在活细胞中的小GTPase活性时空操纵在亚细胞水平上几秒钟的时间刻度
2012年3月9日
被描述为轻小GTPase活性的时空控制的方法。这种方法是基于FKBP-FRB雷帕霉素诱导的异二聚体和照片囚禁系统。优化的光照射，使时空，时间控制在亚细胞水平的小GTP酶激活。
该视频演示了一种使用紫外光来纵质膜上蛋白质活性的方法。为此，用膜锚定的 FRB 蛋白和感兴趣的 FK BP 融合蛋白对细胞进行 cot 转染。将光笼雷帕霉素衍生物添加到培养基中。
然后在活细胞成像过程中，将紫外线施加到细胞的特定区域。雷帕霉素和生物素之间的接头被裂解，释放出化学二聚体及其副产物，释放的二聚体扩散到细胞中，并诱导 FKBP 标记的目标蛋白与质膜锚定的 FRB 在照射区域之间的二聚化。没有紫外线辐射，FKBP 和 FRB 不会结合，因此不会产生任何影响。
数据分析显示，根据其生理效应，FKBP 目标融合蛋白的高度局部募集。与现有方法（如药理学和遗传学方法）相比，该技术的优势在于作用速度、靶标特异性和空间分辨率的结合。这项技术的影响延伸到癌症转移是癌细胞迁移的结果的治疗。
因此，纵关键迁移因子的活性可能会揭示其精确的分子机制，这是其治疗和治愈的先决条件。演示程序的是研究生 Chris Paul Meyer 和我实验室的技术员 Bob de Rose。通过将以下内容混合在无菌微量离心管质粒中开始此方案，DNA、膜栓系的 FRB 荧光标记的 FKBP、TIA one 和去离子水，向混合物中加入 1 微升几个基因 HD 并涡旋。
将试管在室温下孵育 20 分钟。在孵育过程中，向玻璃八孔室一侧的每个孔中加入 50 微升 poly de lycine，孵育 1 分钟以覆盖表面，然后吸出溶液并用 50 去离子水清洗每个孔的中心。接下来胰蛋白酶是 80% 至 85% 汇合的 NIH 三 T 三细胞。
细胞分离后，加入 10 mL含有 10% FBS 的 DMEM，将 375 μL 悬浮液转移到 15 mL无菌管中，并以 1， 500 G 离心 3 分钟。旋转后，小心吸出培养基。添加 750 微升含 10% FVS 和 Resus 的 DMEM。
通过轻轻上下吹打数次来悬浮沉淀。最后，将细胞悬液加入转染溶液中，并使用移液器吸头轻轻搅拌，向腔室的每个孔中加入 250 μL 细胞转染悬液。滑动并孵育。
37 摄氏度 15 到 18 小时。合成笼雷帕霉素，生物素加合物。首先在单独的 1.5 mL微量离心管中的无菌离心管中制备 1 毫摩尔的 CRB 在 DMSO 中储备溶液，将 1 毫克 avadon 溶解在 250 μL PBS 中。
接下来将笼部分与雷帕霉素结合。将 0.5 μL CRB 储备液加入溶解的 AVID 中，倒置数次，然后在室温下孵育 15 分钟。为了在偶联溶液中产生 CRB AVID 以排除未结合的小分子并纯化 CRBA，用 300 μL PBS 平衡 G 25 尺寸的排阻柱。
色谱柱平衡后重复 5 次。将 125 μL CRBA 溶液加载到色谱柱的中心床上。然后在室温下以 800 G 离心溶液 2 分钟，转染细胞后，将流出的液流收集在 1.5 mL 微量离心管中。
将培养基交换为不含 FBS 的 DMEM，使其脱离血清，使细胞饥饿，孵育 12 小时。孵育后，轻轻吸出培养基并加入 250 微升制备的 1 微摩尔 CRBA 溶液。接下来，为了可视化活细胞中的蛋白质动力学，使用具有紫外线照明的转盘式共聚焦显微镜耦合光学元件，以获得 365 纳米的 UV LED 光。
用落射荧光。通过使用涂有 UV 光激发的荧光染料的玻璃板来定义照明点的坐标和大小。这允许对要照射的区域进行微调。
使用 100 x 物镜和落射荧光将带有细胞的腔室载玻片放在载物台上。将单元格聚焦并找到一个单元格。对于成像，在确定生理效应的背景水平后开始对细胞进行成像。
在这里，测量膜褶皱，在细胞的一个选定象限中照射紫外光，解开笼溶解，从而在 DMSO 中溶解原始雷帕霉素，然后在 PBS 中达到 400 纳摩尔的最终浓度。向成像室中加入 100 微升溶液以诱导全局效应。每 15 秒捕获一次荧光图像，持续 20 分钟，以确定 RAC 的局部激活是否可以诱导局部褶皱形成。
用 YFP 标记的 RAC 激活剂 FK bp 、 TIA one 和 LDR 转染 NIH 3 T three 细胞，LDR 是锚定的膜。在黄色圆圈表示的单元边缘进行 FRB 局部照射，然后从 1063 秒开始用汞灯进行 1 秒的全局照明。从这里可以看出，开始时几乎没有出现膜褶皱。
然而，在局部照明后，在全局照明和添加雷帕霉素后观察到空间受限的褶皱，这导致 FK bp TIA one 易位到质膜。该单元显示整体褶皱形成，表明先前观察到的局部褶皱形成是由机架的空间受限激活引起的。为了进行定量分析，将目标细胞分为四个象限，并确定了局部和随后全局刺激后每个象限中荷叶边形成的频率，如图所示。
观察到的细胞均未显示 CRBA 形成褶皱，无 uve a 辐射或局部 uve，在散装培养基中有或没有 Aden 的辐射。然而，当添加 CRBA 并进行紫外线照射时，在仅照射第一象限时，在所有具有全球辐射的象限中可以看到褶皱形成的频率约为 90%，褶皱形成的频率为 100%，而第二至第四象限为 30%25% 和 30%。这些结果表明，雷帕霉素的局部解笼可用于在单个细胞中诱导高度局部的生理效应。
在这种情况下，机架激活引起的膜褶皱。看完这个视频，你应该对如何通过光实现小g TPAs活性的时空控制有了很好的了解。该方法可应用于任何依赖于特定蛋白质转位到质膜的生理过程。
在尝试此程序时，请务必记住为每个程序新鲜制备溶液、试剂和细胞。不要忘记，在紫外线下工作可能非常危险，应始终佩戴紫外线眼镜等预防措施。
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概述
本文描述了一种使用光进行小GTP酶活性时空控制的方法。该技术涉及雷帕霉素诱导的FKBP-FRB异二聚体化和光笼系统，以实现亚细胞水平的精确激活。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- 小GTP酶在细胞信号传导中扮演着关键角色。
- 传统的控制GTP酶活性的方法缺乏空间和时间精确性。
- 基于光的技术为操纵蛋白质活性提供了一种新方法。
- 雷帕霉素是一种在各种生物学应用中使用的著名化学二聚化剂。
研究目的
- 开发一种使用光进行小GTP酶活性精确控制的方法。
- 增强对亚细胞水平GTP酶功能的理解。
- 为研究细胞信号传导途径的研究人员提供一种工具。
使用的方法
- 细胞被共转染膜锚定的FRB和FKBP融合蛋白。
- 将光笼雷帕霉素衍生物引入培养基。
- 在活细胞成像过程中，将紫外光应用于特定区域。
- 在被照射区域诱导FKBP和FRB之间的二聚化。
主要结果
- 成功展示了对小GTP酶活性的时空控制。
- 该方法允许在质膜上进行靶向操纵。
- 在没有紫外线辐射的情况下，没有发生二聚化，证实了特异性。
