Name: 工程和演变的合成腺相关病毒（AAV），基因治疗载体，通过DNA家族改组 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: 了解通过DNA家族改组工程化和进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体的方法。该技术可创建数百万种嵌合衣壳变体库，用于筛选具有增强靶向性和感染效率的优化载体，适用于体外细胞培养和体内动物模型的基因递送研究。

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作者衷心感谢海德堡大学卓越细胞网络集群（Cluster of Excellence CellNetworks）以及奇卡和海因茨·夏勒（Chica and Heinz Schaller, CHS）基金会对本实验室、团队成员及研究工作的大力支持。我们注意到，自三年前我们首次发表相关成果以来，通过DNA家族重排进行腺相关病毒（AAV）分子进化的研究已发展成为一个极为活跃的领域，因此，由于篇幅限制未能在此引用所有相关研究者的文献，我们深表歉意。

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<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
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<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

所有作者均声明无任何利益冲突。

本文概述了通过DNA家族改组技术进行AAV衣壳工程改造，以及在细胞或动物体内进行进化的关键实验步骤和指导原则。本质上，这些方案是我们于2008年首次在AAV领域报道的实验流程的标准化版本3。尽管此后许多后续研究报道了大量改进方法e.g.，10-13，我们目前提供的版本仍代表了可重复、易于放大并可根据不同需求进行调整的基础性策略。
尽管我们努力对整个实验流程进行标准化，但某些步骤仍需通过试错法进行优化。这尤其适用于cap基因的片段化，因为DNase I对反应条件（如孵育时间）极为敏感（参见图3中的示例）。我们获得的最佳起始片段长度范围为100至500个碱基对，因此建议尝试多种DNase反应条件（例如，酶的用量和孵育时间），直至凝胶电泳结果与图3中加框的泳道相似为止。
在细胞培养过程中，对文库筛选的各个步骤进行完全标准化同样是不可能的。如前所述，一个关键问题是新文库或...

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Phusion II 聚合酶试剂盒</td><td>Finnzymes</td><td>F-540S</td><td></td></tr><tr><td>HotStar Hifi 聚合酶试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Finnzymes</td><td>F-540S（试剂盒组分）</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（25 mM）</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015（试剂盒组分）</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4855.2</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs（10 mM，100 &amp;mu;l）</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>碘克沙醇（OptiPrep）</td><td>Axis-Shield</td><td>1114739</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>107241</td><td></td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Optima L90K</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Seal 离心管</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulserXcell</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Eppendorf</td><td>Vapo Protect</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>BIOER</td><td>MB-102</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>FACS 分析仪</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Cytomics FC500 MLP</td><td></td></tr><tr><td>MegaX DH10B T1R 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸酶（Benzonase）</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>101695</td><td></td></tr><tr><td>腺病毒-5</td><td>ATCC</td><td>VR-5</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II KS(+) 质粒</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>212207</td><td></td></tr><tr><td>cap5F（黄色标注 Pac I 位点，加粗部分为 cap5 特异性序列）：GACTCTTAATTAACAGGT&lt;strong&gt;ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC&lt;/strong&gt;</td><td>IDT</td><td>定制引物</td><td></td></tr><tr><td>cap5R（绿色标注 Asc I 位点，加粗部分为 cap5 特异性序列）：GTGAGGGCGCGCC&lt;strong&gt;TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC&lt;/strong&gt;</td><td>IDT</td><td>定制引物</td><td></td></tr></tbody></table>

