Name: 染色质免疫沉淀（ChIP）使用果蝇组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学习使用果蝇组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）的方法，通过高通量测序技术准确评估体内染色质状态。该技术为研究基因调控机制提供了可靠的实验框架。

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作者谨此感谢美国国立卫生研究院/国立心肺血液研究所（NIH/NHLBI）Keji Zhao 博士实验室在提供测序结果方面给予的帮助。同时，我们还要感谢加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组项目提供基因组浏览器，用于可视化比对后的测序读段。
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）独立之路奖R00HD055052、美国国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）R01HD065816项目、Lucile Parkard基金会以及约翰斯·霍普金斯大学启动资金对X.C.的资助。

（整个ChIP实验过程大约需要两天时间。用于高通量测序的ChIP文库构建还需额外2-3天。）
1. 解剖并制备用于ChIP实验的组织（约100万个细胞）
<ol>
 <li>在冷 PBS + 1×蛋白酶抑制剂（将1片蛋白酶抑制剂混合物溶于1.5 mL 1×PBS中，配制成7×储存液）+ PMSF（终浓度为100 μg/mL）中解剖目标组织（例如200对Drosophila睾丸）。用上述缓冲液清洗组织两次，然后将组织重悬于200 μL含抑制剂的相同PBS溶液中。</li>
 <li>为固定样品，加入5.5 μL 37%甲醛（使用前在37 °C水浴中预热1分钟）。在37 °C孵育15分钟，期间每5分钟涡旋混匀一次。</li>
 <li>将样品置于冰上，使组织沉降2分钟。用450 μL PBS（含蛋白酶抑制剂和PMSF）清洗两次。样品现可储存于-20 °C。可重复多次解剖以获得足够的ChIP实验材料。</li>
</ol>
2. 为染色质免疫沉淀（ChIP）实验制备含蛋白质-DNA 复合物的上清液
<ol>
 <li>将步骤1.3中足量的样品加入一个1.75 mL离心管中。</li>
 <li>从组织样本中移除 PBS。添加 200 μL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6，1 mM CaCl2，0.2% Triton X-100 或 NP-40，5 mM 丁酸钠，以及 1× 蛋白酶抑制剂混合物）。向裂解缓冲液中加入新鲜的 PMSF 储存液（PMSF 终浓度为 0.5 mM）。使用蓝色匀浆器（Fisher Cat# 749521-1590）充分匀浆，直至组织完全解离且无任何聚集，于室温（RT）孵育 10 分钟。</li>
 <li>超声处理：使用微探头超声仪（Misonix HS-XL200），功率设为20。超声10秒，冰上静置50秒，重复4–5次（最佳超声时间需根据经验确定，较长的超声时间会产生更小的片段）。在使用针对组蛋白修饰抗体的ChIP实验中，通常将染色质超声至约200–300 bp；对于转录因子或染色质调控蛋白（如Polycomb蛋白）的ChIP，则通常将染色质超声至200–1000 bp。然而，最佳片段大小应通过实验经验确定。注意：超声过程中也必须始终将离心管置于冰上，以防止样品过热！</li>
 <li>加入1.8 mL RIPA缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.6，1 mM EDTA，0.1% SDS，0.1% 脱氧胆酸钠，1% Triton X-100，含蛋白酶抑制剂和PMSF，浓度与前文所述相同）稀释样品。保存 40 μL 作为输入对照，通过添加 2 μL 5M NaCl，孵育于 65 °C 过夜（O/N）以逆转交联。</li>
 <li>将抗体与磁珠偶联时，加入 40 μL 将蛋白A磁珠加入一个1.5 ml离心管中，然后添加 600 μL PBS 和岩石在 4 °C 2 分钟后，将磁珠置于磁力架上，移除上清液。加入 100 μL PBS 和目标抗体（抗体用量需通过实验确定）。室温孵育 1 小时或 4 °C 4小时。</li>
 <li>用磁铁去除珠子上的上清液，向珠子中加入1 mL来自步骤2.4的染色质提取物。旋转孵育于 4 °C 过夜</li>
 <li>将ChIP样品置于磁力架上，弃去上清液。用以下缓冲液洗涤磁珠 4 °C 每次10分钟： 
 2 次，每次使用 1 mL RIPA 缓冲液 [1.89 mL 'RIPA 缓冲液' + 315 μL 7x 蛋白酶抑制剂 + 20 μL PMSF 