- 这种技术为研究GTP酶功能开辟了新途径。
结论
- 开发的方法为研究人员提供了一种强大的工具。
- 它能够在活细胞中精确控制蛋白质活性。
- 这种方法可以推进对细胞信号传导机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise spatio-temporal manipulation of small GTPase activity enables direct interrogation of signaling pathways that drive cell migration and morphology, critical for early-stage target validation in oncology and cell biology. This method provides rapid, localized protein activation, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence at key discovery inflection points. Its ability to dissect subcellular signaling events informs portfolio decisions on pathway-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid, localized perturbation of small GTPase activity to clarify pathway function.
- Supports functional target validation by linking protein activation to immediate cellular responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating effects to specific subcellular regions.
- Improves predictive confidence for advancing targets implicated in cell migration and morphology.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of modulators affecting GTPase-driven processes.
- Delivers high spatial and temporal resolution for quantitative assay outputs.
- Enables reproducible, standardized activation protocols for comparative compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse across diverse protein targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by manipulating migration factors implicated in metastasis.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of pathway-specific interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying molecular mechanisms underlying cell behavior.
- Supports translational biomarker development through precise control of signaling events.
Pipeline & Workflow Integration
This light-inducible system integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by enabling rapid, localized activation of signaling proteins.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for evaluating compound effects on targeted pathways.
- Analytics: Generates spatially resolved measurements of protein activity and downstream cellular responses.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to disease-relevant models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various protein targets and cellular contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pathway analysis.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable activation protocols.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of pathway-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and protein engineering.
- Needs access to confocal microscopy with UV illumination capabilities.
- Demands rigorous cross-team standardization of transfection and activation protocols.
- Adaptable to multiple cell types and protein targets with appropriate construct design.
- UV safety precautions and fresh reagent preparation are essential for reproducibility.