通过dna家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（aav）基因治疗载体

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

腺相关病毒（AAV）载体因其独特的有益特性组合，被认为是目前最有效且最具前景的人类基因治疗递送工具之一1包括基础野生型病毒的非致病性，以及用于生产高滴度、高纯度和临床级重组载体的成熟先进方法2腺相关病毒系统相较于其他病毒的另一显著优势在于，存在大量天然的血清型，这些血清型在关键特性上各不相同，但均可通过同一通用方案轻松改造为载体。1,2此外，包括我们研究组在内的多个团队近期已设计出策略，利用这些天然病毒作为模板，构建合成载体，这些载体可整合多种输入血清型的优点，或增强单一分离株的特性。实现这些目标的相关技术主要包括DNA家族洗牌3, 即 基于部分同源性（通常）对各种 AAV 衣壳基因进行片段化，随后重新组装 &gt;80%（大多数AAV血清型），或肽段展示4,5, 即 将通常由七个氨基酸组成的肽段插入病毒衣壳的暴露环区，该肽段可理想地介导对特定目标细胞类型的重定向。为了获得最佳效果，这两种方法均以高通量方式进行，即对实验流程进行放大，以构建包含约一百万个不同衣壳变异体的文库。每个克隆要么包含多个亲本病毒的独特组合（DNA家族改组法），要么在同一病毒骨架中携带不同的展示肽段（肽段展示法）。后续的最终步骤是在目标细胞上对文库进行多轮迭代筛选，以富集满足筛选过程大部分甚至全部条件的个别衣壳。该筛选过程优选结合正向选择压力（例如在特定目标细胞类型上的扩增能力）与负向筛选（例如清除所有能与抗AAV抗体发生反应的衣壳）。这种组合策略提高了最终筛选出的合成衣壳满足特定应用需求的可能性，而此类衣壳在自然界存在的AAV分离株中几乎不可能被发现。本文重点介绍两种技术中理论和实验难度更高的DNA家族改组法，详细描述并演示构建与筛选改组AAV文库所需的全部关键步骤。图1），然后讨论在进行分子AAV进化时，为确保成功而需要注意的实验方案中的陷阱与关键要点。

我们展示了通过DNA家族洗牌技术对合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体进行分子设计与定向进化的基本方法。此外，我们还提供了在培养细胞或小鼠中筛选和分析具有增强特性的单个嵌合衣壳的一般性指导原则及代表性实例。

通过DNA家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体

腺相关病毒（AAV）载体由于其独特的特性，被认为是目前最有效且前景最广阔的用于人类基因治疗的递送工具之一。

以下实验的总体目标是构建一个高度多样化的合成腺相关病毒衣壳文库，从中可筛选出具有理想特性的病毒颗粒。该目标首先通过控制性DNA酶切将克隆并筛选出的腺相关病毒（aav）衣壳基因片段化，随后通过两轮PCR反应将其重新组装为嵌合序列。第二步是将所得的PCR产物重新克隆至具有复制能力的腺相关病毒（aav）载体中，从而构建包含至少100万个不同腺相关病毒（aav）衣壳基因的质粒文库。接下来，将该质粒文库与腺病毒辅助质粒共同转染至293T细胞中，以产生可于靶细胞或动物体内进行筛选的嵌合病毒文库。实验结果表明，通过在培养细胞或成年小鼠中实现增强或更特异性的报告基因表达，成功实现了新型合成AAV载体的分子工程改造与进化。该技术相较于现有方法（如肽段展示技术）的主要优势在于，DNA家族改组技术能够同时改变并优化AAV衣壳的多个特性，从细胞结合、胞内运输到脱壳及在细胞核内的基因表达均可得到改良。该方法有助于回答基因治疗和病毒学领域的关键问题，例如如何为特定的治疗应用获得理想的载体，或如何解析病毒衣壳中负责某种特性的功能区域。该技术的应用前景广泛，可推动多种人类疾病的治疗，包括病毒感染性疾病，因为我们的方法能够实现腺相关病毒（AAV）载体的分子进化，使其特异性且高效地感染特定的病毒靶细胞，例如感染HIV的T细胞或感染肝炎病毒的肝细胞。尽管该方法也可用于深入理解AAV的生物学特性，并可用于改进基因治疗中的AAV载体。该方法也可轻松应用于其他具有基础或应用价值的基因家族，例如剂量编码荧光基因、三种报告基因、细胞酶或参与RNA干扰的蛋白质。我们最初产生这一方法的想法，是在尝试寻找一种合适的载体，用于将治疗性基因转导至成年小鼠的肝细胞时。当时我们意识到，所有天然存在的腺相关病毒（AV）血清型均存在某些缺陷，例如在人群中普遍存在，因而导致较高的预存免疫发生率，或尽管在体外转导效率较高，但在体内表现不佳。本方法的可视化演示至关重要，因为基于DNA的AV衣壳基因片段化以及部分病毒文库制备步骤较难掌握，需要实践经验并对关键操作环节有充分认识，以促进常规制备足量的各类腺相关病毒衣壳基因。为了进行DNA洗牌，首先将这些基因亚克隆到一个共同的质粒骨架中。为此，使用引物cap F和cap R，通过PCR从常见的AAV质粒中扩增出所需的cap基因。然后将cap基因克隆到一个经过改造的质粒中，该质粒含有特定的引物结合位点以及限制性酶切位点。在此示例中，cap基因被克隆至PAC1和SC1位点，这些位点存在于用于cap基因扩增的引物以及受体质粒中，但在大多数AAV中并不存在。在构建完成编码AAV衣壳蛋白基因的质粒组后，开始进行cap基因洗牌的PCR操作，使用T3和T7引物扩增所选的cap基因。设置一个50微升的PCR反应体系，包含200纳克的帽质粒、每种引物终浓度为2微摩尔、10微升5倍高保真缓冲液以及1微升高

