通过DNA家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体

以下实验的总体目标是构建一个高度多样化的合成腺相关病毒衣壳文库，从中可筛选出具有理想特性的病毒颗粒。该目标首先通过控制性DNA酶切将克隆并筛选出的腺相关病毒（aav）衣壳基因片段化，随后通过两轮PCR反应将其重新组装为嵌合序列。第二步是将所得的PCR产物重新克隆至具有复制能力的腺相关病毒（aav）载体中，从而构建包含至少100万个不同腺相关病毒（aav）衣壳基因的质粒文库。

接下来，将该质粒文库与腺病毒辅助质粒共同转染至293T细胞中，以产生可于靶细胞或动物体内进行筛选的嵌合病毒文库。实验结果表明，通过在培养细胞或成年小鼠中实现增强或更特异性的报告基因表达，成功实现了新型合成AAV载体的分子工程改造与进化。该技术相较于现有方法（如肽段展示技术）的主要优势在于，DNA家族改组技术能够同时改变并优化AAV衣壳的多个特性，从细胞结合、胞内运输到脱壳及在细胞核内的基因表达均可得到改良。

该方法有助于回答基因治疗和病毒学领域的关键问题，例如如何为特定的治疗应用获得理想的载体，或如何解析病毒衣壳中负责某种特性的功能区域。该技术的应用前景广泛，可推动多种人类疾病的治疗，包括病毒感染性疾病，因为我们的方法能够实现腺相关病毒（AAV）载体的分子进化，使其特异性且高效地感染特定的病毒靶细胞，例如感染HIV的T细胞或感染肝炎病毒的肝细胞。尽管该方法也可用于深入理解AAV的生物学特性，并可用于改进基因治疗中的AAV载体。

该方法也可轻松应用于其他具有基础或应用价值的基因家族，例如剂量编码荧光基因、三种报告基因、细胞酶或参与RNA干扰的蛋白质。我们最初产生这一方法的想法，是在尝试寻找一种合适的载体，用于将治疗性基因转导至成年小鼠的肝细胞时。当时我们意识到，所有天然存在的腺相关病毒（AV）血清型均存在某些缺陷，例如在人群中普遍存在，因而导致较高的预存免疫发生率，或尽管在体外转导效率较高，但在体内表现不佳。本方法的可视化演示至关重要，因为基于DNA的AV衣壳基因片段化以及部分病毒文库制备步骤较难掌握，需要实践经验并对关键操作环节有充分认识，以促进常规制备足量的各类腺相关病毒衣壳基因。

为了进行DNA洗牌，首先将这些基因亚克隆到一个共同的质粒骨架中。为此，使用引物cap F和cap R，通过PCR从常见的AAV质粒中扩增出所需的cap基因。然后将cap基因克隆到一个经过改造的质粒中，该质粒含有特定的引物结合位点以及限制性酶切位点。在此示例中，cap基因被克隆至PAC1和SC1位点，这些位点存在于用于cap基因扩增的引物以及受体质粒中，但在大多数AAV中并不存在。在构建完成编码AAV衣壳蛋白基因的质粒组后，开始进行cap基因洗牌的PCR操作，使用T3和T7引物扩增所选的cap基因。

设置一个50微升的PCR反应体系，包含200纳克的帽质粒、每种引物终浓度为2微摩尔、10微升5倍高保真缓冲液以及1微升高保真聚合酶。该反应可产生约3微克的PCR产物，足以用于最多六次基因片段洗牌反应，具体取决于文库中包含的帽基因数量。首先在95摄氏度下反应5分钟，随后进行40个循环：94摄氏度15秒、57摄氏度30秒、68摄氏度3分钟，最后在72摄氏度下延伸10分钟。

纯化PCR产物后，通过受控的DNA消化反应将cap基因切割成片段，用于重新组装至Kyra中。该实验步骤中最困难的部分之一是获得一定有用大小范围的消化后cap基因DNA片段，以实现向Kyra的有效重组。为实现这一目标，我们首先准备足量的纯化cap基因，并设置多个在不同条件下进行的平行反应。为均等地建立消化反应体系，将不同的cap基因PCR产物混合，总体积为54微升，总DNA量为4微克，然后小心加入6微升DS反应缓冲液和0.5微升DNase I。轻柔涡旋混匀三次，短暂离心后立即置于25摄氏度的加热金属块上。

将第一次反应孵育1分钟。接着，准备第二次消化反应，但在25摄氏度下孵育1分钟15秒。以此方式，设置多个平行反应，孵育时间介于1至2分钟之间，每次孵育时间递增15秒。

通过加入6微升25毫摩尔EDTA终止每个反应。短暂涡旋混匀管子，并在75摄氏度下孵育10分钟。多个平行反应将产生五个经DNA消化的帽样品，其中一个用于不同孵育时间的实验，随后在标准1% AROS凝胶上纯化帽片段。