 用 1 mL RIPA 缓冲液 + 0.3 M NaCl 洗涤 2 次 [1.89 mL RIPA 缓冲液 + 220 μL 3 M NaCl 
 用 1 mL 的 LiCl 缓冲液（0.25 M LiCl，0.5% NP40，0.5% NaDOC）洗涤 2 次； 
 1 次，每次使用 1 mL 1x TE + 0.2% Triton X-100 
 1 次，每次 1 mL 1× TE 缓冲液。 </li>
 <li>为逆转交联，将珠子重悬于 100 μL TE 缓冲液 + 3 μL 10% SDS + 5 μL 蛋白酶K（20 mg/mL）。于 65 °C 过夜</li>
 <li>将珠子置于磁铁上，转移上清液至新管中。上清液含有您的DNA样本。用 100 μL TE + 0.5 M NaCl 并合并两次上清液。</li>
 <li>酚-氯仿抽提DNA样品。加入 200 μL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混合后涡旋振荡。室温下14,000 × g离心5分钟。或者，可使用Qiagen PCR纯化试剂盒提取DNA。</li>
 <li>将上清液/水相转移至新离心管中，加入线性聚丙烯酰胺至终浓度为 20 μg/mL （或者 1 μL 每1 mL上清液可加入20 mg/mL的糖原。糖原用于后续的qPCR或PCR分析，而线性丙烯酰胺用于测序实验。加入 20 μL 3 M NaOAc 500 μL 100% 乙醇。充分混匀，于指定条件下孵育 80 °C 10 分钟。在最大转速下离心 20 分钟，温度为 4 °C.</li>
 <li>移除上清液并用 300 μL 70% EtOH。空气干燥后，将样品重悬于 50 μL TE 缓冲液。样品现可于 -20 °C. 样品可用于定量PCR（qPCR）检测（图1).</li>
</ol>
3. 分析 ChIP 富集的 DNA
3a. 使用 qPCR 分析 ChIP 获得的 DNA
<ol>
 <li>将基因组DNA按以下浓度稀释以制作标准曲线：未稀释、1/10、1/100、1/1000、1/5000。</li>
 <li>针对每对引物，在96孔板中设置两个复孔进行qPCR，分别加入步骤3a.1中的基因组DNA、input对照以及ChIP后的DNA： 
 10 μL 2x SYBR PCR mix（Fermentas，K0222）； 
 1 μL 10 μM 上游引物； 
 1 μL 10 μM 反向引物； 
 x μL ChIP富集的DNA（输入对照或基因组DNA）； 
 y μL 无核酸酶的 H2O 以调整反应体系的体积至 20 μL. </li>
 <li>使用Mini plate spinner（Labnet）离心96孔板。</li>
 <li>使用 ABI 7300 实时 PCR 系统（或其他实时 PCR 系统）按照以下条件进行 qPCR： 
 第1阶段： 50 °C 2 分钟，1 个循环； 
 第二阶段： 95 °C 10 分钟，1 个循环； 
 第3阶段： 95 °C 15 秒 60 °C 1 分钟，40 个循环； 
 第4阶段（解离阶段）： 95 °C 15 秒 60 °C 1 分钟， 95 °C 15 秒。 </li>
 <li>检查解离曲线：熔解曲线图中出现单个峰表明PCR反应产生单一扩增产物；若出现多个峰，则提示引物对存在非特异性扩增，此时不应使用该qPCR数据。</li>
 <li>通过计算基于3a.1中系列稀释基因组DNA标准曲线的Ct值（循环阈值）来确定每对引物PCR反应指数扩增的线性阶段，从而推导出根据Ct值计算DNA量的公式。</li>
 <li>如果ChIP DNA和input对照的Ct值处于Ct值的线性范围内，则根据2.4步骤中ChIP DNA与input对照的稀释倍数，计算ChIP DNA相对于input的富集倍数。</li>
</ol>
3b. 对染色质免疫沉淀的 DNA 进行扩增，用于高通量测序。
<ol>
 <li>ChIP-ed DNA 混合物的末端修复（使用 Epicentre DNA END-Repair 试剂盒），在冰上配制如下反应体系： 
 步骤 2.12 中获得的基因组 DNA 1-34 μl（0.1 至 5 μg） 
 10× End repair 缓冲液 5 μl 
 2.5 mM dNTP 混合液 5 μl 
 10 mM ATP 5 μl 
 H2O x μl，补足反应体系至 49 μl 
 End-Repair 酶混合液（T4 DNA 聚合酶 + T4 多核苷酸激酶）1 μl 
 室温孵育 45 分钟。使用 Qiagen MinElute 反应纯化试剂盒纯化反应产物，用 30 μl 洗脱缓冲液（EB）洗脱。 </li>
 <li>在 3' 端添加 A 突出末端： 
 步骤 3b.1 中洗脱的 DNA 产物 30 μl 
 10× NEB Buffer #2 5 μl 
 1 mM dATP 10 μl 
 dH2O 2 μl 
 Klenow 片段（3'→5' 外切酶缺陷型），5 U/μl 3 μl 
