使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化还原蛋白质组

本实验的总体目标是观察丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）对番茄植株中氧化还原调控蛋白的影响。首先，用丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）接种番茄植株，以诱导病原体感染及蛋白响应。随后使用DAB（3,3'-二氨基联苯胺）染色，观察活性氧物种的变化。

然后进行半胱氨酸TMT标记，以检测蛋白质中受氧化还原调控的半胱氨酸。所获得的结果可以量化处理样本与对照样本之间的变化。大家好，我是来自佛罗里达大学生物系及蛋白质组学平台的Chen。

与现有的同位素涂层鱼鳍标记法（也称为 ASCA）相比，我们的 CTMT 标记技术在大规模分析氧化还原响应蛋白方面具有多重检测的优势。尽管本实验将重点揭示番茄在病原体感染条件下受氧化还原调控的蛋白质，但该方法也可应用于其他体系，如 joof、小鼠 cu 以及其他植物和应激条件的控制。我们最初产生该方法的想法，是在观察到由于仅能使用两种标签，ICAD 实验之间存在显著差异之后。

该方法的VIR演示至关重要，因为标记和富集步骤较难掌握。必须尽量减少标记样品之间的实验差异，并去除冗余区域以确保高效的标记效果。现在开始操作：在直径为四英寸的花盆中种植两株大小相近的移栽番茄幼苗，用于接种物培养。

在KBM平板上形成的假单胞菌单菌落草坪。将细菌刮入20毫升水中，制备浓度约为每毫升10⁶个菌落形成单位的细菌接种液。在1升接种缓冲液中，将四周大的植物浸入细菌接种液中30秒。

然后立即用透明塑料袋覆盖。在适宜的接种时间后，取完全展开的叶片，将表皮朝上放置于每毫升含1毫克的DAB染色液中，真空浸润15分钟。随后将叶片在室温下避光孵育过夜。

现在将染色的叶片在95%乙醇中煮沸10分钟，然后用研钵研磨，并在75%乙醇中保存。将收获的叶片在液氮中研磨成细粉。然后按照随文所述方法进行苯酚抽提。

接下来，用五倍体积的冰冷0.1摩尔醋酸铵加入100%甲醇中沉淀经苯酚提取的蛋白质。通过离心收集蛋白质，并进行沉淀洗涤。然后将样品重新悬浮于1.5毫升冰冷的70%乙醇中，并转移至2毫升微量离心管中。

离心后，弃去乙醇上清液，并将沉淀物在真空浓缩仪中短暂干燥。在离心形成沉淀后，用变性蛋白质提取缓冲液溶解样品，收集上清液并测定上清液中的蛋白质浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。对于六种质量标签中的每一种，取100微克蛋白质样品，加入等体积新配制的200毫摩尔碘乙酰胺烷基化缓冲液，以封闭游离的巯基，37摄氏度孵育1小时。随后，为沉淀蛋白质，加入1毫升预冷的80%丙酮，置于负20摄氏度过夜。

通过离心收集蛋白质沉淀，并用80%丙酮洗涤三次。将样品在冰上空气干燥后，将沉淀重悬于50 µL裂解缓冲液中。随后，加入0.5 µL的100 mM TCEP以还原二硫键，在室温下孵育1小时。

向试剂管中加入20 µL乙腈，以溶解标签。涡旋混匀后离心，以去除多余的TCEP。取50 µL样品加入MicroCon 3 kD超滤管中。加入50 µL裂解缓冲液，在4 °C、10,000 × g条件下离心15分钟。

收集样品时，将柱子倒置放入干净的离心管中并进行离心。如有需要，检测样品的pH值，并用1摩尔盐酸将pH值调节至7到8之间。

加入五微升的半胱氨酸TMT试剂，在室温下孵育反应两小时，合并样品后加入等体积的上样缓冲液，煮沸五分钟，然后在预制的12%聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。用过滤水冲洗凝胶三次后，用考马斯亮蓝染色一小时，并根据蛋白质条带浓度在水中脱色过夜。每条凝胶泳道分为12个组分。将每个组分切成一毫米大小的碎片，放入1.5毫升离心管中。

用含有0.1摩尔碳酸氢铵的50%乙腈溶液完全浸泡凝胶碎块。随后用100%乙腈覆盖凝胶碎块，孵育15分钟。去除液体后，使用真空浓缩仪将凝胶碎块干燥。

接下来，加入等体积的胰蛋白酶溶液，置于冰上进行再水合。然后在37摄氏度孵育12至16小时，以完成胰蛋白酶消化。随后，从孵育后的样品中移除液体蛋白提取物。

通过加入 5% 甲酸、50% 乙腈覆盖胶粒以终止反应，并去除残留的蛋白质消化产物。然后在室温下振荡胶粒 20 分钟。再进行两次提取后，将上清液转移至已提取的蛋白质样品管中。

将样品置于0.5毫升离心管中，在真空浓缩仪中干燥。根据相应蛋白质条带的强度，制备浓度成比例的TMT抗体树脂在TBS中的50%悬液。用一柱体积的1×TBS洗涤树脂三次，随后向每个样品中加入200微升TBS。

然后转移至抗TMT树脂中，室温下振荡两小时，随后在4摄氏度下轻轻摇动过夜。将每个样品上样到一根色谱柱中。用200 µL洗脱液对色谱柱进行洗涤。

然后用200微升50%洗脱缓冲液对每个样品洗脱三次，并在真空下干燥。将样品悬浮于12微升含0.1%甲酸的3%乙腈中，直接进样5微升至HPLC色谱柱。按照随文所述条件，采用乙腈浓度递增的梯度洗脱肽段。

采用质谱法在“前二取三”工作流程中检测肽段。首先进行一级质谱（MS），然后获取三级质谱（MS/MS）谱图，采用高能量C型陷阱解离（HCD）碎裂，随后进行三级分析。

采用碰撞诱导解离的质谱法进行蛋白质鉴定。使用分支工作流程分析质谱数据。应用报告离子定量器对比例进行定量。

同时，通过谱图选择器、谱图归一化器和谱图分组节点对 MSM 质谱数据进行处理，并使用 Seaquest 搜索引擎进行数据查询。该图像显示了经 DAB 染色后左侧为对照组番茄植株叶片、右侧为假单胞菌接种叶片的示例。DES 染色过程使得组织化学染色能够显示叶片组织中活性氧物质的存在迹象。

与预期一致，对照组未显示明显染色，而经假单胞菌处理的叶片则显示出过氧化氢产生的阳性染色。该示例展示了蛋白质组学发现数据的输出结果：通过每个样本中差异性氧化还原调控蛋白的峰面积，可实现绝对定量。对照组与接种样本之间的峰面积反映了相对含量。

在此，对照样品与接种样品之间蛋白质的氧化还原调控相似。强度相近的峰表明存在二硫键，且这些二硫键不受处理条件变化的调控。一旦掌握，该技术可在一周内正确完成。

请记住保持样品低温，并妥善整理标签。按照本方案操作时，使用苯酚等试剂需采取预防措施，例如佩戴耐化学腐蚀手套，并在通风橱内操作。还可进行其他检测，如翻译后修饰的质谱分析，以确定其他系统性修饰，如肌酸和谷氨酰胺的模拟修饰。

观看本视频后，您应充分了解如何执行 DIB 站立式 CTMD 启用及氧化还原 16 资格认证。