放射性的原位杂交检测组织不同的基因表达模式
April 27th, 2012
该协议被成功地用于定量检测水平和mRNA表达的空间格局，在跨多个组织的脊椎动物物种类型。该方法可以检测低丰度的成绩单，并允许数以百计的幻灯片，同时处理。我们目前使用的禽流感为例，胚胎的大脑形成的表达分析这个协议。
以下实验的总体目标是确定特定基因表达的区域，并表征基因表达的时间和水平，以促进理解基因功能。这是通过快速收获和准备用于手术的组织以保持组织的完整性来实现的。作为第二步，处理组织以减少核糖探针的背景结合。
接下来，将 ribo 探针与组织杂交，并可视化 RIBA 探针的结合。使用 X 射线胶片或光敏乳剂，根据 X 射线图像或暗场和明场显微镜和分析获得显示基因表达位置和水平的结果。使用 Image J 软件，大约有几个关键步骤必须做好，很多人都会犯错误，其中一个是防止背景。
因此，有许多步骤可以为您提供背景信息，例如性能不佳或未在合适的温度下杂交。另一个是 RNA 污染，它会降解您的 RNA 探针。因此，您必须小心保持所有 RNA 不含。
第三个是，当载玻片浸入乳剂中时，您必须确保在暗室中没有任何漏光或曝光乳剂，该过程可能持续三周。因此，展示这项技术的将是 Hun Chen，他是我实验室的博士后。收获新鲜大脑并冲洗一次后，PBS 通过在室温下将大脑浸入含有培养基的模具中，将大脑嵌入 OCT 组织技术培养基中。
确保大脑根据切片的需要定向。然后用乙醇喷洒干冰后，将块放入乙醇和干冰混合物中冷冻组织。小心不要让乙醇进入块内，使用低温恒温器将冷冻组织切成 10 至 12 微米厚的切片，然后安装在脑和胚胎组织的 super plus 载玻片上。
最佳切割温度在零下 18 摄氏度到零下 20 摄氏度的范围内。将切片存放在零下 80 摄氏度的载玻片盒中。将玻片从零下 80 摄氏度的储存转移到干冰上的金属架上。
然后在经过认证的通风橱中工作时，将试管架放入预先警告比室温高 3 到 5 摄氏度的 4% 对甲醛溶液中。孵育后在室温下孵育 5 分钟，从对位甲醛中取出架子，然后将架子浸入 PBS 中 15 次，清洗玻片。每次使用新鲜的 PBS 溶液重复此洗涤步骤两次。
接下来，将玻片浸入新鲜制备的乙酰化缓冲液中 10 分钟，以减少 RIBA 探针的非特异性结合。然后像以前一样洗涤载玻片，但这次使用两次 SSPE 作为洗涤溶液。在每种溶液中，通过 70、95 和 100% 乙醇系列脱水组织 2 分钟。
然后在通风橱中干燥载玻片至少 10 到 15 分钟。合成 RIBA 探针后，根据书面方案中的说明，计算所有载玻片所需的 RIBA 探针和杂交溶液的体积。将 Ribo 探针杂交混合物预热至 65 摄氏度 5 分钟。
为了使 Ribo 探针变性，移液 100 微升 Ribo 探针杂交溶液并对齐盖玻片。然后使用第二张玻璃盖玻片将溶液均匀地涂抹在组织和盖玻片上。将玻片水平、正面直立地放入金属架中，所有玻片准备就绪后，将玻片架缓慢浸入 65 摄氏度的油浴中，最短 4 小时，最长 16 小时。
油在孵育组织从包含载玻片的金属架上去除多余的油后，在盖玻片周围形成气密密封。然后将架子放入通风橱中含有氯仿的玻璃或金属托盘中。用第二个装有新鲜氯仿的托盘重复洗涤。
接下来，将架子浸入 0.1% 斗鱼帽中的乙醇和两次 SSPE 溶液中，以松开盖玻片并溶解过量的杂交溶液。然后将玻片转移到新鲜的 0.1% 斗鱼帽 TER 乙醇加两倍 SSPE 溶液的第二种溶液中。将未覆盖的玻片转移到装有 0.1% β macca TER 乙醇和两倍 SSPE 的托盘中的新架子中，在室温下孵育该溶液 1 小时以去除多余的未结合 RNA 探针。
然后将玻片架转移，在 65 摄氏度下预热两倍 SSPE 加 50% 的主宽溶液，其中含有 β ME capto 乙醇，终浓度为 0.1%，并在 65 摄氏度下孵育 1 小时。孵育后，将这种和所有以前的水洗溶液以及盖玻片作为放射性废物丢弃。接下来，在战前 0.1 次 SSPE 的 65 摄氏度中洗涤载玻片两次，每次 30 分钟。
然后，在每种溶液中，通过 70%95% 和 100% 乙醇系列脱水组织 2 分钟。最后，在通风橱中干燥载玻片至少 30 分钟。首先确定组织中是否存在放射性信号。
将干燥的载玻片放入胶片盒中，在暗室中使用安全光照将 X 射线胶片置于载玻片上。确保载玻片面向胶片的乳剂面，然后关闭凝胶盒。将载玻片暴露在胶片上 1 到 7 天，具体取决于转录本的预期丰度。
曝光完成后，在标准显影剂和定影剂中显影 X 射线胶片。杂交信号将在薄膜上显示为黑色区域，这是由于乳剂中暴露的银粒引起的，接下来是确定细胞分辨率并查看组织本身上的信号。将载玻片浸入照相乳剂中，然后进行复染。
如果要用牙槽紫对载玻片进行反染色，则必须根据书面方案中的说明对切片进行 deli 液化。此时，在暗室中工作，将蒸馏水倒入管中。舀出 uc NTB 乳液，用蒸馏水将乳液稀释至一比一。
将乳液在 42 摄氏度的水浴中熔化 20 至 30 分钟后，将其转移到玻璃浸渍容器中，在 42 摄氏度的水浴中浸泡 20 至 30 分钟。当载玻片浸入载玻片中时，稀释乳剂的液位现在应覆盖载玻片上的所有切片。如果载玻片很多，则可能需要额外的乳剂。
现在将玻片浸入 42 摄氏度水浴中的稀释乳剂中，然后在密闭避光容器中将浸渍玻片在暗室或 37 摄氏度的烘箱中干燥两到三个小时，关灯。干燥后，将玻片转移到玻片盒中。用黑色电工胶带密封边缘，然后用铝箔覆盖。
将盒子在 4 摄氏度下存放数天至数周，当准备显影时，将载玻片加热至室温。然后在暗室中工作时，从盒子中取出包含载玻片的架子，并在 16 摄氏度的编解码器 D 19 显影剂中显影 3 到 5 分钟。接下来，在室温下用自来水清洗显影的玻片 1 分钟。
然后将载玻片在 19 摄氏度的固定液中孵育两次，每次 6 分钟，在第二次固定器孵育期间可以打开房间灯。现在，在室温下用流水清洗玻片至少 30 分钟。然后用剃须刀片，趁载玻片背面仍然湿润时刮掉乳剂。
最后，用 0.3% 牙槽紫复染，然后如有必要，根据书面方案中的说明对镶样玻片进行脱水。用水润湿并用剃须刀片刮擦，进一步清除载玻片背面多余的乳液。用 80% 乙醇溶液冲洗玻片，轻轻擦拭 1 至 2 次，以去除碎屑和灰尘。
在暗场或明场照明下拍摄照片。刮擦和清洁步骤可能需要重复两到三次，以获得没有灰尘颗粒的良好图像，在解剖显微镜下，灰尘颗粒很容易在暗场中看到。以下图像是 X 射线胶片原位杂交的自动射线照相示例。
