Name: 利用同位素标记的质谱剖析巯基氧化还原蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学习利用CysTMT标记和质谱技术分析番茄植物中受Pseudomonas syringae影响的巯基氧化还原蛋白质组，该方法可应用于其他生物系统的氧化还原调控研究。

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作者感谢康奈尔大学的 Greg Martin 博士及其研究团队提供了 DC3000 菌株、番茄种子以及相关建议。同时感谢 Mou Zhonglin 博士在 DAB 实验方案上的帮助，以及佛罗里达大学生物技术跨学科研究中心蛋白质组学部在方法开发过程中提供的协助。蛋白质提取方案改编自 Hurkman 和 Tanaka16。关于 cysTMT 标记的步骤 4 至步骤 6 改编自赛默飞世尔科技公司（Thermo Pierce Fisher Scientific）产品说明书17。本研究由美国国家科学基金会（NSF，项目编号 MCB 0818051，资助对象 S Chen）提供资金支持。

1. 幼苗培养与细菌制备
<ol>
	<li>将幼苗在生长室中（光照强度为160 μmol photons m-2s-1，光周期为每天8小时光照（22 °C）和16小时黑暗（20 °C））的MetroMix 500土壤混合物（BWI Companies）中培养1周。相对湿度设定为70%。根据需要浇灌自来水，以防止土壤变干。</li>
	<li>选取两株大小相近的幼苗，移栽至装有MetroMix 500土壤的4英寸直径花盆中，并在与步骤1.1相同的条件下继续培养3周。</li>
	<li>将丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae，Pst）初始以T型划线法接种于Kings B培养基（KBM）平板上（每升含：20 g蛋白胨，0.1975 g MgSO4，1%甘油，1.5 g K2HPO4，18 g琼脂），在28 °C下培养两天。挑取单菌落，混入300 μL液体Kings B培养基（20 g蛋白胨，0.1975 g MgSO4，10 mL甘油，10 mL 100x K2HPO4储备液（1.5 g K2HPO4溶于10 mL H2O））中，涂布于Kings B培养基平板，于28 °C过夜培养。</li>
	<li>通过将培养后的细菌从KBM平板上刮下并悬浮于20 mL H2O中制备细菌接种液。用1 L接种缓冲液（10 mM MgCl2 + 400 μL Silwett-70）将菌液调至OD600为0.03（约106 cfu/mL）。以不含细菌的接种缓冲液作为空白对照溶液。</li>
</ol>
2. 用Pst接种番茄及H2O2组织化学染色
<ol>
	<li>将四周大的植株浸入上述接种液中30秒进行接种。接种后立即用透明塑料袋覆盖植株。</li>
	<li>使用前3天配制3'-3'二氨基联苯胺（DAB）染色液11（1 mg/ml DAB 溶于 H2O，用 HCl 调 pH 至 3.8），以确保完全溶解。溶液在室温下轻轻摇动混匀。</li>
	<li>处理24小时后，取完全展开的叶片，将表皮朝上置于DAB染色液中，真空渗透15分钟。随后将叶片于室温避光条件下染色过夜。</li>
	<li>叶片在95%乙醇中煮沸10分钟，然后保存于75%乙醇中。</li>
</ol>
3. 蛋白质提取
<ol>
	<li>收获后，将番茄叶片在液氮中用研钵和研杵研磨成细粉。</li>
	<li>每0.5 g组织，加入1.25 mL Tris pH 8.8缓冲酚和1.25 mL / 0.5 g提取缓冲液（0.1 M Tris-HCl pH 8.8，10 mM EDTA，0.9 M蔗糖），然后在通风橱中继续研磨数分钟。</li>
	<li>将提取物转移至Oakridge离心管（Thermo Fisher Scientific Nalgene Company），室温下振荡2小时。</li>
	<li>在5,000×g、15 °C条件下离心10分钟。将上层酚相转移至新的洁净离心管中。</li>
	<li>用等体积的提取酚缓冲液反向萃取水相；在摇床上振荡30分钟。离心后将提取物转移至新的Falcon管中。</li>
	<li>重复上述步骤一次，并将提取物转移至新的Oakridge管中。</li>
	<li>通过加入5倍体积的含0.1 M乙酸铵的100%甲醇（-20 °C保存）沉淀酚相提取的蛋白质。涡旋混匀后于-20 °C过夜孵育。</li>
