使用 Drosophila 组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）

该实验流程通过解剖果蝇组织获取染色质免疫沉淀数据，以准确反映体内果蝇组织中的染色质状态。在此过程中，通过手工解剖收获数百个睾丸组织。使用针对目标蛋白的抗体进行染色质免疫沉淀实验。

通过定量 RT-PCR 分析检测纯化的 ChIP-DNA 中特定基因组区域的富集情况。或者，对芯片样品进行高通量测序可获得全基因组范围的分析谱型。最终，对显微切割组织进行 ChIP 分析能够反映细胞在生理条件下染色质的真实状态。

本方案经过优化，适用于直接从生物体分离的组织分析。为了在真实的生理条件下获取染色质状态和表观遗传信息，我们将以果蝇为例，演示染色质免疫沉淀（ChIP）技术的应用，以检测染色质状态。该方案也可应用于其他生物体，如小鼠或斑马鱼。

本方案的可视化演示对于获得适用于芯片分析或高通量测序文库构建的足量且高质量的DNA至关重要。首先，在含有蛋白酶抑制剂和100微克/毫升PMSF的冷PBS中解剖目标组织，本例中为约200对果蝇睾丸。组织用PBS洗涤两次后，加入200微升含抑制剂的相同PBS溶液重悬。

然后加入5.5微升预热的37%甲醛固定样品，在37摄氏度孵育15分钟，每5分钟涡旋震荡一次，之后将组织置于冰上静置沉降。

用含有抑制剂的450微升PBS冲洗两次。将样品储存在-20摄氏度。将200个oph睾丸样品合并至一个1.75毫升的einor管中。

吸去缓冲液，将样品重新悬浮于 200 µL 裂解缓冲液中。使用蓝色匀浆器彻底解离组织，确保无任何聚集体残留，在室温下孵育 10 分钟。

然后使用微芯片进行样本片段化处理，冰上静置50秒。重复四到五次，以获得适合芯片目标的最优片段大小。随后加入1.8毫升裂解缓冲液稀释，制备染色质提取物储备液。对于成功的染色质免疫沉淀实验，通过实验确定DNA片段的大小至关重要。

因此，我们需要进行凝胶电泳，以推进芯片实验的进行。对于输入对照样本，移除50 µL。加入2 µL的5 M氯化钠，并在65 °C下孵育过夜。

为逆转交联，需将抗体与蛋白质进行偶联。取一个1.5毫升的微量离心管，加入40微升蛋白A磁珠和600微升PBS缓冲液，于4摄氏度轻轻摇动孵育2分钟。

然后将磁珠置于磁力架上，弃去上清液。加入100 µL PBS以及目标抗体，室温孵育1小时。

磁力分离收集珠子后，加入1毫升组织染色质提取物，在4°C旋转孵育过夜。接着将ChIP样品置于磁力架上，移除上清液。

将收获的磁珠在4°C SIUs下进行洗涤，每次1毫升，每次洗涤10分钟，随后将磁珠重悬于100微升TE缓冲液中。为逆转蛋白质-DNA复合物的交联，加入3微升10% SDS和5微升20毫克/毫升蛋白酶K，于65°C孵育过夜。

将磁珠置于磁力架上沉淀。将含有DNA的上清液转移至新离心管中。洗涤磁珠一次，并合并含有DNA的上清液。

接下来，用苯酚-氯仿抽提法纯化DNA，并将上层水相转移至新的离心管中。加入20微克/毫升的线性聚丙烯酰胺或糖原沉淀DNA，再加入20微升3摩尔/升的醋酸钠和500微升100%乙醇。

充分混匀后，在负80摄氏度下孵育10分钟。通过离心收集DNA。弃去上清液，加入300微升70%乙醇洗涤沉淀一次，空气干燥后保存。

重悬DNA沉淀物：将DNA沉淀物重悬于50 µL TE缓冲液中。将剪切后的DNA样本储存于-20 °C。为标准曲线制备基因组DNA的系列稀释液。

在96孔板中，使用稀释的基因组DNA输入对照或染色质DNA模板，设置20微升的QPCR反应，每个样本设两个复孔，在迷你板旋转器上离心96孔板。将样本板放入实时PCR系统中运行，以验证数据。首先，通过熔解曲线分析确认是否存在单一峰，表明PCR产物为单一扩增子。

接下来，绘制标准曲线。利用系列稀释的基因组 DNA 的数据，计算根据扩增循环阈值（Ct）确定 DNA 量的公式。同时确定每对引物扩增的 PCR 指数增长的线性阶段。

