Name: 放射性的原位杂交检测组织不同的基因表达模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: 学习放射性原位杂交技术检测脊椎动物组织中的基因表达模式。该方法可定量分析mRNA表达水平与空间分布，适用于低丰度转录本检测，为发育生物学研究提供可靠工具。

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作者谨向多年来帮助完善本实验方案的Jarvis实验室所有成员表示感谢。

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

放射性原位杂交技术用于检测mRNA表达，被广泛应用于多种研究目的，包括研究组织的区域结构、细胞类型以及大脑功能活动2-5,10,12-14。后者主要针对那些在脑中mRNA表达依赖于神经元活动增强的基因，这类基因常被称为活动依赖性基因或即早基因。基于这些应用，我们的方法已成功应用于多种物种，包括鸟类、哺乳动物（例如人类）、鱼类和两栖类；多种组织，包括脑、皮肤和肌肉；以及多个发育阶段，包括初生个体、幼体、成体，以及本文所述的全胚胎切片2,3,5,15-17。本实验方案的特殊优势包括：（1）在解剖学特异性和定量特异性之间实现了良好平衡。为在X光胶片上对基因表达进行定量，我们拍摄图像的数码照片（例如：图1A和1B），利用Photoshop（Adobe）的直方图功能测量感兴趣区域的像素密度，并减去玻璃载片上组织以外区域的背景信号值2,4。为在细胞水平上定量表达，我们在高倍镜下（40–100×；图4）拍摄覆盖细胞的银颗粒图像。随后使用美国国立卫生研究院（NIH）Wayne Rasband开发的Image J软件中的阈值和测量功能，统计图像中银颗粒的数量，减去载玻片上无细胞区域的背景计数，再除以细胞数量，从而获得每个细胞的表达值4,18。（2）具有相对较高的通量，可同时处理100–200张载玻片，这得益于矿物油浴形成的紧密盖玻片密封效果。传统的原位杂交方法需使用Parafilm封膜、指甲油或其他方式密封载玻片，操作耗时且占用空间较大；（3）由于杂交缓冲液中含有硫酸葡聚糖和Denhardt溶液，本方法对低丰度转录本具有高度敏感性2,13；（4）暗场成像方法可产生高对比度图像，因其在解剖显微镜下采用暗场照明拍摄图像4,5。此外，该方法能够灵敏地检测基因表达的微小变化，例如通过检测活动依赖性基因的表达，识别在特定行为感知与产生过程中被激活的特定脑区19。与非放射性原位杂交方法相比，本方法的局限性在于后者在细胞分辨率以及mRNA在细胞内定位方面更为清晰，且乳胶膜操作过程对机械扰动和光照极为敏感。本方法可与其他技术联合使用，例如与非放射性原位杂交结合，以在同一组织中同时标记多个基因的mRNA表达10,17,20；也可与免疫细胞化学结合，在同一样本中同时标记RNA和蛋白质表达，从而实现mRNA与特定细胞类型的共定位10。此类双重标记实验所需的方案修改详见所引用的参考文献。
总之，我们的方法有助于理解基因表达的时间和细胞定位，从而阐明区域组织结构、组织功能活性以及基因功能。