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工程和演变的合成腺相关病毒（AAV），基因治疗载体，通过DNA家族改组

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内...

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

本文提供了一种利用细胞工厂中培养的贴壁型HEK 293细胞及亲和层析纯化方法大规模制备研究级腺相关病毒（AAV）载体的详细操作流程。该方案可稳定获得 &gt;1 × 1013 拷贝/mL...

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

腺相关病毒肽展示文库的构建，以及通过条形码标记具有新特性的候选病毒，用于下一代腺相关病毒的创制与后续验证。...

通过腺相关病毒（AAV）衣壳变异体的改造、条形码标记与筛选分离下一代基因治疗载体

本文介绍了一种用于建立和验证良好实验室规范的方案，通过数字液滴式聚合酶链式反应法对人体泪液中的腺相关病毒载体进行合规性检测，以支持基因治疗载体的临床开发。...

一种可验证的微滴数字聚合酶链式反应检测方法用于腺相关病毒载体在泪液生物脱落研究中的检测

重组腺相关病毒（rAAV）被广泛用于临床和临床前基因递送。rAAV 一个尚未受到足够重视的用途是，无需纯化即可高效转导培养细胞。针对初次接触 rAAV...

使用未纯化重组腺相关病毒载体在培养细胞中进行转基因表达

腺相关病毒在悬浮细胞培养中生产，并通过两次碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本方法包含多个步骤，可提高病毒总产量，降低病毒沉淀风险，并进一步浓缩最终病毒产物。预期最终滴度可达 1012 病毒颗粒/mL，适用于临床前的 体内...

用于体内应用的腺相关病毒悬浮培养生产及碘克沙醇密度梯度离心纯化

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

腺相关病毒（AAV）载体基因组拷贝数的精确定量至关重要，但目前尚未建立标准化的实验方案。本方案描述了一种经过验证的方法，用于制备纯化的AAV样品，并通过数字滴定聚合酶链式反应（dd_PCR）可靠地定量病毒基因组滴度。...

通过数字滴定聚合酶链式反应定量纯化载体样品中的腺相关病毒基因组

本方案旨在介绍一种用于制备和纯化间充质干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡仿生体以用于基因治疗的方法。该纳米囊泡由MSC来源的脂双层构成，其腔内包裹有携带目的基因的重组腺相关病毒（AAV）。该纳米囊泡提供了一种增强型的基因递送载体 体内...

用于增强基因递送的间充质干细胞膜包被纳米囊泡的开发

从质粒DNA中拯救甲型流感病毒是一项基础且关键的实验技术，该技术可使流感研究人员能够构建重组病毒，用于研究流感病毒生物学的多个方面，并可作为潜在的载体或疫苗使用。...

从质粒DNA生成重组流感病毒

了解通过DNA家族改组工程化和进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体的方法。该技术可创建数百万种嵌合衣壳变体库，用于筛选具有增强靶向性和感染效率的优化载体，适用于体外细胞培养和体内动物模型的基因递送研究。

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