理想情况下，条带应显示在 100 至 500 个碱基对之间，如本示例所示，起始孵育时间分别为 1 分钟、45 秒或 2 分钟。通过 A PCR 将帽片段进行 DNA 家族洗牌，利用部分同源性实现自我引物延伸，从而重新组装为全长序列。设置一个 50 微升反应体系，包含 500 纳克纯化的片段、10 微升 10× 融合缓冲液、1 微升 10 毫摩尔的 dNTPs、1.5 微升 DMSO 和 0.5 微升融合酶。

两种聚合酶在98摄氏度下孵育30秒，随后进行40个循环：98摄氏度10秒、42摄氏度30秒、72摄氏度45秒，最后在72摄氏度下延伸10分钟。接下来，通过第二轮PCR扩增重新组装的衣壳基因，用于后续克隆，PCR引物结合于保守的侧翼序列。例如，SAF与SAR或CUF与CUR，设置一个50微升反应体系，包含2微升第一轮PCR产物、每种引物终浓度为2微摩尔、0.5微升氯化镁、10微升5×高保真缓冲液以及1微升高保真聚合酶。

建议进行 16 至 24 个 PCR 反应，以确保后续克隆所需的足够高产量。在合并 PCR 产物并纯化全长帽子条带后，下一步是用 PacI 和 AscI 消化纯化的帽子基因池，以便将其克隆到具有复制能力的 AAV 质粒中。受体质粒携带 AAV 反向末端重复序列，其两侧环绕着在 AAV P5 启动子控制下的 AAV2 rep 基因，以及 PacI 和 AscI 位点。

rep 基因下游的限制性酶切位点可用于对重排后的衣壳基因片段进行同框克隆。箭头所示的 LSE 引物结合位点可用于衣壳基因测序，将衣壳基因片段与适当切割的受体质粒骨架以 3:1 的摩尔比混合。配制总体积为 40 微升的预混液，足以进行 20 次转化，最终 DNA 浓度为每微升 15 纳克。

于次日在16摄氏度条件下过夜孵育，将连接反应产物转化至大肠杆菌中。取2微升连接反应产物与30微升电转感受态大肠杆菌混合，转移至预冷的冰上电穿孔比色皿中，以1.8千伏、200欧姆和25微法拉的参数进行电击，时间常数应接近5毫秒。立即加入1毫升预热的SOC培养基，并转移至250毫升的锥形瓶中。

进行20次此类电穿孔可获得一个多样性约为1×10⁶个不同克隆的文库。向混合的转化产物中加入一体积预热的SOC培养基，在37°C、180 RPM条件下振荡培养1小时。然后将40毫升混合转化产物加入800毫升含氨苄青霉素的LB培养基中，在相同条件下继续孵育16小时，随后使用 commercially available kit（商品化试剂盒）纯化文库质粒DNA。

病毒文库的制备始于将aav文库转染至HEC 293T细胞。开始此操作时，将HEC 293T细胞接种于10至15个直径10厘米的培养皿中，并在37°C条件下培养48小时。每次转染需在两个独立的试管中分别配制以下两种试剂混合物。以下用量为每10个培养皿在第一个试管中的配比。

在第一个离心管中，加入7.9毫升氯化钠和DNA，并加水至总体积为15.8毫升。在第二个离心管中，加入3.52毫升聚乙烯亚胺、7.9毫升氯化钠和4.38毫升水。将两种溶液混合后涡旋振荡，室温孵育10分钟，然后将溶液均匀分配至每盘HEK 293T细胞中。于37°C孵育。

48小时后，可收集病毒文库。将细胞刮入培养基中，合并所有培养皿中的细胞至一个离心管内，以1200转/分钟离心15分钟。将细胞沉淀重悬于6毫升裂解缓冲液中，随后进行五次冻融循环。完成五次冻融循环后，加入Ben Nase，在37摄氏度下孵育1小时。

接下来，以 3,750 RPM 离心 20 分钟，沉淀细胞碎片。使用移液管将 5 毫升病毒悬液加入 Beckman Quicks seal 离心管中，制备用于病毒纯化的密度梯度，随后依次加入 1.5 毫升的 15%、25% 和 40% 碘克沙醇溶液。最后用裂解缓冲液补满，于 4°C 下以 50,000 K 超速离心 2 小时。

超速离心完成后，将离心管从转子中取出，并用70%乙醇擦拭管外壁。在管顶部插入一根针头以通气，再用另一根针头吸取1.2毫升的40% IOL组分。注意避免吸取25%组分，因其含有空颗粒。

A a v 衣壳。通过使用原始质粒文库中的单个克隆来制备表达报告基因的重组 A a v 载体，分析其功能性和多样性。随后用不同剂量的纯化病毒分别感染培养的细胞或动物，并测定转导效率。

此处展示的是三种人源细胞系感染了五种不同重组 YFP 表达 a a v 载体（使用重排的 cap 基因构建）后的荧光显微镜结果。分析转导效率的另一种方法是基于荧光报告基因表达水平的定量检测。该图展示了四种细胞类型——人源肾细胞、人源宫颈细胞、小鼠成纤维细胞和人源 T 细胞——感染了 18 种不同重组 YFP 表达 a V 载体（从原始文库中随机选取，使用重排的 cap 基因构建）后的典型结果。

