Name: 在活细胞中的小GTPase活性时空操纵在亚细胞水平上几秒钟的时间刻度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学习利用光控笼锁雷帕霉素和FKBP-FRB异源二聚化技术，在活细胞中实现小GTPase活性的亚细胞水平时空精确操控。该方法结合紫外光解笼、膜锚定蛋白二聚化与活细胞成像，可在数秒内诱导目标蛋白招募至质膜特定区域，为研究细胞信号转导和蛋白质动态提供高时空分辨率的创新工具。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）研究基金（DK090868 和 GM092930，授予 T.I.）的支持。一种被保护的雷帕霉素类似物正在申请专利。

1. 质粒DNA转染
<ol>
	<li>加入质粒DNA， 0.5 μg 膜锚定的FRB（下文简称LDR）和 0.5 μg 荧光蛋白标记的FKBP-Tiam1（T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1：Rac激活剂） 37.5 μl dH2O. 添加 1 μl FuGENE HD</li>
	<li>涡旋并室温孵育20分钟。在此期间，继续进行步骤1.3–1.8。</li>
	<li>用8孔板的每孔进行洗涤 50 μl 聚-D-赖氨酸</li>
	<li>用 dH₂O 清洗每个孔的中心区域2O.</li>
	<li>消化80-85%汇合度的NIH-3T3细胞，并用10 ml培养基（含10% FBS的DMEM）重悬稀释。</li>
	<li>移除 375 μl 悬浮液以1750 rpm离心3分钟。</li>
	<li>吸出培养基，注意不要扰动沉淀物。</li>
	<li>添加 750 μl 含10% FBS的DMEM重悬。</li>
	<li>将细胞悬液加入去离子水中2O/DNA/FuGENE HD 溶液并轻轻混匀。</li>
	<li>添加 250 μl 将细胞/DNA悬液加入每孔（最多可填充3孔）。</li>
	<li>将转染后的细胞置于培养箱中孵育 37 °C 和5% CO2 15–18 小时。</li>
</ol>
2. cRb-A 溶液的制备
<ol>
	<li>合成笼锁型雷帕霉素-生物素加合物（cRb）。详见“cRb的合成路线”。简言之，笼锁基团和生物素基团分别制备；随后将笼锁基团与雷帕霉素（LC lab）偶联，再通过点击化学反应7将产物与生物素基团连接，得到cRb。</li>
	<li>用DMSO配制1 μM的cRb储备液。</li>
	<li>在0.5 ml离心管中，将1 mg亲和素溶于250 μl PBS中。</li>
	<li>向溶解的亲和素中加入1 μl cRb储备液，通过反复倒置混匀。</li>
	<li>室温孵育15分钟，获得cRb-亲和素偶联物（cRb-A）溶液。</li>
	<li>使用尺寸排阻柱去除未结合的小分子，并纯化cRb-A。</li>
</ol>
3. 亚细胞水平的显微镜观察与光照
<ol>
	<li>将转染后的细胞在不含FBS的DMEM中进行血清饥饿处理12小时。</li>
	<li>轻柔吸去细胞培养液，并加入250 μl已配制的400 nM cRb-A 溶液（来自步骤2.6）。</li>
	<li>为在亚细胞分辨率下观察活细胞中光照处理前后蛋白质的动态变化，采用转盘共聚焦显微镜成像（图2a）。紫外线照射通过将紫外LED光源（365 nm）与落射荧光光学系统耦合实现（图2b）。</li>
	<li>使用MetaMorph软件每15秒采集一次转染细胞的荧光图像。</li>
	<li>利用涂有可被紫外光激发的荧光染料的玻璃片来确定照射光斑的坐标和大小。通过选用不同放大倍数的物镜以及不同纤芯尺寸的光纤，可调节光斑大小。</li>
	<li>在确定膜皱褶的本底水平后，对细胞边缘区域进行紫外光照射。以下两个步骤用于对比此前局部处理所产生的效应。</li>
	<li>使用汞灯提供的365 nm光对细胞进行全细胞范围照射。</li>
	<li>将解笼释放后的原始雷帕霉素溶于DMSO，再溶于PBS（终浓度为400 nM），然后将该溶液加入成像腔室以诱导全局效应。</li>
</ol>
4. 代表性结果