 37 °C 孵育 30 分钟。使用 MinElute 反应纯化试剂盒纯化反应产物，用 10 μl EB 洗脱。 </li>
 <li>Solexa 接头连接： 
 步骤 3b.2 中洗脱的 DNA 10 μl 
 ddH2O 10 μl 
 10× T4 DNA 连接酶缓冲液 2.5 μl 
 Illumina 提供的接头寡核苷酸混合物（原液稀释 10 倍）1 μl 
 T4 DNA 连接酶（400 单位/μl）2.5 μl 
 室温孵育 1 小时。使用 MinElute 反应纯化试剂盒纯化反应产物，用 20 μl EB 洗脱。样品现可保存于 -20 °C。 </li>
 <li>使用 E-gel 装置对步骤 3b.3 中洗脱的 DNA 样品进行电泳。从凝胶中切下 300-500 bp 的条带，并使用 Qiagen 凝胶回收试剂盒进行纯化（此步骤可去除接头连接过程中形成的约 125 bp 的自连接接头）。用 12 μl EB 洗脱。 </li>
 <li>使用 Illumina 提供的成对末端（PE）引物扩增文库： 
 步骤 3b.4 中洗脱的 DNA 10.5 μl 
 2× Phusion HF 主混合液（Finnzymes）12.5 μl 
 PE1 PCR 引物 1 1 μl 
 PE2 PCR 引物 2 1 μl 
 PCR 反应条件： 
 98 °C 预变性 30 秒 
 （98 °C 变性 10 秒，65 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒），重复 20 个循环 
 72 °C 最终延伸 5 分钟。 </li>
 <li>步骤 3b.5 中的样品可通过标准 2% 琼脂糖凝胶选择适当大小的 DNA（300-500 bp）后用于 ChIP-seq 分析。样品现可保存于 -20 °C。为避免交叉污染，建议每个 ChIP 样品单独跑胶。样品可提交进行高通量测序。</li>
</ol>
3c. Solexa 流程分析
<ol>
 <li>从 Illumina Genome Analyzer (GA) 流程中获得 25-bp 的测序读段。</li>
 <li>使用 ELAND（高效局部核苷酸序列比对）软件将所有读段比对至黑腹果蝇（Drosophila）基因组（dm3），允许与参考序列最多两个错配。</li>
 <li>保留唯一比对的读段用于后续分析。对于多个完全相同的读段，最多保留三个拷贝，以降低 PCR 扩增引入偏差的可能性。</li>
 <li>将 GA 流程的输出结果转换为浏览器可扩展数据（BED）文件。</li>
 <li>为生成用于上传至 UCSC 浏览器进行可视化的 wig 文件，我们使用了一个此前文献3中描述的 Python 脚本，窗口大小设为 4 bp，DNA 片段大小设为 160 bp。</li>
 <li>为将黑腹果蝇（Drosophila）基因分类为沉默基因和表达基因，我们使用了一种称为 RPKM（每千碱基合并外显子区域每百万比对读段数）的数字指标。RPKM = 0 的基因归类为沉默组，RPKM ≥ 1 的基因归类为表达组；表达组可进一步分为低、中、高表达水平三个亚组，每组包含大致相同数量的基因。</li>
 <li>为比较组蛋白修饰水平与基因表达水平，我们使用了一个此前文献3中描述的 Python 脚本。</li>
</ol>
4. 典型结果
使用bam (bag of marbles)突变型睾丸进行ChIP-qPCR实验的结果示例如图14所示。在bam突变型睾丸中，精原细胞无法从增殖状态转变为分化状态的精母细胞5, 6。我们利用bam突变型睾丸作为未分化生殖细胞的来源，因为这类细胞在此组织类型中富集。在bam突变型睾丸中，精子分化所必需的分化相关基因（如male-specific transcription factor 87（mst87F）、don juan（dj）和fuzzy onion（fzo））均不表达。这些基因在染色质上表现出高水平的抑制性组蛋白修饰H3K27me37（图1A），但缺乏活性组蛋白修饰H3K4me38（图1B），这种染色质修饰模式被称为“单价”（monovalent）7。H3K27me3或H3K4me3的富集程度是通过与组成型表达的周期蛋白A（Cyclin A, CycA）基因进行归一化分析确定的4。
使用相同的一组抗体（即抑制性标记 H3K27me3 和活性标记 H3K4me3）进行 ChIP-seq 分析， bam 突变型睾丸（图2) 验证了图中所示的 qPCR 结果 图1. 对于三种经测试的终末分化基因 mst87F，dj 和 fzo，它们的基因组区域富含H3K27me3，但不含H3K4me3（图 2A-2C）。相比之下，组成型表达的 CycA 基因在其转录起始位点（TSS）附近具有显著的 H3K4me3 修饰，但几乎无 H3K27me3 结合（图 2D).
