Name: 神经元的初步培养体系的研究疱疹病毒潜伏期和活化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 学习利用原代神经元培养体系研究单纯疱疹病毒1型潜伏与再激活机制。该方法通过分离颈上神经节神经元建立感染模型，结合EGFP报告基因监测病毒再激活效率，为解析病毒-神经元相互作用及开发治疗策略提供重要工具。

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感谢审稿人提出的宝贵建议，这些建议有助于改进本手稿。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）向 MVC（NS21072、HD23315）、ACW（GM61139、S10RR017970）和 IM（AI073898、GM056927）提供的资助。MK 部分由 NIH 培训资助（5T32 AI007180）支持。

1. 从大鼠胚胎中分离和培养颈上神经节神经元
为理解本方案提供有用的背景信息，并全面讨论早期文献中建立的SCG神经元培养方法，包括SCG的理论基础 体外 培养、培养板包被基质以及无血清培养基的组分，读者可参考相关文献2-4.
<ol>
 <li>使用大鼠作为SCG神经元来源的操作严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并在机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care &amp; Use Committee，IACUC）批准的有效实验方案下进行。</li>
 <li>开始解剖前，准备经胶原蛋白和层粘连蛋白包被的96孔组织培养板。使用多通道移液器，将0.66 mg/ml大鼠尾胶原溶液加入所有96个孔中。立即吸除胶原溶液（可回收并用于最多8次解剖）。去除胶原后，必须在层流罩下将各孔彻底干燥，此步骤极为重要。干燥所需时间取决于培养板的孔数。例如，96孔板通常需要约5–10分钟干燥，若使用较大规格的24孔板，则可能需要30–40分钟。若未充分干燥，将导致SCG贴壁不良。随后使用2 μg/ml层粘连蛋白溶液重复上述操作。将含层粘连蛋白的培养板置于37 °C、加湿的CO2培养箱中孵育至少2小时，直至准备接种神经元（步骤1.14）。</li>
 <li>通过商业途径获得的妊娠雌性大鼠采用CO2实施安乐死。尸体用70%乙醇喷洒消毒后，在腹部做U形切口。剥离皮肤后，再沿腹肌层做第二个U形切口。掀开腹肌层后可见子宫。取出子宫并置于15 cm培养皿中。使用钝头剪刀小心切开子宫，避免损伤其中的仔鼠。每只仔鼠需从胎膜中释放，剪断脐带，并用70%乙醇和Kimwipes擦拭清洁。</li>
 <li>在解剖显微镜下操作，通过剪断头部与躯干连接处的方式处死E21胚胎大鼠仔鼠。剪切时剪刀应指向颈部基部，即肩部稍上方位置。为暴露神经节，使用23 G针头将头部（颈部朝上）固定于三个位置：i）脊髓；ii）鼻部上方拉起的前部皮肤并固定；iii）食管/气管必须从颈部基部分离并固定。</li>
 <li>在颈动脉分叉处两侧寻找两个SCG*（每个胚胎有两个SCG）。SCG位于分叉支的正下方。通过拉开颈动脉分叉将SCG与血管分离。将分离出的神经节置于盛有12 ml L15培养基（添加0.4% D(+)-葡萄糖）的15 ml锥形管中，冰上保存。</li>
</ol>
*与包裹分叉处的不透明、淡黄色脂肪组织相比，颈上神经节呈半透明且无色。在收集神经节之前，应尽量去除残留的脂肪组织和血管。
<ol start="6">
 <li>重复步骤 1.4 和 1.5，直至从胚胎中收获所有背根神经节（SCGs）。</li>
 <li>将神经节在 600 rpm 条件下轻轻离心 1 分钟，并吸除多余培养基。</li>
 <li>将神经节重悬于 1 ml 含胰蛋白酶（0.25%，无 EDTA）和胶原酶（1 mg/ml）的 L15 培养基中。于 37 °C 孵育 30 分钟，每 10 分钟振荡一次。</li>
 <li>加入 10 ml C-培养基（1× MEM，0.4% D(+)-葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺，10% 胎牛血清）以终止胰蛋白酶消化反应，并在 600 rpm 条件下离心 1 分钟。</li>
 <li>尽可能彻底去除含胰蛋白酶/胶原酶的培养基*，用 10 ml C-培养基洗涤神经节，600 rpm 离心 1 分钟。重复此步骤一次。</li>
</ol>
*残留的胶原酶会干扰细胞在培养板上贴壁所需的胶原底物。