代表性结果示例如图3所示。在细胞边缘附近的小区域进行紫外光照射，仅在照射区域及其邻近区域迅速诱导出局部皱褶的形成。为了证实这一现象确实是局部性活动，我们随后对细胞进行了全细胞范围的紫外照射，或向培养基中添加雷帕霉素，这两种处理均诱导了细胞膜上广泛分布的全局性皱褶形成。为了进行定量分析，我们将目标细胞划分为四个象限，并在不同条件下（包括对照组）分别统计局部刺激和全局刺激后各象限中皱褶形成的频率（图4）。只有紫外光照射、cRb-A以及适当的FKBP-FRB构建体三者结合，才能诱导局部皱褶的形成。
<img alt="局部二聚化示意图；紫外光触发的化学过程，cRb-A，HE-Rapa 结构，细胞膜。" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 利用笼锁型雷帕霉素-亲和素偶联物（cRb-A）和紫外光实现空间限制性蛋白质二聚化的示意图。紫外光照射可切断雷帕霉素与生物素之间的连接链，从而释放化学二聚化分子（HE-Rapa，C40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素）及其副产物。释放的二聚化分子随后扩散进入细胞，并仅在照射区域（蓝色圆圈）附近诱导 FKBP-POI（目标蛋白）与锚定于质膜上的 FRB 发生二聚化。若无紫外光照射，FKBP 与 FRB 不发生结合（红色叉号），因此不产生任何效应。（版权@ACS2011）6
<img alt="共聚焦荧光显微镜装置；光学激发与发射分析；设备示意图。" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 定制共聚焦荧光显微镜的照片。(a) 共聚焦显微镜的正面视图（倒置 Axiovert 200，Zeiss）。(b) EPI 荧光和紫外照明耦合单元的特写顶部视图。
<img alt="显微镜图像中细胞形态变化，显示处理前后的结构差异。" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 局部紫外线照射诱导转染的NIH3T3细胞中空间受限的皱褶形成。将转染了YFP标记的FKBP-Tiam1（Rac激活剂）和LDR（膜锚定FRB）的NIH3T3成纤维细胞，在其边缘附近限定区域用365 nm LED光照射15秒（从210秒开始），同时在培养基中存在cRb-A偶联物。随后在1063秒时用汞灯进行全细胞照射1秒，并在1560秒时全局加入雷帕霉素至终浓度400 nM。该细胞在初始阶段几乎无皱褶活动（a），但在局部照射后出现空间受限的皱褶（黄色圆圈标记区域）（b）。在全局照射并加入雷帕霉素后，细胞表现出全细胞范围的皱褶形成（c-d），表明局部皱褶的形成是由Rac蛋白的空间受限激活所引起的。比例尺：10 μm。（Copyright@ACS2011）6
<img alt="在不同紫外条件下，cRb-A 和亲和素处理对皱褶形成频率的柱状图。" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 转染的NIH3T3细胞在四个象限中皱褶形成的频率。对13个细胞进行了使用cRb-A的局部紫外照射以及随后的全局紫外照射。分别对13、5和6个细胞实施了添加cRb-A（无紫外照射）、局部紫外照射以及有或无亲和素的局部紫外照射。在未进行紫外照射的cRb-A处理组，或在体相溶液中进行有或无亲和素的局部紫外照射组中，均未观察到细胞出现皱褶形成。我们收集了背景皱褶形成水平较低但具有雷帕霉素诱导皱褶形成能力的细胞数据，每次实验后通过加入雷帕霉素（终浓度400 nM）确认全局皱褶形成以验证该能力。这些结果表明，cRb-A和局部紫外照射对于细胞内局部皱褶的形成是必需的。（版权@ACS2011）6
缩写：
FKBP：FK506结合蛋白 
FRB：FKBP-雷帕霉素结合蛋白 
Tiam1：T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1（Rac鸟苷酸交换因子） 
LDR：Lyn-DSAG连接肽-FRB（Lyn：Lyn激酶N端11个氨基酸） 
HE-Rapa：C40-O-(2-羟乙基)雷帕霉素 
cRb：带有生物素基团的笼锁型雷帕霉素 
cRb-A：与亲和素偶联的cRb