此外，四种不同表达基因类别在转录起始位点（TSS）附近H3K27me3和H3K4me3的ChIP谱图与各自组蛋白修饰的功能一致。如图3A所示，TSS下游H3K27me3的富集程度与基因表达水平呈负相关。沉默基因的H3K27me3水平最高，而高表达基因则无H3K27me3结合。这些数据与H3K27me3在基因表达中的抑制作用一致。相反，TSS周围H3K4me3的富集表现出与基因表达水平的正相关关系（图3B），符合H3K4me3在基因表达中的激活作用。
<img alt="H3K27me3 和 H3K4me3 ChIP 柱状图；相对于 CycA 的 mst87F、dj、fzo、cyca 基因富集情况。" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 利用针对抑制性组蛋白修饰 H3K27me3（A）或活性组蛋白修饰 H3K4me3（B）的抗体，对富集未分化细胞的 bam 突变型睾丸中进行 ChIP-DNA 的 qPCR 分析。（A）在 bam 睾丸中，分化相关基因（Mst87F, dj, fzo）富集了抑制性组蛋白修饰 H3K27me3。（B）分化相关基因中 H3K4me3 活性标记水平降低。目标基因（Mst87F, dj 或 fzo）处的 ChIP DNA（ChIP DNA/input）水平首先以对照基因 CycA 处的 ChIP DNA 水平进行标准化。误差线表示三次独立生物学重复实验的标准差。
<img alt="H3K27me3/H3K4me3在基因区域的ChIP-seq示意图；组蛋白修饰的数据可视化。" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. H3K27me3和H3K4me3在整个基因组区域富集情况的UCSC基因组浏览器快照：(A) Mst87F、(B) dj、(C) fzo 和 (D) CycA 基因。 图(D)中圈出的H3K27me3富集区域反映了重叠基因CG7264的染色质状态，该基因在bam睾丸中表达水平较低（RPKM=1），而在野生型睾丸中表达水平较高（RPKM=130）8（ChIP-seq数据来自7）。图1中ChIP结果的定量PCR分析所用引物在各图底部标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="H3K27me3 ChIP-seq 基因表达谱；图表显示修饰水平与转录起始位点（TSS）位置的关系。" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 在 bam 精巢中使用 H3K27me3 和 H3K4me3 进行 ChIP-seq 分析7。根据 RNA-seq 结果8，将4组基因（共7,509个基因）按其基因表达水平进行分类。针对每组基因，绘制其转录起始位点（TSS）上游3 kb至下游3 kb序列范围内特定组蛋白修饰的富集情况。由此生成各组中（A）H3K27me3（K27）和（B）H3K4me3（K4）ChIP-seq 分析的富集谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。

<ol><li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li>
<li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li>
<li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li>
<li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles%3A+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li>
<li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li>
<li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本方案中讨论的ChIP分析的多功能性可用于不同组织，从而为在具有生物学相关性的系统中研究染色质状态提供了机会。使用培养系统中的细胞进行ChIP实验操作方便，因为可轻松获得大量细胞。然而，培养细胞未必能反映多细胞环境中的真实细胞状态。通过利用活体动物分离的组织开发该技术，我们可以解答许多培养细胞无法回答的问题。
尽管本方案具有实用性，但仍存在一些注意事项。例如，所分离的组织仍含有多种不同类型的细胞，具有异质性。虽然可获得相对均一的细胞，但 黑腹果蝇 组织如成虫盘，以及其他含有有限数量成体干细胞的组织，如肠道、睾丸和卵巢，均具有异质性。这一复杂性可通过使用强大的 果蝇 遗传学。例如，尽管成体干细胞在上述组织中仅以少量群体存在，且极难分离出足够数量用于ChIP分析，但可通过遗传突变背景来富集干细胞群体。 bam 基因对于干细胞分化是必需的 果蝇 生殖系谱系5,6因此 bam 突变型性腺是富集未分化生殖细胞的良好来源。通过使用ChIP方法 bam 突变体，我们能...