<table><tbody><tr><td>乙酸酐</td><td>VWR</td><td>MK242002</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>BDH1109</td><td></td></tr><tr><td>醋酸克雷斯紫</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo scientific</td><td>Microm HM550</td><td></td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td>100mM</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>VWR</td><td>15160-215</td><td></td></tr><tr><td>Fisher品牌 Superfrost plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>VWR</td><td>BDH0506-4LP</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F7508</td><td></td></tr><tr><td>GENECLEAN试剂盒</td><td>Q-Bio gene</td><td>1001-200</td><td></td></tr><tr><td>Kodak BioMax MR胶片</td><td>Sigma</td><td>Z350370</td><td></td></tr><tr><td>Kodak NTB乳胶</td><td>Carestream Health</td><td>8895666</td><td></td></tr><tr><td>Kodak专业显影剂D19</td><td>Kodak</td><td>1462593</td><td></td></tr><tr><td>Kodak专业定影剂</td><td>Kodak</td><td>1971746</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>VWR</td><td>IC15169491</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR</td><td>SX0600-1</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Poly A</td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>rATP</td><td>Promega</td><td>P1132</td><td>10mM</td></tr><tr><td>rCTP</td><td>Promega</td><td>P1142</td><td>10mM</td></tr><tr><td>rGTP</td><td>Promega</td><td>P1152</td><td>10mM</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td>40单位/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>S&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt; UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG039C001MC</td><td></td></tr><tr><td>安全溶解液</td><td>Safety Solve Research Products International</td><td>111177</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>3M</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶</td><td>Promega</td><td>P1085</td><td></td></tr><tr><td>染色金属架</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>组织基质OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>5x 转录缓冲液</td><td>Promega</td><td>P1181</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>VWR</td><td>IC15216391</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>VWR</td><td>101449-446</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109509001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">溶液：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;制备核糖探针的试剂：1.5 &amp;mu;l DNA模板 (0.2–0.3 &amp;mu;g/&amp;mu;l)，2 &amp;mu;l 5x优化转录缓冲液，1 &amp;mu;l 100 mM DTT（随Promega的聚合酶提供，室温下充分混匀），0.3 &amp;mu;l RNasin（40单位/&amp;mu;l），1.5 &amp;mu;l AGC核糖核苷酸混合液，3.5 &amp;mu;l S&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt; UTP，以及1 &amp;mu;l RNA聚合酶。用无核酸酶水补足至10 &amp;mu;l。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;AGC核糖核苷酸混合液：将等体积的10 mM ATP、GTP和CTP混合。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;用于乙醇沉淀以去除游离S&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt; UTP的醋酸钠溶液：40 &amp;mu;l 无RNase和DNase的水，5 &amp;mu;l 3M醋酸钠，以及125 &amp;mu;l 100%乙醇。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;杂交缓冲液（10 ml储备液）：5 ml 100%去离子甲酰胺，600 &amp;mu;l 5M NaCl，1M Tris-HCl（pH = 8.0），240 &amp;mu;l 0.5M EDTA（pH = 8.0），100 &amp;mu;l 100x Denhart's溶液，100 &amp;mu;l 1M DTT，250 &amp;mu;l 20 mg/ml tRNA，125 &amp;mu;l 20 mg/ml poly A，以及1 g硫酸葡聚糖钠。加入DEPC处理的水至总体积为10 ml。剧烈振荡，然后在55 &amp;deg;C孵育直至硫酸葡聚糖钠完全溶解。将杂交缓冲液在-20 &amp;deg;C保存，可稳定约6个月。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;4%缓冲多聚甲醛溶液：在专用于多聚甲醛的烧瓶中，将40 g多聚甲醛加入760 ml蒸馏水中，置于加热板上搅拌并加热至50 &amp;deg;C。加入320 &amp;mu;l 10N NaOH以助溶解。溶解后（约10分钟），加入100 ml 10x PBS，并用蒸馏水补足体积至1升。持续搅拌并加热直至多聚甲醛完全溶解。pH应为7.4。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;乙酰化缓冲液：将13.6 ml三乙醇胺与2.52 ml乙酸酐加入1升蒸馏水中。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;20x SSPE溶液：将3M NaCl、200 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O和200 mM EDTA溶于蒸馏水中。用10N NaOH调节pH至7.4。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;10x PBS缓冲液：将80 g NaCl、2.0 g KCl、14.4 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;和2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;溶于蒸馏水中。调节pH至7.0，并加水至总体积为1升。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;第二次洗涤液：在2x SSPE中含0.1% &amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇和50%甲酰胺&lt;/li&gt; &lt;li&gt;醋酸克雷斯紫溶液：将3%醋酸克雷斯紫溶于自来水（使用蒸馏水会妨碍良好染色），在室温下于烧瓶中搅拌过夜。用真空抽滤装置通过1 mm Whatman滤纸和布氏漏斗过滤。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