这张 X 射线胶片图像显示了斑马雀鸣禽在胚胎第 10 天的矢状全头切片，该声禽已与 Fox P 的反义核糖探针杂交。胶片上黑色暴露的颗粒显示信使，RNA 表达可见于四个大脑 Fox P 中的一个信使，RNA 富集于中胚层、中层 stri aum 和背丘脑。X 射线胶片图像显示了同一只斑马雀鸣禽的切片，该斑马雀鸣禽已与 90 美分 RIBA 探针杂交到 Cuper。
TF 二 Co.TF 二富含对 palam alium 和更多腹侧丘脑的需求。下图是乳剂浸渍玻片原位杂交的自动射线照相示例。这张在解剖显微镜下拍摄的暗场图像显示了斑马雀在出雏后第 6 天的矢状全头切片，该头段已与 Fox P 1 的反义 RIBA 探针杂交。
组织上方乳剂中暴露的白色银色颗粒显示信使、RNA 表达。红色代表 kressel 紫罗兰色染色。比例尺表示 1 毫米。
这里的图片显示了同一只斑马雀鸣禽的部分，该鸣禽已与反义核糖证明杂交以合作 TF 2。下图比较了反义和正义标记，这些标记显示了在胚胎第 12 天从斑马雀采集的 Saul 头片的 X 射线胶片上的自体 X 光片上显示的不同模式。虚线表示整个大脑的轮廓，C 表示小脑。
可以看出，PAC six 的反义链在大脑中表达，尤其是在心室区。这个相邻的部分与包装 6 的气味链杂交，显示整个胚胎头没有背景表达，但在视网膜的色素层中作为反义链明显表达。下图在 C 中显示了在明场和暗场视图下从胚胎晚期从斑马雀脑采集的基因表达和乳剂浸渍玻片的两个信号。
该明场图像显示了胚胎第 10 天的 D 1 B 表达。从正常暴露于乳剂中开始，在此放大倍率下几乎看不到呈黑色的标签。该图像显示了与上图相同的切片和放大倍率，但切换到暗视野视图，在纹状体和丘脑中以白色显示标记。
该明场图像显示了胚胎第 12 天的裂隙 3 表达。过度暴露于乳剂后，很容易看到黑标。SC 标记脊髓的位置，CB 标记小脑的位置。
Rostral 朝向左。此处显示的图像是相同的部分，放大倍率仅可见，但切换到暗场视图，在脊髓中以白色显示与明场图像匹配的标记。下图显示了细胞级别的银晶粒分辨率。
这里显示的是 Fox P 一个信使 RNA，在斑马雀前脑中标记的银色颗粒在细胞上方显示为黑点，上面有紫牙槽嵟染色。该图像显示了成年斑马雀 meso alium 中单个细胞的高丰度表达。该图像显示了此处同一切片相邻 alium 中单个细胞的低丰度表达。
嗨，福克斯。P 一个信使。在胚胎第 12 天的 meso alium 中可以看到细胞上的 RNA 表达。
与前两张图片中看到的成体细胞相比，这里看到的胚胎细胞更小、更紧密。最后，该图像显示同一切片相邻 alium 中细胞的低丰度表达。在遵循此程序时，可以执行其他方法，如免疫化学，以回答其他问题，例如靶基因在哪种细胞类型上表达。
看完这个视频，你应该对如何进行研究所杂交有了很好的了解。不要忘记使用辐射试剂可能非常危险，在此过程中应始终采取预防措施，例如个人防护。
概述
该协议定量检测各种脊椎动物组织中的mRNA表达水平和空间模式。它能够识别低丰度转录本，并允许同时处理大量的切片。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因表达
- 胚胎发育
背景
- 通过表达谱分析理解基因功能至关重要。
- 保持组织完整性对于准确结果至关重要。
- 减少背景结合对于清晰可视化是必要的。
- 适当的处理和处理技术对于避免污染至关重要。
研究目的
- 识别脊椎动物组织中的基因表达区域。
- 表征基因表达的时间和水平。
- 提高对发育过程中基因功能的理解。
使用的方法
- 收集和准备组织样本。
- 将核糖探针与组织杂交。
- 使用X光胶片或显微镜可视化基因表达。
- 使用Image J软件进行分析。
主要结果
- 成功可视化mRNA表达模式。
- 识别减少背景噪音的关键步骤。
- 展示有效的组织准备技术。
- 结果表明该方法对低丰度转录本的可靠性。
结论
- 该协议对于研究各种组织中的基因表达是有效的。
- 它提供了一种可靠的方法来检测低丰度转录本。
- 未来的应用可能会增强对发育生物学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Radioactive in situ hybridization provides quantitative, high-sensitivity detection of low-abundance transcripts in tissue sections, enabling precise spatial and temporal gene expression mapping. This capability supports target validation by delivering linear signal-to-RNA relationships essential for mechanistic de-risking in early discovery. The method’s compatibility with adult vertebrate tissues and capacity for high-throughput slide processing align with preclinical biomarker studies requiring reproducible, archivable expression data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through cellular localization and abundance quantification of target mRNAs.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct visualization of gene expression patterns without amplification artifacts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering quantitative, linear readouts that correlate with target engagement potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible tissue-based readouts suitable for screening compound effects on gene expression.