<ol><li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li>
<li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li>
<li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+%28FRET%29%3A+Implications+for+signaling+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li>
<li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li>
<li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific%2C+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li>
<li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am+.Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li>
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<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li>
<li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+protein+assembly%3A+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li>
<li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns%284%2C5%29P2+gate+KCNQ+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li>
<li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们描述了一种技术，该技术利用一种新型笼状化合物，并结合FKBP-FRB异源二聚化系统，可在数秒的时间尺度上精确调控细胞内特定亚细胞区域的Rho GTP酶活性。
当前方法存在三个局限性。首先，由于该方法依赖于阻止或允许二聚化诱导剂在质膜上的扩散，因此目标细胞定位必须是质膜或其附近区域。若能进一步优化cRb的化学结构，则有可能使该化合物在未受光照时不诱导二聚化的情况下进入细胞。使用此类二聚化诱导剂，理论上我们可操控细胞内任意位置的信号分子活性。其次，化学二聚化剂、FKBP-FRB二聚化复合物或活化的内源性信号分子的分子扩散会显著影响预期效应的精确定域。这种效应在较晚的时间点尤为明显，并且依赖于紫外光照射的相关参数（如光束宽度、能量以及光束模式（连续或脉冲））以及所涉化合物的扩散系数。通过进一步的经验性优化这些参数，可实现对信号活性更严格的限定。第三，紫外光对细胞具有不可忽视的光毒性。缓解这一问题的一个简便方法是使用更长波长的光（例如405 nm）来解笼硝基苯甲基保护基团。双光子激发解笼则可在更长波长下进行照射，同时实现对细胞极局部区域的精确操控。

近期，其他研究人员已报道了一种利用...

活细胞中亚细胞水平及秒级时间尺度下小gtp酶活性的时空操控

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Rho家族小分子三磷酸鸟苷酶（GTP酶）在时空上的动态调控对于多种细胞功能和生物学事件至关重要1, 2。通过实时可视化其活性和亚细胞定位，已揭示了这些蛋白在时空上的动态特性3。为了在分子水平上更深入地理解它们在多种细胞功能中的作用，下一步应在精确的亚细胞位置和时间点上对这些蛋白的活性进行干预。
为实现这一目标，我们开发了一种通过结合两种技术来实现光诱导、时空可控的小GTP酶激活方法：（1）雷帕霉素诱导的FKBP-FRB异源二聚化；（2）雷帕霉素的光解保护技术。利用雷帕霉素介导的FKBP-FRB异源二聚化，我们建立了一种可快速诱导激活或失活小GTP酶（包括Rac4、Cdc424、RhoA4和Ras5）的方法，其中雷帕霉素可诱导与FKBP融合的GTP酶或其激活因子转位至锚定有FRB的质膜上。为与该异源二聚化系统相耦合，我们还开发了雷帕霉素类似物的光解保护系统。光解保护化合物是一类其活性被光可裂解保护基团（即“笼锁基团”）抑制的小分子。为了完全抑制异源二聚化活性，我们设计了一种被连接至大分子上的笼锁型雷帕霉素，使其形成的复合物体积较大而无法穿过质膜，从而在细胞内几乎不产生作为化学二聚剂的背景活性6。图1展示了本系统的示意图。通过整合这两个系统，我们可在数秒的时间尺度上将Rac激活因子局部招募至质膜，并实现了亚细胞水平上的光诱导Rac激活6。