<ol start="11">
 <li>移除洗涤液，将神经节重悬于 1 ml C 培养基中，使用连接 5 ml 注射器的 21 G 针头进行吹打以解离大的细胞团块*。再用 23 G 针头继续吹打，直至可见的细胞团块完全解离。</li>
</ol>
*注意避免过度吹打，以免损伤细胞。如果胰蛋白酶和胶原酶处理成功，使用21 G针头进行最多十五次上下吹打，以及使用23 G针头进行三次循环即可。
<ol start="12">
 <li>将解离的神经元通过70 μm尼龙滤膜[BD Biosciences细胞筛]过滤至50 ml锥形管中，以去除任何残留的细胞团块。</li>
 <li>取10 μl过滤后的细胞悬液，与台盼蓝混合，以确定活细胞数量。使用血细胞计数板计数能够主动排除染料的细胞数目。</li>
 <li>从37 °C培养箱中取出预先包被的96孔板，吸去板内的层粘连蛋白溶液（见步骤1.2）。切勿让孔板干燥，去除层粘连蛋白后可立即用于接种细胞。向已包被胶原和层粘连蛋白的96孔组织培养板中每孔加入5,000–6,000个总活细胞（每孔50–100 μl）。在C培养基中添加50 ng/ml神经生长因子（NGF）。</li>
</ol>
*由于生长培养基中未添加抗生素，因此采用良好的无菌组织培养技术至关重要。此外，不同供应商来源的胶原蛋白可能存在显著差异。我们使用Millipore的鼠尾胶原蛋白在多个批次中均获得了稳定一致的结果。
<ol start="15">
 <li>在DIV（体外培养天数) 1，将用于铺板细胞的C培养基更换为 50 μl NBM（0.4% D(+)-葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺，含50 ng/ml NGF的B-27添加剂） 5 μM 阿糖胞苷和 20 μM 5-氟尿嘧啶［5-氟-2'-脱氧尿苷］。将培养物孵育5天*。此时，可通过胰酶消化并计数多个孔中剩余的细胞，以确定经抗有丝分裂剂处理后存活的神经元数量。通常情况下，在96孔板中每孔约剩余1,000个神经元。</li>
</ol>
*真菌或细菌污染问题通常在培养的最初24小时内即可显现。在更换铺板培养基之前，应仔细检查每个孔是否出现微生物生长。如果仅有少量孔受到污染，可用稀释的漂白剂溶液处理，随后用PBS冲洗并干燥，以继续实验。我们建议，即使仅有少量孔出现微生物污染，也应重复实验。若在96孔板中观察到广泛的微生物污染，则必须终止实验。
2. 使用HSV-1 Us11-EGFP感染SCG培养物并建立潜伏感染
有关病毒学技术的背景知识，包括基本的病毒扩增、病毒滴度测定以及感染复数（MOI）的确定，读者可参考文献5。关于疱疹病毒生物学的讨论，读者可参考文献6。最后，对于α-疱疹病毒感染SCG神经元的裂解性感染的先前实例、其他实验方案以及相关背景资料，以及与本方案在研究潜伏感染和再激活方面的改进之处的比较，读者可参考文献7-10。
<ol>
 <li>在 DIV 6 时，向每孔现有的培养基中加入阿昔洛韦（ACV），终浓度为 100 μM*。例如，若每孔含有 50 μl 培养基，则加入 25 μl 的 300 μM ACV 储存液。通常在感染前一晚加入 ACV，但也可在感染前 6–8 小时加入。</li>
</ol>
*在整个操作过程中，必须极其注意尽量减少对神经元的不必要物理操作。更换培养基或接种病毒液等操作都必须轻柔、缓慢地进行。否则，由此产生的机械应力可能对神经元的存活率产生不利影响。
<ol start="2">
 <li>在DIV 7时，用HSV-1 Us11-EGFP（见参考文献11）感染SCG培养物，感染复数（MOI）为1–2（参见下方关于确定最佳MOI的重要说明）*。将稀释后的病毒直接加入孔中现有的培养基中。设置未感染的对照组，以及不含ACV的裂解性感染阳性对照组。在37 °C条件下继续培养2–3小时以完成感染过程。</li>
</ol>
*MOI 是通过在 Vero 细胞中进行噬斑实验测定病毒滴度12，并结合步骤 1.14 中每孔接种的活细胞数量计算得出。该计算仅在操作层面上具有参考意义，因为接种的总细胞数中包含神经元以及混杂的胶质细胞和成纤维细胞。由于这些混杂的增殖性细胞会被抗有丝分裂试剂处理所清除，因此对存活神经元而言，实际的 MOI 值更高。从最初接种的 5,000 - 6,000 个活细胞中，在使用抗有丝分裂试剂处理后（通过胰酶消化和直接细胞计数评估），大约仅剩 1,000 个神经元。在感染神经元培养物时，最佳 MOI 可能因不同批次的病毒储备液而略有差异。每次制备新的病毒时，我们建议测试 MOI 为 1 至 2 的有限范围，以确定对神经元活力影响最小且能产生最多可诱导再激活事件（定义见第 3 节）的条件。Us11-EGFP 病毒在快速优化实验条件方面特别有用，但也可使用其他检测方法，如噬斑实验或定量 PCR。使用经蔗糖垫纯化的病毒有助于去除可能降低细胞活力的杂质，尽管这并非必需步骤，也不作为常规操作。