放射性 原位 用于检测组织中多样化基因表达模式的杂交技术

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

了解基因表达的时间、水平、细胞定位及表达的细胞类型，有助于我们理解基因的功能。上述每项特征均可通过以下方法实现 原位 与细胞内mRNA的杂交。本文介绍了一种放射性标记方法 原位 根据Clayton方法改良的杂交法 等 (1988)1 在我们实验室已成功应用多年，尤其适用于成年脊椎动物大脑2-5长链互补RNA（cRNA）探针可针对目标序列实现对低丰度转录本的检测6,7. 将放射性核苷酸掺入cRNA探针可进一步提高对低丰度转录本的检测灵敏度，并可通过感光X射线胶片或组织切片上涂布的乳胶膜进行定量分析。这些检测方法可提供目标基因表达的长期记录。与非放射性探针方法（如DIG标记）相比，放射性探针杂交方法无需使用HRP抗体和/或TSA试剂盒进行多步信号放大即可检测低丰度转录本。因此，该方法在信号强度与靶向mRNA含量之间具有线性关系，适用于定量分析。该方法可同时处理100–200张载玻片，适用于胚胎不同发育阶段的研究。目前大多数胚胎发育阶段的基因表达研究采用整体胚胎样本及非放射性检测方法。8,9部分原因在于胚胎组织比成年组织更为脆弱，细胞间黏附性较弱，导致通过组织切片难以观察到细胞群体之间的边界。相比之下，我们的放射性方法由于具有更广的检测灵敏度范围，能够在不同组织区域间获得更高对比度的基因表达分辨率，从而更易于识别细胞群体间的边界。利用该方法，研究人员可揭示新发现基因的潜在意义，并进一步预测目标基因的功能。

本方案已成功用于定量检测多种脊椎动物组织类型中 mRNA 表达的水平和空间分布模式。该方法能够检测低丰度的转录本，并可同时处理数百张切片。本文以鸟类胚胎脑发育过程中的表达谱分析为例介绍该方案。