	<li>在20,000×g、4 °C条件下离心20分钟，收集蛋白沉淀。</li>
	<li>用冷的含0.1 M乙酸铵的甲醇洗涤沉淀2次，再用80%冷丙酮洗涤2次。向沉淀中加入1.5 mL冷的70%乙醇并悬浮，转移至2 mL微量离心管（USA Scientific）中，在14,000 rpm、4 °C条件下离心20分钟。弃去乙醇。</li>
	<li>将沉淀在SpeedVac浓缩仪中短暂干燥，然后溶解于蛋白提取缓冲液中，例如ReadyPrep蛋白提取试剂盒试剂3（8 M尿素，4% CHAPS，40 mM Tris碱，2 M硫脲）（Bio-Rad）。在14,000 rpm、20 °C条件下离心30分钟以形成沉淀，收集上清液。</li>
	<li>根据制造商说明书（Geno Technology），使用CB-X蛋白测定法测定蛋白浓度。</li>
</ol>
4. 样品制备及使用 cysTMTs 进行肽段标记
<ol>
	<li>将蛋白样品配制为浓度 2-5 μg/μL。本实验中，每种质量标签使用 100 μg 蛋白，样品体积为 20 μl-50 μL。本实验共使用了全部 6 种标签。</li>
	<li>向蛋白样品中加入等体积的烷基化缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.5，200 mM 碘乙酰胺），以封闭游离巯基。缓冲液需现配现用。在 37 °C 下反应 1 小时完成烷基化。</li>
	<li>加入 1 mL 预冷的 80% 丙酮于 -20°C 过夜沉淀蛋白。在 4 °C 下以 14,000 rpm 离心 20 分钟收集蛋白沉淀。每次用 80% 丙酮洗涤沉淀 3 次，每次均涡旋混匀。弃去上清液，将沉淀置于冰上晾干。</li>
	<li>将沉淀重悬于 50 μL 裂解缓冲液（6 M 尿素，50 mM Tris 碱，1 mM EDTA）中。然后加入 0.5 μL 的 100 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP），室温孵育 1 小时以还原二硫键。</li>
	<li>向试剂管中加入 20 μL 乙腈以溶解标签，充分涡旋并短暂离心至管底。</li>
	<li>使用 Microcon 3KD 离心过滤装置（Millipore）去除多余的 TCEP。将 50 μL 样品加入 Microcon 3KD 柱中，再加入 50 μL 裂解缓冲液。在 10,000×g、4 °C 下离心 15 分钟，重复此步骤共三次。移除滤柱并倒置插入洁净离心管中，在 1,000×g、4 °C 下离心 5 分钟以回收滤出液。</li>
	<li>检测 pH 值。如需要，用 1 M HCl 将 pH 调整至 7.0–8.0。</li>
	<li>向每个样品中加入 5 μL 的 cysTMT 试剂（cysTMT 试剂盒提供的标签可处理最多 500 μg 蛋白，共 20 μL。本方法使用 100 μg 蛋白，因此使用五分之一的标签量）。室温反应 2 小时。</li>
	<li>将样品与 Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad）按 1:1 体积比混合。</li>
</ol>
5. 未反应标签样品组分的去除
<ol>
	<li>样品在 95°C 下煮沸 5 分钟，随后在预制的 12% 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上进行电泳分离。凝胶用经滤膜过滤的 H₂O 冲洗三次，每次 5 分钟。2O 并用考马斯亮蓝（Bio-Rad）染色 1 小时。凝胶用 H2O.</li>
	<li>从每条凝胶泳道中收集十二个组分。组分根据蛋白质条带的浓度确定。将各组分切成1 mm大小的碎片，收集至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>胶块使用含50%乙腈和0.1 M碳酸氢铵的H₂O溶液进行脱色2此步骤需重复进行，直至凝胶块中的蓝色完全去除（约3–4次，每次15分钟）。</li>
	<li>脱色后的凝胶条用100%乙腈（覆盖凝胶条）干燥15分钟，移除上清液后，再用SpeedVac干燥。</li>
	<li>将胰蛋白酶（Promega）以1:10（胰蛋白酶：蛋白质）的比例溶解于与混合标记样品相同体积的25 mM碳酸氢铵溶液中。例如， 600 μg 体积为的蛋白质样品 500 μL 需求 60 μg 胰蛋白酶溶解于 500 μL 25 mM 碳酸铵</li>
	<li>将胰蛋白酶溶液加入凝胶碎块中，置于冰上进行再水合。若凝胶碎块未被完全覆盖，可补充50 mM碳酸氢铵缓冲液。再水合后，于 37 °C 12-16 小时。</li>
