放射性 原位 用于检测组织中多样化基因表达模式的杂交技术

以下实验的总体目标是确定特定基因表达的区域，并表征基因表达的时间和水平，以促进对基因功能的理解。为此，首先需快速采集并制备用于实验流程的组织，以保持组织的完整性。第二步是处理组织，以降低核糖探针的非特异性结合背景。

接下来，将核糖探针与组织进行杂交，并对RIBA探针的结合进行显像。通过X射线胶片或光敏感乳胶技术获得结果，这些结果可基于X射线图像或明场与暗场显微镜观察及分析，显示基因表达的位置和水平。使用Image J软件时，有几个关键步骤必须准确完成，而许多人在操作中容易出错，其中之一就是防止背景信号的产生。

因此，有许多步骤可能会产生背景信号，例如封闭不充分或杂交温度不适宜。另一个原因是RNA污染，这会降解你的RNA探针。因此，必须小心确保所有操作环境无RNA酶污染。

第三点是，当载玻片浸入乳胶液时，必须确保暗室在该过程的所有阶段（可能持续三周）都没有任何漏光，否则会导致乳胶液曝光。接下来由我实验室的博士后研究人员 Hun Chen 演示这一技术。在收获新鲜脑组织后，用一倍浓度的 PBS 缓冲液冲洗，然后将脑组织浸入含有 OCT 包埋介质的模具中，在室温下进行包埋。

确保脑组织按切片所需的方向进行定位。然后将干冰喷上乙醇，通过将组织块放入乙醇与干冰的混合物中冷冻组织。使用冷冻切片机进行切片时需小心，避免乙醇进入组织块内，将冷冻的组织切成10至12微米厚的切片，并转移至适用于脑组织和胚胎组织的Super Plus载玻片上。

最佳切片温度范围为负18摄氏度至负20摄氏度。将切片置于切片盒中，在负80摄氏度条件下保存。将载玻片从负80摄氏度保存环境中转移至盛有干冰的金属架上。

然后在经过认证的通风橱中操作，将载片架放入已预热至比室温高3至5摄氏度的4%多聚甲醛溶液中。在室温下孵育5分钟。孵育结束后，从多聚甲醛溶液中取出载片架，并将载片架在PBS中浸洗15次。每次使用新鲜的PBS溶液，重复此洗涤步骤两次。

接着，将切片浸入新配制的乙酰化缓冲液中10分钟，以减少RIBA探针的非特异性结合。然后按前述方法洗涤切片，但此次使用两倍SSPE作为洗涤液。通过70%、95%和100%乙醇系列对组织进行脱水，每种溶液中各浸泡2分钟。

然后在通风橱中将载玻片干燥至少10至15分钟。根据书面实验方案中的说明，合成RIBA探针后，计算所有载玻片所需的RIBA探针体积和杂交溶液用量。将Ribo探针杂交混合液预热至65摄氏度，持续5分钟。

为了使Ribo探针变性，吸取100微升Ribo探针杂交液并将其置于盖玻片上。然后使用第二块玻璃盖玻片将溶液均匀铺展在组织和盖玻片表面。将载玻片水平且正面朝上放入金属架中，待所有载玻片准备就绪后，将金属架缓慢浸入65°C的油浴中，孵育时间至少4小时，最长不超过16小时。

油会在孵育后在盖玻片周围形成气密性密封。从承载玻片的金属架上去除多余的油，然后将该金属架放入盛有氯仿的玻璃或金属托盘中，置于通风橱内。用第二个装有新鲜氯仿的托盘重复进行清洗。

接下来，将载片架浸入含有0.1% beta me cap的乙醇与2倍SSPE溶液中，以松动盖玻片并溶解多余的杂交溶液。然后将载玻片转移至另一份新鲜的含有0.1% beta me cap的乙醇与2倍SSPE溶液中。将去除了盖玻片的载玻片转移至一个盛有含0.1% beta macca的乙醇与2倍SSPE溶液的新载片架中，在室温下孵育该溶液1小时，以去除未结合的过量RNA探针。

然后将载玻片架转移至预热的含有50%甲酰胺的2×SSPE溶液中，该溶液中添加β-巯基乙醇（beta ME capto ethanol），使其终浓度为0.1%，在65°C下孵育1小时。孵育结束后，将此溶液及之前所有水相洗涤液以及盖玻片均作为放射性废物丢弃。接着，在65°C下，用预热的0.1×SSPE溶液洗涤载玻片两次，每次30分钟。

然后将组织依次通过70%、95%和100%乙醇溶液进行脱水，每种溶液中各处理2分钟。最后将载玻片置于通风橱中干燥至少30分钟。首先确定组织中是否存在放射性信号。

将干燥的载玻片放入暗盒中，在暗室中使用安全灯操作，将X射线胶片覆盖在载玻片上。确保载玻片面向胶片的乳剂面，然后关闭暗盒。根据转录本预期丰度，使载玻片曝光1至7天。

曝光完成后，将X射线胶片在标准显影液和定影液中进行显影。杂交信号将表现为胶片上的黑色区域，这些区域由乳剂层中紧邻组织的已曝光银颗粒形成，可用于确定细胞分辨率并观察组织本身的信号。将载玻片浸入摄影乳剂中，然后进行复染。

如果载玻片需要用结晶紫进行复染，则必须根据书面方案中的说明对切片进行脱脂液化处理。此时，在暗室中操作，将蒸馏水倒入试管中。取出NTB乳胶，用蒸馏水将其稀释至1:1的比例。