本文描述了一种利用光控小GTP酶活性的时空调控方法。该方法基于雷帕霉素诱导的FKBP-FRB异源二聚化及光敏保护基团系统。通过优化光照条件，可实现亚细胞水平上小GTP酶活性的时空精确控制。

活细胞中亚细胞水平及秒级时间尺度下小GTP酶活性的时空操控

小GTP酶Rho家族的动态调控具有高度的时空精确性，对于多种细胞活动至关重要……

本视频展示了一种利用紫外光调控细胞质膜上蛋白质活性的方法。具体操作为：将细胞共转染带有膜锚定FRB蛋白和目的FKBP融合蛋白。随后向培养基中加入光笼型雷帕霉素衍生物。随后在活细胞成像过程中，对细胞的特定区域施加紫外光。雷帕霉素与生物素之间的连接子被切断，释放出化学二聚体分子及其副产物；释放的二聚体分子扩散进入细胞，并诱导FKBP标记的目标蛋白与质膜锚定的FRB在照射区域发生二聚化。在无紫外辐射的情况下，FKBP与FRB不发生相互作用，因而不产生任何效应。数据分析显示，基于其生理效应，FKBP融合的目的蛋白呈现出高度局部化的招募。与药理学和遗传学方法等现有技术相比，该技术的优势在于作用速度快、靶向特异性强以及空间分辨率高。该技术的应用意义延伸至癌症治疗领域，因为癌细胞的迁移是导致癌症转移的后果。因此，调控关键迁移因子的活性可能揭示其精确的分子机制，这是实现其治疗和治愈的前提。演示该实验操作的人员为本实验室的研究生克里斯·保罗·迈耶（Chris Paul Meyer）和技术员鲍勃·德罗泽（Bob de Rose）。开始本方案时，先在无菌微量离心管中混合以下组分：质粒DNA、膜锚定的荧光标记FRB-FKBP融合蛋白、TIA-1以及去离子水；向混合物中加入一微升的几基因HD，然后涡旋振荡。将试管在室温下孵育 20 分钟。孵育期间，向玻璃八孔腔室的每个孔中加入 50 µL 多聚赖氨酸，孵育 1 分钟以包被表面，然后吸除溶液，并用 50 µL 去离子水洗涤每个孔的中心区域。接下来，用胰蛋白酶处理 80% 至 85% 汇合的 NIH 3T3 细胞。细胞脱落后，加入 10 毫升含 10% FBS 的 DMEM，将 375 微升细胞悬液转移至 15 毫升无菌离心管中，在 1,500 ×g 下离心 3 分钟。离心结束后，小心吸除上清液。加入 750 微升含 10% FVS 和 Resus 的 DMEM。通过轻轻吹打数次重悬沉淀。最后，将细胞悬液加入转染溶液中，用移液枪头轻轻搅动，向培养板的每个孔中加入250 µL细胞转染悬液。轻轻混匀后放入培养箱孵育。37摄氏度孵育15至18小时。为合成笼状雷帕霉素生物素加合物，首先在无菌离心管中用DMSO配制1毫摩尔/升的CRB储备液；另取一个1.5毫升微量离心管，将1毫克avidin溶于250微升PBS中。接下来将保护基团与雷帕霉素偶联。向溶解的AVID中加入0.5微升CRB储备溶液，通过反复倒置混合，室温孵育15分钟。为获得CRB-AVID偶联产物溶液并去除未结合的小分子，纯化CRBA时，用300微升PBS平衡G-25凝胶过滤柱。柱子平衡后重复五次。将125微升CRBA溶液加至柱床中心。然后在室温下以800 ×g离心两分钟，收集流穿液于1.5毫升微量离心管中，用于细胞转染后处理。更换为不含 FBS 的 DMEM 培养基，使细胞处于无血清培

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