	<li>从孵育后的样品中移除液体蛋白提取物。</li>
	<li>终止反应，并用含5%甲酸、50%乙腈的溶液覆盖胶粒以去除残留的蛋白质消化产物。室温下振荡胶粒20分钟。将上清液转移至5.7步骤中获得的蛋白质样品管中。重复提取步骤两次。使用SpeedVac真空离心浓缩仪干燥提取的肽段。</li>
</ol>
6. cysTMT 标记肽段样品富集
<ol>
	<li>向0.5 mL离心管中加入抗TMT树脂梯度，制成50%悬液。（树脂用量根据分级凝胶中条带浓度确定：若分级组分中含有深色条带，则需要更多树脂；条带较弱的组分所需树脂较少，因其蛋白含量较低。）</li>
	<li>用一柱体积的1×Tris缓冲盐水（TBS）（25 mM Tris，0.15 M NaCl，pH 7.2）（Thermo Scientific Pierce Protein Research Products）将树脂洗涤三次。</li>
	<li>向每个样品中加入200 μL 1×TBS。然后将样品加入抗TMT树脂（Thermo Scientific Pierce Protein Research Products）中，室温下振荡孵育2小时，随后在4 °C下轻摇过夜。</li>
	<li>将样品加入层析柱（Thermo Scientific Pierce Protein Research Products）中。</li>
	<li>用1×200 μL TBS对每根层析柱洗涤三次，随后用含0.05% CHAPs的1×TBS洗涤三次。</li>
	<li>再用含4 M尿素的1×TBS对层析柱洗涤三次。然后用200 μL H2O洗涤层析柱三次。</li>
	<li>每个样品用200 μL 50%洗脱缓冲液（50%乙腈，0.4% TFA）洗脱三次。</li>
	<li>然后将样品在真空浓缩仪中干燥。</li>
</ol>
7. 质谱分析
<ol>
	<li>将样品重悬于12 μL含0.1%甲酸的3%乙腈中，并直接进样5 μL至Eksigent NanoLC-1D高压液相色谱柱（AB SCIEX，USA）。</li>
	<li>使用Proteopep II C18柱（75 μm内径 × 20 cm，New Objective，USA）分离肽段，采用4–60%梯度（A相：3%乙腈，0.1%甲酸；B相：97%乙腈，0.1%甲酸），流速为3 μL/min，运行时间为60 min。</li>
	<li>采用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL质谱仪进行肽段检测，实验模式为top 2 x 3，即单次一级质谱（MS）扫描后，依次采集3次高能C阱解离（HCD）的二级质谱（MS/MS）和3次碰撞诱导解离（CID）的二级质谱，用于蛋白质鉴定。该模式下的参数设置如下：母离子隔离宽度：3.0 m/z；碰撞能量：50%（分两步，每步10%）；仅选择双电荷和三电荷肽段进行碎裂。动态排除参数设置为：重复计数 = 1；重复持续时间 = 60；排除列表大小 = 500；排除持续时间 = 28。目标值设置如下：MS = 5 e5；MS/MS（HCD）= 1 e5。离子传输时间设置为：FTMS为500，MS/MS（HCD）为300。HCD谱图需累积2次微扫描。</li>
</ol>
8. 数据库搜索与定量分析
<ol>
	<li>使用赛默飞世尔科技 Proteome Discoverer 软件 1.2（Thermo Scientific Pierce 蛋白质研究产品）对获得的 CID 和 HCD 数据进行分析，采用分支式工作流程，通过报告离子定量器（碎片离子质量容差为 20 ppm）来量化比值。另一分支通过谱图选择器、谱图归一化器和谱图分组节点对 MS2 谱图进行处理。</li>
	<li>随后将数据提交至 SEQUEST 搜索引擎进行检索，设定质量容差为 20 ppm。固定修饰设定为 cysTMT 试剂（304.18 Da），动态修饰包括磷酸化和甲硫氨酸氧化（15.99 Da）。在两种情况下均使用基于哈佛大学 RNA 数据构建的番茄（Solanum lycopersicum）自定义数据库（包含约 350,000 条序列）13。</li>
</ol>
9. 代表性结果