<table><tbody><tr><td>完全型微型蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（37%）</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>47083-U</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 组织研磨杵</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>线性聚丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56575-1ML</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green/ROX qPCR 预混液</td><td>Fermentas</td><td>K0223</td><td></td></tr><tr><td>微型离心板旋转器</td><td>Labnet International</td><td>Z723533</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351101</td><td></td></tr><tr><td>小体积超声波处理器</td><td>Misonix</td><td>HS-XL2000</td><td>型号已停产</td></tr><tr><td>Dynabeads 蛋白 A 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>100-01D</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag 磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre DNA 末端修复试剂盒</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>ER0720</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 反应纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>Klenow 片段（3&amp;rsquo;&amp;#8594;5&amp;rsquo; 外切酶缺陷型）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Promega Corp.</td><td>M1794</td><td></td></tr><tr><td>接头寡核苷酸</td><td>Illumina</td><td>PE-400-1001</td><td></td></tr><tr><td>成对末端引物 1.0 和 2.0</td><td>Illumina</td><td>1001783 1001 784</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel 电泳系统</td><td>Invitrogen</td><td>G6512ST</td><td></td></tr><tr><td>2× Phusion HF 预混液</td><td>Finnzymes</td><td>F-531</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 drosophila 组织进行染色质免疫沉淀（chip）

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

表观遗传学是一个快速发展的研究领域，致力于探索染色质状态如何在不同发育阶段的各类细胞类型中导致基因表达的差异。表观遗传调控参与多种生物学过程，包括胚胎发育过程中的细胞分化以及成年期的稳态维持。表观遗传学研究的一项关键策略是探究各种组蛋白修饰和染色质因子如何调控基因表达。为实现这一目标，染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）技术被广泛用于获取特定因子在目标细胞中与DNA结合情况的快照。
ChIP 技术通常使用培养细胞作为起始材料，这类细胞易于大量获取且具有较高均一性，可产生可重复的数据。然而，该方法存在若干局限性：首先，培养皿中细胞生长的环境与体内环境存在差异 体内因此可能无法反映活体生物细胞中内源性的染色质状态。其次，并非所有类型的细胞都能进行培养 离体可用于ChIP实验的细胞系种类有限，人们难以从中获得足够的材料。