如果芯片DNA和输入对照样本的CT值处于CT值的线性范围内，则计算芯片DNA相对于输入DNA的富集倍数。末端修复的稀释因子为在50微升反应体系中加入0.1至5微克的片段化DNA，反应体系包含T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶。按照制造商说明书，在室温下孵育45分钟。

然后使用 MinElute 反应纯化试剂盒纯化 DNA。接着，在 37 摄氏度下，加入 DNA 聚合酶、一个大片段 CLA NOW 和 dATP，对 3' 末端添加突出端，孵育 30 分钟。再次将反应液通过离心柱纯化并浓缩 DNA。

加入接头引物进行连接反应。使用T4 DNA连接酶（来自Illumina的混合物），在室温下孵育1小时。然后使用MinElute反应纯化试剂盒对样品进行纯化。

用20微升洗脱DNA。接着，使用egel电泳装置对DNA样本进行电泳分离。切取凝胶中200至400碱基对的条带，并使用KYOGEN凝胶回收试剂盒进行纯化。

现在使用成对末端引物，结合Illumina程序中的HF和pH酶进行20个PCR循环，扩增文库。随后在标准的2%琼脂糖凝胶上分离200至400个碱基对的DNA片段，用于在Ellen's软件中进行高通量测序。将所有测序读段比对至黑腹果蝇基因组，允许与参考序列最多存在两个错配。

为多个相同的序列保留唯一比对的读段，用于后续分析。最多保留三个拷贝，以减少PCR扩增带来的偏差。接下来，使用Python脚本将GA分析流程的输出结果转换为浏览器可扩展数据文件。

设置一个四碱基对的窗口大小和一个160碱基对的DNA片段大小。根据RPKM将果蝇基因分类为沉默基因和表达基因。数字编号，指定RPKM等于零的基因。

作为一个沉默基因组，将 RPKM 值大于 1 的基因归类为表达基因组，并进一步分为低、中、高三个表达水平亚组。最后，使用先前在 basal 2007、bag of marbles 中描述的 Python 脚本比较组蛋白修饰与基因表达水平。bag 基因突变型睾丸在精原细胞由增殖向分化转变的过程中出现障碍。

该芯片QPCR实验以BAM睾丸作为未分化生殖细胞的来源，检测精子分化关键基因的染色质状态，以及组蛋白修饰——组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）或组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）的富集情况。通过归一化至组成型表达的细胞周期基因cycling，确定分化相关基因的表达水平。分化相关基因包括雄性特异性转录因子87（male specific transcription factor 87）、Don Juan和fuzzy onion，这些基因在BAM睾丸中不表达，且富含抑制性组蛋白修饰H3K27me3。

此外，它们缺乏活性组蛋白。三号组蛋白赖氨酸4三甲基化修饰，这种染色质标记被称为单价态，以区别于同时具有三号组蛋白赖氨酸4三甲基化和三号组蛋白修饰的多价态。

在胚胎干细胞中，分化相关基因富集了27位赖氨酸三甲基化修饰。使用相同抗体组进行的染色质免疫沉淀测序数据证实了图1A中染色质免疫沉淀定量PCR的结果：所有三个检测的终末分化基因的基因组区域均高度富集三甲基化修饰的赖氨酸27，但不富集组蛋白3赖氨酸4三甲基化修饰。

相比之下，组成型表达的细胞周期蛋白衰老基因在其转录起始位点附近具有较高的组蛋白H3赖氨酸4三甲基化水平，但组蛋白H3赖氨酸27三甲基化水平较低。该图显示了四种不同表达基因类别在转录起始位点附近的两种组蛋白修饰的ChIP-seq数据。组蛋白H3赖氨酸27三甲基化在转录起始位点下游富集，且其富集程度与基因表达水平呈负相关。

沉默基因表现出最高的组蛋白H3K27me3水平，而高表达基因则无组蛋白H3K27me3结合，这与组蛋白H3K27me3在基因表达中的抑制作用一致。相反，组蛋白H3K4me3修饰在转录起始位点周围的富集情况与基因表达水平呈正相关，符合H3K4me3在基因表达中的激活作用。

一旦掌握，该技术可在两到三天内正确完成。使用苯酚、氯仿和甲醛时，切勿忘记采取安全防护措施。希望本方案已使您充分理解如何利用染色质免疫沉淀技术来研究体内组织中的染色质景观。