对照番茄植株叶片与接种Pseudomonas后的叶片代表性图像如图1所示。可观察到对照处理叶片与Pseudomonas处理叶片之间的差异。在叶片经DAB染色并去除叶绿素后，脱色过程使组织化学染色能够显示叶片组织中活性氧（ROS）的存在迹象（图2）。图2A代表未染色的对照叶片。图2B代表经Pseudomonas处理后显示H2O2生成阳性染色的叶片。差异性氧化还原调控蛋白的Proteome Discover数据分析结果示例如图3所示。该蛋白为已知的氧化还原调控蛋白ferredoxin-114，已被证实参与抵御Pseudomonas syringae pv tomato15的过程。通过比较对照样本与接种样本的峰强度进行相对定量分析，结果显示ferredoxin-1的氧化还原调控发生显著变化（p&lt; 0.05）。高强度峰表明该蛋白在病原菌处理后发生氧化。图4为Proteome Discover数据分析结果的另一个示例，显示某一蛋白在对照样本与接种样本之间具有相似的氧化还原调控模式。强度相近的峰提示存在二硫键，但其形成不受处理条件变化的调控。该方法将彻底改变科学家检测氧化还原响应性半胱氨酸及二硫键的方式10。
<img alt="叶片比较实验示意图，分析样品A和B在植物健康与生长差异上的表现。" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 接种了对照溶液（A）和Pseudomonas（B）的番茄叶片代表性图像。
<img alt="干燥叶片比较，两个样本，A为绿色，B为褐变，表型差异，生物学研究。" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 接种番茄叶片经对照溶液（A）和Pseudomonas（B）处理后的DAB染色代表性图像。叶片使用3'-3'二氨基联苯胺进行染色，通过在95%乙醇中煮沸去除叶绿素。深色染色表明H2O2的存在。仅接种细菌培养物的叶片出现深色染色。
<img alt="质谱结果，m/z 与强度；铜绿假单胞菌与对照样品分析，柱状图。" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 铁氧还蛋白-1 的蛋白质组学发现软件数据分析结果示例，该蛋白为差异性氧化还原调控蛋白14。各峰上方的峰强度用于绝对定量，对照样品与接种样品之间的峰强度用于相对定量。
<img alt="质谱图比较对照组与假单胞菌；m/z 强度分析及碎片化。" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 蛋白质组学发现数据分析输出示例，显示某一蛋白质在对照样本与接种样本之间具有相似的峰强度。峰强度相似表明存在二硫键，且该二硫键不受处理条件变化的调控。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案提供了进行DAB染色以及cysTMT标记的氧化还原半胱氨酸定量的方法。这些技术在研究接种Solanum lycopersicum与Pseudomonas syringae后活性氧（ROS）的产生及其对蛋白质调控的影响方面具有重要意义。本方案所述方法能够以对叶片组织造成最小损伤的方式，检测整片叶片样本中的ROS。标记步骤通过半胱氨酸标记技术，可用于分析可能受氧化还原调控的蛋白质，对于研究胁迫响应的早期阶段尤为有益。
同位素编码亲和标签（ICAT）和cysTMT等方法可用于检测生物样品中潜在的氧化还原调控蛋白。ICAT技术可实现对两个样品的标记与比较12。这两种方法均可标记游离的半胱氨酸残基，并用于蛋白质定量10,12。然而，cysTMT方法能够降低实验变异性，并支持多重检测10。可用标签的数量使研究人员能够在实验设计中纳入重复样本或多组样品。增加样本数量有助于提高被鉴定蛋白质的总数。cysTMT技术的一个主要缺点是，由于对cysTMT标记肽段进行选择性富集的步骤（6.5–6.6），会降低蛋白质鉴定的整体质量。用于蛋白质鉴定的肽段数量在很大程度上取决于蛋白质序列中半胱氨酸残基的数量。该问题可通过在富集前将部分胰蛋白酶消化的样品直接用于质谱进行蛋白质鉴定来克服。
由于实验设计的性质以及cysTMT方法所采用的标记机制，某些步骤至关重要。在进行蛋白质沉淀和沉淀物洗涤（3.9）时，必须将样品保持在冰上低温环境中，以减少蛋白质降解。在cysTMT标记过程中，去除还原试剂（4.6）十分关键，因为样品可能发生逆向标记；如果样品中残留还原试剂，则可能发生逆向标记。若样品在标记后再次被还原，cysTMT标签可能被移除。一旦将标签加入样品，必须检测pH值（4.7），以确保获得最佳的标记效率。此外，数据分析取决于研究人员的具体需求以及使用该实验方案的最终目标，同时也依赖于所使用的软件，因为不同软件具有不同的算法。
本实验利用病原体作为激发子，以增强番茄中活性氧物质的产生；然而，其他受氧化还原调控的反应也可相应地进行测定。该实验设计可适用于其他植物和动物系统。