在此，我们介绍一种使用ChIP实验的方法 果蝇 组织。起始材料来自活体动物的解剖组织，因此能够准确反映内源性染色质状态。该方法适用于多种不同类型的组织，可使研究人员解决更多与表观遗传调控相关的生物学问题 体内1, 2将该方法与高通量测序技术（ChIP-seq）相结合，可进一步使研究人员获得表观基因组全景图谱。

近年来，高通量测序技术显著提高了染色质免疫沉淀（ChIP）实验的灵敏度，并推动了其在纯化细胞或显微解剖组织中的应用。本文详细阐述了一种在Drosophila组织中使用ChIP技术的方法，该方法可用于研究在一个生物学特征明确的系统中内源性染色质状态。

使用 Drosophila 组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）

表观遗传学仍然是一个快速发展的领域，研究染色质状态如何在不同细胞类型中导致基因表达的差异，以及这种调控在发育、疾病和环境响应中的作用。

该实验流程通过解剖果蝇组织获取染色质免疫沉淀数据，以准确反映体内果蝇组织中的染色质状态。在此过程中，通过手工解剖收获数百个睾丸组织。使用针对目标蛋白的抗体进行染色质免疫沉淀实验。通过定量 RT-PCR 分析检测纯化的 ChIP-DNA 中特定基因组区域的富集情况。或者，对芯片样品进行高通量测序可获得全基因组范围的分析谱型。最终，对显微切割组织进行 ChIP 分析能够反映细胞在生理条件下染色质的真实状态。本方案经过优化，适用于直接从生物体分离的组织分析。为了在真实的生理条件下获取染色质状态和表观遗传信息，我们将以果蝇为例，演示染色质免疫沉淀（ChIP）技术的应用，以检测染色质状态。该方案也可应用于其他生物体，如小鼠或斑马鱼。本方案的可视化演示对于获得适用于芯片分析或高通量测序文库构建的足量且高质量的DNA至关重要。首先，在含有蛋白酶抑制剂和100微克/毫升PMSF的冷PBS中解剖目标组织，本例中为约200对果蝇睾丸。组织用PBS洗涤两次后，加入200微升含抑制剂的相同PBS溶液重悬。然后加入5.5微升预热的37%甲醛固定样品，在37摄氏度孵育15分钟，每5分钟涡旋震荡一次，之后将组织置于冰上静置沉降。用含有抑制剂的450微升PBS冲洗两次。将样品储存在-20摄氏度。将200个oph睾丸样品合并至一个1.75毫升的einor管中。吸去缓冲液，将样品重新悬浮于 200 µL 裂解缓冲液中。使用蓝色匀浆器彻底解离组织，确保无任何聚集体残留，在室温下孵育 10 分钟。然后使用微芯片进行样本片段化处理，冰上静置50秒。重复四到五次，以获得适合芯片目标的最优片段大小。随后加入1.8毫升裂解缓冲液稀释，制备染色质提取物储备液。对于成功的染色质免疫沉淀实验，通过实验确定DNA片段的大小至关重要。因此，我们需要进行凝胶电泳，以推进芯片实验的进行。对于输入对照样本，移除50 µL。加入2 µL的5 M氯化钠，并在65 °C下孵育过夜。为逆转交联，需将抗体与蛋白质进行偶联。取一个1.5毫升的微量离心管，加入40微升蛋白A磁珠和600微升PBS缓冲液，于4摄氏度轻轻摇动孵育2分钟。然后将磁珠置于磁力架上，弃去上清液。加入100 µL PBS以及目标抗体，室温孵育1小时。磁力分离收集珠子后，加入1毫升组织染色质提取物，在4°C旋转孵育过夜。接着将ChIP样品置于磁力架上，移除上清液。将收获的磁珠在4°C SIUs下进行洗涤，每次1毫升，每次洗涤10分钟，随后将磁珠重悬于100微升TE缓冲液中。为逆转蛋白质-DNA复合物的交联，加入3微升10% SDS和5微升20毫克/毫升蛋白酶K，于65°C孵育过夜。将磁珠置于磁力架上沉淀。将含有DNA的上清液转移至新离心管中。洗涤磁珠一次，并合并含有DNA的上清液。接下来，用苯酚-氯仿抽提法纯化DNA，并将上层水相转移至新的离心管中。加入20微克/毫升的线性聚丙烯酰胺或糖原沉淀DNA，再加入20微升3摩尔/升的醋酸钠和500微升100%乙醇。充分混匀后，在负80摄氏度下孵育10分钟。通过离心收集DNA。弃去上清液，加入300微升70%乙醇洗涤沉淀一次，空气干燥后保存。重悬DNA沉淀物：将DNA沉淀物重悬于50 µL TE缓冲液中。将剪切后的DNA样本储存于-20 °C。为标准曲线制备基因组DNA的系列稀释液。在96孔板中，使用稀释的基因组DNA输入对照或染色质DNA模板，设置20微升的QPCR反应，每个样本设两个复孔，在迷你板旋转器上离心96孔板。将样本板放入实时PCR系统中运行，以验证数据。首先，通过熔解曲线分析确认是否存在单一峰，表明PCR产物为单一扩增子。接下来，绘制标准曲线。利用系列稀释的基因组 DNA 的数据，计算根据扩增循环阈值（Ct）确定 DNA 量的公式。