了解基因表达的时间、水平、细胞定位及表达的细胞类型，有助于我们理解该基因的功能。

以下实验的总体目标是确定特定基因表达的区域，并表征基因表达的时间和水平，以促进对基因功能的理解。为此，首先需快速采集并制备用于实验步骤的组织，以保持组织的完整性。第二步是处理组织，以降低核糖探针的非特异性结合背景。接下来，将核糖探针与组织进行杂交，并对 RIBA 探针的结合进行显影。通过X射线胶片或光敏乳胶技术获得结果，这些结果可基于X射线图像或明场与暗场显微镜观察及分析，显示基因表达的位置和水平。使用 Image J 软件时，存在若干关键步骤必须准确完成，而许多人常在此出错，其中之一便是防止背景染色。因此，有许多步骤可能导致背景值偏高，例如固定不充分或未在合适的温度下进行杂交。另一个原因是RNA污染，这会降解你的RNA探针。因此，必须小心确保所有操作环境无RNA酶污染。第三个要点是，当载玻片浸入乳胶液时，必须确保暗室中没有任何漏光，或在整个过程的所有阶段发生乳胶曝光，该过程可能持续三周。接下来由我实验室的博士后研究员 Hun Chen 演示这一技术。在收获新鲜脑组织后，用一倍浓度的 PBS 缓冲液冲洗，然后将脑组织浸入含有 OCT 包埋介质的模具中，在室温下进行包埋。确保脑组织按所需方向定位以便切片。然后，在干冰上喷洒乙醇后，将组织块置于乙醇与干冰的混合物中，冷冻组织。使用冷冻切片机小心切片，避免乙醇进入组织块内，将冻结的组织切成10至12微米厚的切片，并转移至适用于脑组织和胚胎组织的超薄载玻片（super plus slides）上。最佳切片温度范围为负18摄氏度至负20摄氏度。将切片置于切片盒中，在负80摄氏度条件下保存。将载玻片从负80摄氏度的储存环境中转移至置于干冰上的金属架上。然后在经认证的通风橱中操作，将载片架放入已预热至比室温高3至5摄氏度的4%多聚甲醛溶液中。在室温下孵育5分钟。孵育结束后，将载片架从多聚甲醛溶液中取出，并将载片架在PBS中浸洗15次。每次使用新鲜的PBS溶液，重复此洗涤步骤两次。接着，将切片浸入新配制的乙酰化缓冲液中10分钟，以减少RIBA探针的非特异性结合。然后按前述方法洗涤切片，但此次使用两次SSPE作为洗涤液。通过70%、95%和100%乙醇系列对组织进行脱水处理，每种溶液中各浸泡2分钟。然后在通风橱中将载玻片干燥至少10至15分钟。根据书面实验方案中的说明，在合成RIBA探针后，计算所有载玻片所需的RIBA探针和杂交溶液的体积。将Ribo探针杂交混合液预热至65摄氏度，持续5分钟。为了使Ribo探针变性，吸取100微升Ribo探针杂交液并将其置于盖玻片上。然后使用第二块玻璃盖玻片将溶液均匀铺展在组织和盖玻片表面。将载玻片水平且正面朝上放入金属架中，待所有载玻片准备就绪后，将金属架缓慢浸入65°C的油浴中，孵育时间至少4小时，最长不超过16小时。油会在盖玻片周围形成一个密闭的密封层。将载玻片架从孵育中取出后，去除金属架上多余的油。然后将该架放入通风橱内一个盛有氯仿的玻璃或金属托盘中。再用第二个盛有新鲜氯仿的托盘重复清洗一次。接着，将载片架浸入含0.1% β-巯基乙醇的乙醇与2× SSPE溶液中，以松动盖玻片并溶解过量杂交液。然后将载片转移至另一份新鲜的含0.1% β-巯基乙醇的乙醇与2× SSPE溶液中。将去除了盖玻片的载片转移至置于盛有含0.1% β-巯基乙醇的乙醇与2× SSPE溶液托盘中的新鲜载片架内，室温孵育1小时，以去除未结合的过量RNA探针。然后将载玻片架转移至预热的含有β-巯基乙醇（终浓度为0.1%）的2倍SSPE缓冲液加50%甲酰胺溶液中，于65°C孵育1小时。孵育结束后，将此溶液及之前所有水相洗涤液以及盖玻片均作为放射性废物丢弃。接着，将载玻片在预热的0.1倍SSPE缓冲液中于65°C下洗涤两次，每次30分钟。然后将组织依次浸入70%、95%和100%乙醇中进行脱水，每种溶液中处理两分钟。最后将载玻片置于通风橱中干燥至少30分钟。首先确定组织中是否存在放射性信号。在暗室中使用安全灯，将干燥的载玻片放入胶片暗盒内，并将X射线胶片覆盖在载玻片上。确保载玻片面向胶片的乳剂面，然后关闭暗盒。根据转录本预期丰度，将载玻片曝光1至7天。曝光完成后，将X射线胶片置于标准显影液和定影液中进行显影。杂交信号会以胶片上黑色区域的形式显现，这些黑色区域源于乳剂层中与细胞相邻的已曝光银颗粒，用于确定细胞分辨率并观察组织本身的信号。将载玻片浸入 photographic emulsion（照相乳剂）中，然后进行复染。如果载玻片需要用结晶紫进行复染，则必须根据书面方案中的说明对切片进行脱蜡处理。此时，在暗室中操作，将蒸馏水倒入试管中。取出UC NTB乳化剂，并用蒸馏水将其按1:1比例稀释。