<table><tbody><tr><td>MetroMix 500</td><td>BWI 公司</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>ReadyPrep 顺序提取试剂盒 试剂3</td><td>伯乐生命医学产品有限公司</td><td>163-2104</td><td></td></tr><tr><td>CB-X 蛋白检测试剂</td><td>Geno Technology 公司</td><td>786-12x</td><td></td></tr><tr><td>cysTMT 试剂</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品</td><td>90071</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 样品缓冲液</td><td>伯乐生命医学产品有限公司</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe 考马斯亮蓝染色液（G-250 染色剂）</td><td>伯乐生命医学产品有限公司</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Microcon 3KD 离心柱</td><td>默克密理博公司</td><td>42403</td><td></td></tr><tr><td>固定化抗 TMT 树脂</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>离心柱</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品</td><td>89896</td><td></td></tr><tr><td>Proteopep II C18 柱</td><td>New Objective 公司</td><td>PFC7515-PP2-10</td><td></td></tr><tr><td>NanoLC-1D 高效液相色谱仪</td><td>AB Sciex 公司</td><td>90389</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap XL 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技有限公司</td><td>0020137580</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空离心浓缩仪</td><td>Labconco 公司</td><td>7812013</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 1.2 软件</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>普洛麦格公司</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>橡树岭离心管</td><td>赛默飞世尔科技 Nalgene 公司</td><td>3139-0050</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（2 ml）</td><td>USA Scientific 公司</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX 预制胶</td><td>伯乐生命医学产品有限公司</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td> 顶部表单 &amp;gt;Bio-Safe 考马斯亮蓝染色液底部表单 </td><td>伯乐生命医学产品有限公司</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>TMT 富集试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品</td><td>90077</td><td></td></tr></tbody></table>