<ol start="3">
 <li>小心地将感染培养基更换为含有 50 ng / ml NGF 和 100 μM ACV* 的新鲜 NBM。</li>
</ol>
*更换感染培养基时必须极其轻柔。应将移液枪头对准孔壁而非孔底，让培养基沿孔壁缓缓流下。即使移液器快速排出液体所产生的力也可能足以使轴突从基质上脱落，导致细胞成片剥落。如果仅有少量神经元脱落（20-30%），且细胞形态健康，则影响较小。脱落的神经元可能随时间重新附着，但其轴突将不再良好伸展，需重新生长新的轴突。尽管并非理想状态，若仅有少数孔受到影响，实验仍可继续进行。若神经元脱落严重（70-80%），则不建议将受影响的孔纳入实验结果。若大多数孔中均有70-80%的神经元脱落，建议终止该次实验。虽然这些神经元仍可能重新附着，但通常会形成大的细胞团块，从而增加对单个再激活神经元进行准确评估的难度。我们建议重复任何观察到神经元脱落孔的实验，以确保神经元在孔板中的附着差异未影响再激活率。
此外，它还 关键的 到 始终尽可能轻柔地操作培养物不必要的突然机械应力（包括反复开关培养箱门或用力添加培养基）可能破坏培养物维持HSV-1潜伏感染的能力，导致在特定实验中自发再激活率异常升高。
<ol start="4">
 <li>将培养物维持培养6天，期间病毒将建立潜伏感染。在此期间，使用荧光显微镜监测神经元健康状况以及Us11-EGFP的表达，后者作为裂解性复制的指示指标。应能检测到Us11-EGFP 仅 在未接受ACV处理的对照孔中，表明原发感染成功且存在活跃的裂解性复制。即使在无活跃病毒增殖的情况下，神经元也可能出现细胞病变效应。感染的培养物应密切监测，并与模拟感染的神经元进行比较。</li>
</ol>
3. 重激活与评估
<ol>
 <li>在DIV 14时，小心地将含ACV的培养基更换为新鲜培养基 缺乏 ACV。如果适用，此时应加入药理学（或生物学）变量。务必遵循2.3中所述的预防措施。</li>
 <li>在5至6天内，使用荧光显微镜监测活体培养物，以检测发生再激活的神经元。或者，收集样品用于其他类型的分析（蛋白质、核酸、斑块测定等）。</li>
 <li>通过计数表达EGFP阳性神经元的孔数，并将其表示为样本总孔数的比例，来计算再激活频率。需要注意的是，单个孔中的EGFP表达无法区分初始再激活事件与病毒扩散引起的继发性感染。由于感染性扩散被限制在单个培养孔内，在本实验条件下，将每个孔中存在一个或多个EGFP阳性神经元在操作上定义为一次再激活事件。</li>
</ol>
*在培养物中可能发生多次再激活事件，如文献1所述。为了区分初次再激活事件与由再激活引起的病毒传播，可加入衣壳化抑制剂 WAY-150138。通过阻断衣壳化过程，无法产生具有感染性的病毒，从而阻止由再激活导致的病毒扩散。因此，在存在 WAY-150138 的情况下检测到的 EGFP 信号反映了单个培养孔内独立发生的再激活事件的数量1,13-15。需要注意的是，WAY-150138 仅对 HSV-1 Patton 株有效，且目前未商业化供应。作为 WAY-150138 的替代方案，可考虑以下任一方法：i）使用在向邻近细胞扩散能力方面存在缺陷的突变病毒；ii）使用报告病毒，使其在持续存在 ACV 的条件下由立即早期（IE）启动子驱动 EGFP 表达；iii）使用 PAA 或 ACV 处理以抑制晚期基因表达（及感染性病毒的产生），随后使用针对立即早期基因产物的抗体进行免疫荧光检测。
4. 利用该检测方法评估再激活的替代方案
单次实验的个体结果应来自同一份 SCG 制备样品。只要每次重复实验均使用单独一批次的 SCG 样品，即可利用独立的 SCG 制备样品进行重复实验。
<ol>
 <li>HSV-1 裂解期转录本的检测。在去除ACV后，在存在或不存在不同实验性再激活诱导剂的情况下，于所需时间点收集RNA。当使用96孔培养板时，建议每个样本至少合并20个孔的样品（每个RNA样本约含105个细胞）。或者，可将SCG接种于更大的孔中（例如，在24孔板中，每孔接种4-5 × 104个细胞）。尽管从少于20个孔中检测RNA是可能的，但由于体积过小，会导致样本间不必要的变异性。</li>