- Scalability: Allows simultaneous processing of 100-200 slides, supporting medium-throughput target confirmation workflows.
- Quantitative Output: Delivers linear signal intensity proportional to mRNA levels, enabling dose-response and threshold-based decision making.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to developmental and adult vertebrate tissues, supporting studies in neurobiology and disease models.
- Translational Continuity: Provides archivable expression records via x-ray film or emulsion, facilitating cross-study comparison and biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Advancement: High sensitivity detection of low-abundance transcripts aids in identifying biologically relevant targets prior to preclinical investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing spatially resolved expression data that informs target selection and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing where and when genes are expressed, clarifying pathway involvement and cellular context.
- Screening: Enables assay-ready tissue preparations with quantitative outputs for evaluating modulator effects on target expression.
- Analytics: Generates linear, quantifiable signal measurements that allow statistical comparison across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects early expression data to preclinical validation through stable, detectable records suitable for longitudinal studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for target validation across multiple projects due to its standardization and sensitivity range.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target function through direct, quantitative mRNA visualization.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized hybridization, washing, and detection steps minimizing technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in target validation through low-background, linear detection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by delivering reliable expression data for targets with low transcript abundance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radioactive probe handling, tissue sectioning, and darkroom techniques for emulsion or film-based detection.
- Necessitates access to certified fume hoods, cryostats, hybridization ovens, and photographic processing equipment.
- Demands cross-team standardization of probe synthesis, hybridization timing, and exposure durations to ensure consistent results.
- Involves adaptation considerations for fragile embryonic tissues due to sectioning challenges, though sensitivity advantages may offset this in adult tissues.
- Involves practical limitations including radioactivity safety protocols, waste disposal requirements, and longer detection timelines (up to weeks for emulsion development).