使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化还原蛋白质组

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato 菌株 DC3000 不仅可引起Solanum lycopersicum的细菌性斑点病，还可感染Brassica属植物以及遗传操作便利的模式植物Arabidopsis thaliana1,2。接种DC3000后子叶中活性氧（ROS）的积累表明，ROS在番茄细菌性斑点病导致的坏死性细胞死亡过程中具有调控作用3。过氧化氢是ROS的一种组分，在番茄植株接种Pseudomonas后产生3。过氧化氢可通过组织化学染色剂3'-3'二氨基联苯胺（DAB）进行检测4。DAB染色与过氧化氢反应后在叶片组织上形成棕色沉淀4。ROS在调节细胞氧化还原环境方面具有重要作用，可改变某些蛋白质的氧化还原状态5。半胱氨酸是一种对氧化还原变化敏感的重要氨基酸。在轻度氧化条件下，半胱氨酸巯基的可逆性氧化可作为氧化还原感应器和信号转导分子，调控多种生理过程6,7。串联质谱标签（TMT）试剂能够利用串联质谱技术同时鉴定并进行多个样本中蛋白质的多重定量分析8,9。半胱氨酸反应性TMT（cysTMT）试剂可实现对来自最多六个生物学样本的含半胱氨酸肽段的选择性标记和相对定量。每种同量异位素cysTMT标签具有相同的标称母离子质量，由一个巯基反应基团、一个质谱中性间隔臂和一个质谱/质谱（MS/MS）报告离子组成10。标记完成后，样品经蛋白酶消化处理。利用含有抗TMT抗体的树脂富集标记了半胱氨酸的肽段。在MS/MS分析过程中，一系列报告离子（即126–131 Da）出现在低质荷比区域，提供相对定量信息。该工作流程可有效降低样品复杂性、提高动态范围，并用于研究半胱氨酸的修饰变化。本文介绍了采用cysTMT技术对Pst DC3000处理的番茄（Rio Grande）叶片进行氧化还原蛋白质组学分析的方法。这一高通量方法有望应用于其他受氧化还原调控的生理过程的研究。

当细胞遇到应激条件时，活性氧水平会升高。本文以Pseudomonas syringae处理的番茄叶片为例，展示3'-3'二氨基联苯胺染色以及cysTMT标记结合质谱技术对氧化还原蛋白质组进行分析的方法。

丁香假单胞菌番茄致病变种菌株DC3000不仅可引起番茄（Solanum lycopersicum）的细菌性斑点病，还可侵染芸薹属植物以及其他...

