 10 分钟，彻底冲洗掉窗口上的氧化锡粉末并擦干骨骼。该过程有助于减少钻头在骨片减薄过程中留下的任何粗糙边缘。

接下来，用零号盖玻片裁剪出若干略小于窗口尺寸的方形小片。使用划痕笔在盖玻片上轻轻划出相互分离的水平线和垂直线，然后用直边工具沿划线处轻轻滑动，使盖玻片分离而不破碎。

然后将盖玻片放入培养皿中。通过将培养皿轻敲桌面边缘使玻璃碎片分离。随后，使用折断的棉签木制尖端，在窗口处涂抹少量 Sano ACRL 胶水。

迅速将预先切割好的盖玻片放置在胶水上方。待胶水充分干燥15分钟后，避免在盖玻片下方产生气泡。使用手术刀片去除盖玻片上表面多余的氰基丙烯酸酯胶。

用牙科水泥密封窗口的边缘，然后在末端形成一个略高的储水区，用于盛放浸没式物镜的水。将动物置于温暖的笼子中，直至其完全从麻醉中恢复。

在此步骤中，将动物固定在光学面包板上以进行成像，并使用框架作为头部支撑。我们独立的载板可将动物及所有生理监测设备作为一个整体单元，在手术位置与双光子成像位置之间进行转运。若需进行血流成像，可通过眶下静脉注射 0.05 毫升 5% 荧光葡聚糖染料，以标记血液血清。

此操作必须在全身麻醉下进行，染料通常在血液循环中保留数小时。每两小时通过腹腔注射乳酸林格氏液，剂量为每克体重3微升，以维持体液和能量需求。通过停止异氟烷麻醉使小鼠苏醒。

清醒后一小时，小鼠即可进行成像。关闭显微镜上方的笼子以防止光线污染。图中显示的是YFP小鼠大腿皮层血管系统的一个示例，通过静脉注射结合了德克萨斯红的葡聚糖标记。硬脑膜中的血管通常可见于皮层表面稍上方的硬脑膜中。

大的穿支动脉和静脉位于皮层表面。穿通血管由此表面血管网分支而出，深入皮层，并进一步分支形成致密的毛细血管床，为皮层组织提供血液供应。本视频展示了清醒小鼠皮层表面的血管结构。

当动物处于安静的静息状态时，可观察到动脉直径的自发性振荡。该方法可用于研究多种荧光转基因动物在麻醉或清醒状态下的情况。