同时确定每对引物扩增的 PCR 指数增长的线性阶段。如果芯片DNA和输入对照样本的CT值处于CT值的线性范围内，则计算芯片DNA相对于输入DNA的富集倍数。末端修复的稀释因子为在50微升反应体系中加入0.1至5微克的片段化DNA，反应体系包含T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶。按照制造商说明书，在室温下孵育45分钟。然后使用 MinElute 反应纯化试剂盒纯化 DNA。接着，在 37 摄氏度下，加入 DNA 聚合酶、一个大片段 CLA NOW 和 dATP，对 3' 末端添加突出端，孵育 30 分钟。再次将反应液通过离心柱纯化并浓缩 DNA。加入接头引物进行连接反应。使用T4 DNA连接酶（来自Illumina的混合物），在室温下孵育1小时。然后使用MinElute反应纯化试剂盒对样品进行纯化。用20微升洗脱DNA。接着，使用egel电泳装置对DNA样本进行电泳分离。切取凝胶中200至400碱基对的条带，并使用KYOGEN凝胶回收试剂盒进行纯化。现在使用成对末端引物，结合Illumina程序中的HF和pH酶进行20个PCR循环，扩增文库。随后在标准的2%琼脂糖凝胶上分离200至400个碱基对的DNA片段，用于在Ellen's软件中进行高通量测序。将所有测序读段比对至黑腹果蝇基因组，允许与参考序列最多存在两个错配。为多个相同的序列保留唯一比对的读段，用于后续分析。最多保留三个拷贝，以减少PCR扩增带来的偏差。接下来，使用Python脚本将GA分析流程的输出结果转换为浏览器可扩展数据文件。设置一个四碱基对的窗口大小和一个160碱基对的DNA片段大小。根据RPKM将果蝇基因分类为沉默基因和表达基因。数字编号，指定RPKM等于零的基因。作为一个沉默基因组，将 RPKM 值大于 1 的基因归类为表达基因组，并进一步分为低、中、高三个表达水平亚组。最后，使用先前在 basal 2007、bag of marbles 中描述的 Python 脚本比较组蛋白修饰与基因表达水平。bag 基因突变型睾丸在精原细胞由增殖向分化转变的过程中出现障碍。该芯片QPCR实验以BAM睾丸作为未分化生殖细胞的来源，检测精子分化关键基因的染色质状态，以及组蛋白修饰——组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）或组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）的富集情况。通过归一化至组成型表达的细胞周期基因cycling，确定分化相关基因的表达水平。分化相关基因包括雄性特异性转录因子87（male specific transcription factor 87）、Don Juan和fuzzy onion，这些基因在BAM睾丸中不表达，且富含抑制性组蛋白修饰H3K27me3。此外，它们缺乏活性组蛋白。三号组蛋白赖氨酸4三甲基化修饰，这种染色质标记被称为单价态，以区别于同时具有三号组蛋白赖氨酸4三甲基化和三号组蛋白修饰的多价态。在胚胎干细胞中，分化相关基因富集了27位赖氨酸三甲基化修饰。使用相同抗体组进行的染色质免疫沉淀测序数据证实了图1A中染色质免疫沉淀定量PCR的结果：所有三个检测的终末分化基因的基因组区域均高度富集三甲基化修饰的赖氨酸27，但不富集组蛋白3赖氨酸4三甲基化修饰。相比之下，组成型表达的细胞周期蛋白衰老基因在其转录起始位点附近具有较高的组蛋白H3赖氨酸4三甲基化水平，但组蛋白H3赖氨酸27三甲基化水平较低。该图显示了四种不同表达基因类别在转录起始位点附近的两种组蛋白修饰的ChIP-seq数据。组蛋白H3赖氨酸27三甲基化在转录起始位点下游富集，且其富集程度与基因表达水平呈负相关。沉默基因表现出最高的组蛋白H3K27me3水平，而高表达基因则无组蛋白H3K27me3结合，这与组蛋白H3K27me3在基因表达中的抑制作用一致。相反，组蛋白H3K4me3修饰在转录起始位点周围的富集情况与基因表达水平呈正相关，符合H3K4me3在基因表达中的激活作用。一旦掌握，该技术可在两到三天内正确完成。使用苯酚、氯仿和甲醛时，切勿忘记采取安全防护措施。希望本方案已使您充分理解如何利用染色质免疫沉淀技术来研究体内组织中的染色质景观。

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使用 Drosophila 组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）

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