本实验的总体目标是观察丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）对番茄植株中氧化还原调控蛋白的影响。首先，用丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）接种番茄植株，以诱导病原体感染及蛋白响应。随后使用DAB（3,3'-二氨基联苯胺）染色，观察活性氧物种的变化。然后进行半胱氨酸TMT标记，以检测蛋白质中受氧化还原调控的半胱氨酸。所获得的结果可以量化处理样本与对照样本之间的变化。大家好，我是来自佛罗里达大学生物系及蛋白质组学平台的Chen。与现有的同位素涂层鱼鳍标记法（也称为 ASCA）相比，我们的 CTMT 标记技术在大规模分析氧化还原响应蛋白方面具有多重检测的优势。尽管本实验将重点揭示番茄在病原体感染条件下受氧化还原调控的蛋白质，但该方法也可应用于其他体系，如 joof、小鼠 cu 以及其他植物和应激条件的控制。我们最初产生该方法的想法，是在观察到由于仅能使用两种标签，ICAD 实验之间存在显著差异之后。该方法的VIR演示至关重要，因为标记和富集步骤较难掌握。必须尽量减少标记样品之间的实验差异，并去除冗余区域以确保高效的标记效果。现在开始操作：在直径为四英寸的花盆中种植两株大小相近的移栽番茄幼苗，用于接种物培养。在KBM平板上形成的假单胞菌单菌落草坪。将细菌刮入20毫升水中，制备浓度约为每毫升10⁶个菌落形成单位的细菌接种液。在1升接种缓冲液中，将四周大的植物浸入细菌接种液中30秒。然后立即用透明塑料袋覆盖。在适宜的接种时间后，取完全展开的叶片，将表皮朝上放置于每毫升含1毫克的DAB染色液中，真空浸润15分钟。随后将叶片在室温下避光孵育过夜。现在将染色的叶片在95%乙醇中煮沸10分钟，然后用研钵研磨，并在75%乙醇中保存。将收获的叶片在液氮中研磨成细粉。然后按照随文所述方法进行苯酚抽提。接下来，用五倍体积的冰冷0.1摩尔醋酸铵加入100%甲醇中沉淀经苯酚提取的蛋白质。通过离心收集蛋白质，并进行沉淀洗涤。然后将样品重新悬浮于1.5毫升冰冷的70%乙醇中，并转移至2毫升微量离心管中。离心后，弃去乙醇上清液，并将沉淀物在真空浓缩仪中短暂干燥。在离心形成沉淀后，用变性蛋白质提取缓冲液溶解样品，收集上清液并测定上清液中的蛋白质浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。对于六种质量标签中的每一种，取100微克蛋白质样品，加入等体积新配制的200毫摩尔碘乙酰胺烷基化缓冲液，以封闭游离的巯基，37摄氏度孵育1小时。随后，为沉淀蛋白质，加入1毫升预冷的80%丙酮，置于负20摄氏度过夜。通过离心收集蛋白质沉淀，并用80%丙酮洗涤三次。将样品在冰上空气干燥后，将沉淀重悬于50 µL裂解缓冲液中。随后，加入0.5 µL的100 mM TCEP以还原二硫键，在室温下孵育1小时。向试剂管中加入20 µL乙腈，以溶解标签。涡旋混匀后离心，以去除多余的TCEP。取50 µL样品加入MicroCon 3 kD超滤管中。加入50 µL裂解缓冲液，在4 °C、10,000 × g条件下离心15分钟。收集样品时，将柱子倒置放入干净的离心管中并进行离心。如有需要，检测样品的pH值，并用1摩尔盐酸将pH值调节至7到8之间。加入五微升的半胱氨酸TMT试剂，在室温下孵育反应两小时，合并样品后加入等体积的上样缓冲液，煮沸五分钟，然后在预制的12%聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。用过滤水冲洗凝胶三次后，用考马斯亮蓝染色一小时，并根据蛋白质条带浓度在水中脱色过夜。每条凝胶泳道分为12个组分。将每个组分切成一毫米大小的碎片，放入1.5毫升离心管中。用含有0.1摩尔碳酸氢铵的50%乙腈溶液完全浸泡凝胶碎块。随后用100%乙腈覆盖凝胶碎块，孵育15分钟。去除液体后，使用真空浓缩仪将凝胶碎块干燥。接下来，加入等体积的胰蛋白酶溶液，置于冰上进行再水合。然后在37摄氏度孵育12至16小时，以完成胰蛋白酶消化。随后，从孵育后的样品中移除液体蛋白提取物。通过加入 5% 甲酸、50% 乙腈覆盖胶粒以终止反应，并去除残留的蛋白质消化产物。然后在室温下振荡胶粒 20 分钟。再进行两次提取后，将上清液转移至已提取的蛋白质样品管中。将样品置于0.5毫升离心管中，在真空浓缩仪中干燥。根据相应蛋白质条带的强度，制备浓度成比例的TMT抗体树脂在TBS中的50%悬液。用一柱体积的1×TBS洗涤树脂三次，随后向每个样品中加入200微升TBS。然后转移至抗TMT树脂中，室温下振荡两小时，随后在4摄氏度下轻轻摇动过夜。将每个样品上样到一根色谱柱中。用200 µL洗脱液对色谱柱进行洗涤。然后用200微升50%洗脱缓冲液对每个样品洗脱三次，并在真空下干燥。将样品悬浮于12微升含0.1%甲酸的3%乙腈中，直接进样5微升至HPLC色谱柱。按照随文所述条件，采用乙腈浓度递增的梯度洗脱肽段。采用质谱法在“前二取三”工作流程中检测肽段。首先进行一级质谱（MS），然后获取三级质谱（MS/MS）谱图，采用高能量C型陷阱解离（HCD）碎裂，随后进行三级分析。采用碰撞诱导解离的质谱法进行蛋白质鉴定。使用分支工作流程分析质谱数据。应用报告离子定量器对比例进行定量。同时，通过谱图选择器、谱图归一化器和谱图分组节点对 MSM 质谱数据进行处理，并使用 Seaquest 搜索引擎进行数据查询。该图像显示了经 DAB 染色后左侧为对照组番茄植株叶片、右侧为假单胞菌接种叶片的示例。DES 染色过程使得组织化学染色能够显示叶片组织中活性氧物质的存在迹象。与预期一致，对照组未显示明显染色，而经假单胞菌处理的叶片则显示出过氧化氢产生的阳性染色。该示例展示了蛋白质组学发现数据的输出结果：通过每个样本中差异性氧化还原调控蛋白的峰面积，可实现绝对定量。对照组与接种样本之间的峰面积反映了相对含量。在此，对照样品与接种样品之间蛋白质的氧化还原调控相似。强度相近的峰表明存在二硫键，且这些二硫键不受处理条件变化的调控。一旦掌握，该技术可在一周内正确完成。请记住保持样品低温，并妥善整理标签。按照本方案操作时，使用苯酚等试剂需采取预防措施，例如佩戴耐化学腐蚀手套，并在通风橱内操作。还可进行其他检测，如翻译后修饰的质谱分析，以确定其他系统性修饰，如肌酸和谷氨酰胺的模拟修饰。观看本视频后，您应充分了解如何执行 DIB 站立式 CTMD 启用及氧化还原 16 资格认证。

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利用同位素标记的质谱剖析巯基氧化还原蛋白质

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia...

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi...

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

我们提出了一种优化的串联质量标签（TMT）标记实验方案，其中包含以下各个步骤的详细信息：蛋白质提取、定量、沉淀、消化、标记、提交至蛋白质组学平台以及数据分析。...

TMT 样本制备用于蛋白质组学平台送样及后续数据分析

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

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蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。...

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

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MALDI 样品制备：超薄层法

学习利用CysTMT标记和质谱技术分析番茄植物中受Pseudomonas syringae影响的巯基氧化还原蛋白质组，该方法可应用于其他生物系统的氧化还原调控研究。

使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化还原蛋白质组

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