将乳剂在 42 摄氏度水浴中融化 20 至 30 分钟后，转移到 42 摄氏度水浴中的玻璃浸渍容器内，继续保温 20 至 30 分钟。稀释后的乳剂液面应能覆盖载玻片上所有组织切片，当载玻片浸入时可完全覆盖。若载玻片数量较多，可能需要额外制备乳剂。现在将载玻片浸入42摄氏度水浴中稀释好的乳胶液内，然后将浸渍过的载玻片放入暗室中密闭避光容器内过夜干燥，或在37摄氏度、关闭光源的烘箱中干燥2至3小时。干燥后，将载玻片转移至载玻片盒中。用黑色绝缘胶带密封边缘，再用铝箔包裹。准备显影时，将盒置于4 °C保存数天至数周，随后将载玻片恢复至室温。然后在暗室中操作，从盒中取出装有载玻片的架，于16 °C条件下在D 19显影液中显影3至5分钟。接着，将已显影的载玻片在室温自来水中漂洗1分钟。然后将载玻片在19摄氏度的固定液中孵育两次，每次六分钟；第二次固定孵育期间可打开室内灯光。现在用流动的室温水清洗载玻片，至少30分钟。接着，使用剃刀片在载玻片仍处于湿润状态时，将背面的乳胶层刮除。最后，用0.3%结晶紫复染，然后根据书面方案中的说明（如有必要）对切片进行脱水和封片。通过用水润湿并用刀片刮除切片背面多余的乳剂，进一步清除残留物。将切片在80%乙醇溶液中冲洗，并轻轻擦拭一至两次，以去除碎片和灰尘。在暗场或明场照明下拍照。刮除和清洁步骤可能需要重复两到三次，以获得无尘颗粒的高质量图像，因为在解剖显微镜下的暗场中，尘粒容易被观察到。以下图像为X射线胶片上原位杂交自显影的示例。这张X射线胶片图像显示了胚胎第10天的斑胸草雀鸣禽头部矢状全脑切片，该切片与针对Fox P1的反义核糖探针进行了杂交。胶片上黑色的曝光颗粒显示了信使RNA的表达，可见四个脑区中Fox P1信使RNA在纹状体中部和背侧丘脑富集。该X射线胶片图像显示了同一只斑胸草雀鸣禽的切片，该切片与针对Cuper的90碱基RIBA探针进行了杂交。TF two Co.TF two 在掌状藻属和更腹侧的丘脑区域富集。以下图像为经乳化液浸渍切片法获得的原位杂交自显影结果示例。该暗场图像在解剖显微镜下拍摄，显示的是孵化后第六天的斑胸草雀头部矢状整体切片，该切片已与针对 Fox P one 的反义 RIBA 探针进行杂交。组织上方乳剂层中暴露的白色银颗粒显示信使RNA的表达。红色代表克雷斯尔紫染色。比例尺代表1毫米。此处图像显示的是同一只斑胸草雀鸣禽的脑组织切片，该切片已与针对 COOP-TF2 的反义核糖探针进行杂交。以下图像比较了反义与有义链标记的结果，显示了在胚胎发育第12天的斑胸草雀脑切片上通过X射线放射自显影技术观察到的不同表达模式。虚线表示全脑轮廓，C 标记小脑区域。可以看出，PAC6的反义链在脑组织中表达，尤其在室管膜区表达显著。与PAC6的正义链杂交的相邻切片显示，在整个胚胎头部均无背景表达，但在视网膜色素层中可见明显的表达信号，与反义链结果一致。以下图像C显示了在斑胸草雀胚胎发育晚期阶段取材的脑组织切片中基因表达的两个信号，分别为明场和暗场下观察的乳胶显影切片。这幅明场图像显示了胚胎第10天的D one B表达。在正常曝光到乳剂的情况下，呈黑色的标记在此放大倍数下几乎不可见。该图像显示了与前一幅图像相同的切片和放大倍数，但切换为暗场观察，可见纹状体和丘脑中的标记呈白色。此明场图像显示了胚胎第12天 slit three 的表达情况。经过乳胶过度曝光后，黑色标记清晰可见。SC 标记脊髓的位置，CB 标记小脑的位置。头端朝向左侧。此处显示的图像为相同切片，仅将明场视图切换为暗场视图，可见脊髓中标记物呈白色，与明场图像相对应。以下图像展示了细胞水平上的银颗粒分辨率。图中显示的是斑胸草雀前脑中 Fox P1 信使 RNA 的标记结果，经甲苯胺蓝染色的细胞上方的银颗粒呈现为黑色斑点。该图像显示成年斑胸草雀中脑间脑区域单个细胞上表达丰度较高。同一组织切片的相邻区域中，单个细胞上的表达丰度较低。你好，Fox。在胚胎第12天的中胚层中可见P1信使RNA在细胞中的表达。此处显示的胚胎细胞与前两幅图像中的成体细胞相比，体积更小且排列更为紧密。最后，此图像显示在同一组织切片相邻的蒜瓣区域中，细胞上的表达丰度较低。在完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法，如免疫组织化学，以回答更多问题，例如目标基因在何种细胞类型中表达。观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何进行原位杂交实验。请注意，使用放射性试剂可能具有极高危险性，在操作过程中必须始终采取个人防护等安全措施。

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