YFP 表达采用颜色编码以便于可视化。图中显示的是转导细胞的百分比，其中黑色表示 0%，白色表示每种细胞类型克隆中的最高测量值。克隆 B2 红色示例代表一种总体效能较差的克隆，这在未经筛选的衣壳中可以预期。随后可针对病毒文库进行筛选，以获得在特定细胞系或动物体内表现出一种或全部所需特性的单个病毒颗粒，用于筛选。

在培养的细胞中，首先用文库和ENO病毒的不同等分试样共同感染细胞，以支持a a v的生长，随后收集细胞并提取扩增后的a a v，用于再次感染新细胞。确定共感染过程中a a v与腺病毒的最佳比例至关重要；评估a a v感染效果的一个有效指标是病毒接种后三天出现细胞病变效应，表现为细胞变圆并脱落。在本图中，左上角的图示显示未感染的细胞，而其他图示则显示用不同数量（以每个细胞的病毒颗粒数表示）的腺病毒感染的细胞。另一个用于检测a a v感染与扩增的有效方法是通过Western印迹法检测衣壳蛋白，使用B one抗体识别高度保守的a a v衣壳表位。

左侧印迹显示细胞共感染了不同体积（微升）的 a a V 文库和辅助 ENO 病毒。前两泳道是产生几乎无法检测到的 a a v 蛋白表达的典型条件示例，表明 a a v 感染与扩增程度适中而不过量，从而实现了理想的基因型-表型紧密关联。因此，使用这些上清液的 0.11 或 10 微升对新鲜细胞进行再次感染。

右侧细胞显示了蛋白质印迹实验的结果。LA细胞被仅含有空载体a v的病毒感染，作为阴性对照。此外，通过DNA测序监测多轮感染过程中文库多样性的变化也至关重要。

该图展示了基于AAV2、AAV8和AAV9构建的AAV克隆文库在筛选前后的蛋白序列比较，红色线条上方的序列为亲本AAV。紫色箭头表示同源重组事件。红色箭头标记了在所有筛选获得的克隆中均发现的AAV2与AAV9之间的交叉重组。在动物体内进行筛选时，将AAV文库注入动物体内，随后从靶细胞或组织中回收病毒基因组，通过PCR扩增后重新克隆并重新包装，用于下一轮感染。

图中展示了一个示例：在外周注射文库一周后，从小鼠肝脏中成功挽救出被感染的 aav 克隆。泳道一显示了预期的 2.2 千碱基条带，泳道二为无模板对照；泳道 M 中 DNA 标记物条带的大小以千碱基表示。无论采用何种筛选方法，富集后的衣壳变异体最终都必须在适当的系统中进行验证。

此处展示了富集型 a a V 嵌合体在培养细胞中表现出优越性能的示例。颜色越深，表示每颗粒数的感染性越高，即克隆效果越好。A-A-V-D-J 在多种细胞系中均优于八种天然 a a v 野生型的组合。

最后，展示了在小鼠肝脏中对选定的 a a V KYMERA 克隆进行分析的结果。该 a a V DN 克隆是基于对肝癌细胞具有靶向性的筛选获得的，随后用于生成表达荧光标记的重组载体。在我们的代表性实验中，每组三只小鼠，在外周静脉注射等剂量的该载体或基于野生型 AAV8 的对照载体一周后进行检测；AAV8 是目前已知在小鼠肝脏中转导效率最高的天然血清型之一。需要注意的是，尽管 a a V DN 克隆在肝脏中的总体表达水平略低，但其对肝脏的特异性更高，因为在将肝脏表达水平通过成像软件校正后，其在非肝组织中的脱靶表达显著减少。

如果操作得当，从扩增 a a V 衣壳基因开始，到最终获得病毒文库，该技术可在一周内完成。在尝试此实验流程时，需注意本方案基于我们筛选天然 AV 血清型的经验总结而来，因此其他研究者在构建自身定制文库时，很可能需要对部分条件进行调整和优化。除本方法外，还可采用其他技术，如利用 AGENESIS 进行位点特异性肽段展示，或基于 PCR 的随机化方法，以构建高度多样化的文库，或进一步优化通过 DNA 家族改组技术开发并富集的衣壳特性。

该技术为病毒基因递送领域的研究人员开辟了新途径，使其能够探索针对传统腺相关病毒（AAV）血清型治疗效果不理想的疾病及其靶细胞的治疗策略，例如HIV感染和T细胞，同时也可用于探索基于载体的基因转移技术，以感染人干细胞及其他心肌细胞。观看本视频后，您应能充分理解如何通过基因片段化与重组相结合的方法，设计并进化出高度多样化的合成腺相关病毒载体文库，以及如何在培养细胞或动物体内对这些文库进行原理性筛选，从而富集具有特定理想特性的单个衣壳，用于基因转移载体。请务必注意，腺病毒操作具有潜在风险，进行该实验时应采取多种预防措施。