将乳剂在 42 摄氏度水浴中融化 20 至 30 分钟后，转移至置于 42 摄氏度水浴中的玻璃浸渍容器内，继续保温 20 至 30 分钟。稀释后的乳剂液面应足以覆盖载玻片浸入时其上的所有组织切片。若载玻片数量较多，可能需要额外的乳剂。

现在将载玻片浸入42摄氏度水浴中的稀释乳剂中，然后将浸渍过的载玻片置于暗室内的密闭避光容器中过夜干燥，或在37摄氏度、关闭光源的烘箱中干燥2至3小时。干燥后，将载玻片转移至载玻片盒中。用黑色电工胶带密封边缘，再用铝箔包裹。

当准备显影时，将切片盒在4°C条件下储存数天至数周，使用前将载玻片恢复至室温。然后在暗室中操作，从切片盒中取出装有载玻片的架子，置于16°C的D 19显影液中显影3至5分钟。随后，将显影后的载玻片在室温下用自来水冲洗1分钟。

然后将载玻片在19摄氏度的固定液中孵育两次，每次6分钟；第二次固定孵育期间可打开室内灯光。现在用流动的室温水清洗载玻片，至少30分钟。接着，使用剃刀片在载玻片仍处于湿润状态时，将背面的乳胶层刮除。

最后，用0.3%结晶紫复染，然后根据书面实验方案中的说明（如有必要）对切片进行脱水和封片。用清水润湿切片背面，再用刀片轻轻刮除多余的乳胶膜，进一步清除残留物。将切片在80%乙醇溶液中冲洗，并轻柔擦拭一至两次，以去除碎片和灰尘。

在暗场或明场照明下拍照。刮除和清洁步骤可能需要重复两到三次，以获得无尘颗粒的高质量图像，因为在解剖显微镜下的暗场中，尘粒很容易被观察到。以下图像为X射线胶片上原位杂交自显影的示例。

这张X射线胶片图像显示了胚胎发育第10天的斑胸草雀鸣禽的矢状面全脑切片，该切片已与针对Fox P1的反义核糖探针进行杂交。胶片上显示的黑色曝光颗粒代表信使RNA的表达，可见在四个脑区中，Fox P1信使RNA在纹状体腹侧中脑和背侧丘脑中富集。该X射线胶片图像显示的是同一只斑胸草雀鸣禽的切片，该切片已与针对Cuper的90碱基RIBA探针进行杂交。

TF two Co.TF two 在丘脑腹侧区域和后外侧丘脑中富集。以下图像来自乳胶浸渍切片的原位杂交自显影结果示例。该暗场图像在解剖显微镜下拍摄，显示的是孵化后第六天的斑胸草雀头部矢状面整体切片，该切片已与针对 Fox P one 的反义 RIBA 探针进行杂交。

组织上方乳剂层中暴露的白色银颗粒显示信使RNA的表达。红色代表克雷斯尔紫染色。比例尺代表1毫米。

此处图像显示的是同一只斑胸草雀鸣禽的脑切片，该切片已与针对 COOP-TF2 的反义核糖探针进行杂交。以下图像比较了反义链与有义链标记的结果，通过放射自显影技术在X射线胶片上显示了斑胸草雀胚胎第12天脑部切片的信号分布差异。虚线表示全脑轮廓，C 标记小脑位置。

可以看出，PAC6的反义链在脑组织中表达，尤其在脑室区表达明显。与PAC6正义链杂交的相邻切片显示，在整个胚胎头部均无背景表达，但在视网膜色素层中可见明显的表达信号，该信号与反义链一致。下图C显示了在斑胸草雀胚胎发育晚期阶段取材的脑组织切片中基因表达的两个信号，这些涂有乳胶的切片分别在明场和暗场显微镜下观察。

这幅明场图像显示了胚胎第10天的D one B表达。在正常曝光至乳胶膜的情况下，呈黑色的标记在此放大倍数下几乎不可见。该图像显示了与前一幅图像相同的切片和放大倍数，但切换为暗场观察，可见纹状体和丘脑中的标记呈白色。

这幅明场图像显示了胚胎第12天时slit three基因的表达。经过乳胶过度曝光后，可清晰观察到黑色标记。SC标记脊髓的位置，CB标记小脑的位置。

头端朝向左侧。此处显示的为相同切片，放大倍数相同，但切换为暗视野观察，脊髓中的标记物呈白色，与明视野图像相对应。以下图像展示了细胞水平上的银颗粒分辨率。

图中显示的是斑胸草雀前脑中 Fox P1 信使 RNA 的标记，银颗粒以黑色斑点形式出现在经结晶紫染色的细胞上方。该图像显示在成年斑胸草雀的间脑区域，单个细胞上存在高丰度表达。而在同一组织切片相邻的脑区，单个细胞上的表达丰度较低。

你好，Fox。在胚胎第12天的中肠中观察到P1信使RNA在细胞中的表达。

此处显示的胚胎细胞与前两张图像中看到的成体细胞相比，体积更小且排列更为紧密。最后，此图像显示在同一组织切片相邻蒜叶部分的细胞中，目标基因表达丰度较低。在完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法（如免疫组织化学）来回答更多问题，例如目标基因在何种细胞类型中表达。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何进行原位杂交实验。请务必注意，使用放射性试剂可能具有极高危险性，因此在操作过程中必须始终采取个人防护等安全措施。