 <li>HSV-1 裂解期蛋白的检测。在诱导再激活后的指定时间点收集裂解液。向96孔板中的每个孔加入7.5 μl裂解缓冲液，并通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。或者，可通过间接免疫荧光显微镜检测病毒蛋白。初始接种必须在可用于成像的可固定基质上进行，例如无菌玻璃盖玻片，且在胶原和层粘连蛋白包被前需预先用聚-D-赖氨酸（0.2 mg/ml，Sigma）包被（见1.10）。</li>
 <li>感染性病毒颗粒的检测。在再激活时收集培养上清液。使用上清液的系列稀释液对Vero细胞单层进行噬斑测定。此外，还可对冻融培养物的裂解液进行噬斑测定，以包含细胞相关病毒颗粒，从而测定滴度。</li>
</ol>
5. 代表性结果
图2A 展示了一个示例，其中 1 μM 曲古抑菌素A（trichostatin A, TSA），一种已知的再激活诱导剂16-18，应用于潜伏感染野生型HSV1 EGFP-Us11报告病毒株的SCG培养物。使用TSA后，2天内再激活率达到最大值的50%，到第5天时，约60%的孔达到再激活平台期。本实验中基础水平（“自发”）再激活率约为10%，通常使用该方法时自发再激活率范围为10–20% 体外 系统。最大再激活水平取决于所使用的再激活诱导剂。许多再激活诱导剂可在整个实验过程中持续使用，因其不会干扰病毒的 productive 复制，但这一点需通过实验确定。其他诱导剂，包括任何影响神经元存活率或阻碍病毒 productive 生命周期完成的试剂，可能需要采用短暂脉冲处理以诱导再激活。
尽管图2A所示实验中每个孔内EGFP-Us11的积累表明潜伏感染发生了再激活，但这无法区分单个神经元中的Us11-EGFP信号是来源于独立的再激活事件，还是来源于再激活病毒在培养体系中的传播。为了评估每个孔中发生独立再激活事件的神经元数量，实验前用WAY-150138对培养物进行预处理，该化合物可通过阻止病毒DNA基因组的衣壳化而特异性抑制病毒传播13-15。感染的交感神经元培养物经WAY-150138处理后，使用TSA诱导再激活。与DMSO处理的对照组培养物相比，仅在TSA处理的孔中检测到大量EGFP阳性神经元，表明在每个独立培养物中均发生了多次独立的再激活事件（图2B）。
在我们的检测中，Us11-EGFP 报告基因由内源性 Us11 启动子表达11。由于 Us11 是一种“真晚期”（γ2）病毒裂解基因，其高效表达需要病毒DNA复制。这一点在图3中得到证实：在使用PI3-激酶抑制剂LY294002诱导再激活的培养物中，病毒DNA聚合酶抑制剂磷onoacetic acid（PAA）可抑制EGFP-Us11的积累。
<img alt="Rat cell culture experiment diagram; SCG dissection, GFP-HSV1 infection, ACV removal, green wells." src="/files/ftp_upload/3823/3823fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 利用培养神经元的典型实验流程示意图 体外 用于研究HSV-1潜伏与再激活的系统 1) 从E21大鼠分离上颈交感神经节（SCG）后，将解离的神经元接种于96孔板中，并使用抗有丝分裂试剂处理以去除非神经元细胞。2) 培养6天后 体外 （接种后天数，DIV）在存在抗病毒药物阿昔洛韦（ACV）的条件下，用携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与病毒编码的Us11晚期基因融合的重组HSV-1（EGFP-HSV-1）感染培养物。3）至第14天（DIV 14），移除阿昔洛韦，此时未检测到EGFP表达。培养物可在此状态下稳定维持一个月或更长时间，或加入待测变量以评估其诱导潜伏病毒再激活的能力。该变量可为小分子化学抑制剂、针对可溶性神经营养因子或细胞表面蛋白的抗体，或表达基因特异性shRNA或异位表达蛋白的慢病毒。随后通过实时计数EGFP阳性孔来监测再激活情况。
<img alt="GFP表达分析；比较TSA与DMSO处理的折线图；实验结果。" src="/files/ftp_upload/3823/3823fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. TSA在SCG培养物中重新激活HSV-1。 SCG培养物的潜伏感染建立如图1所述。在DIV 14时，移除ACV并更换为含有1 μM曲古抑菌素A（TSA）的培养基。（A）药物处理后连续5天，每天通过荧光显微镜观察并评分培养物。图中显示了实验过程中发生再激活的孔所占百分比，并与DMSO对照处理的培养物进行比较。再激活百分比通过96孔培养板中20个孔内EGFP阳性孔的数量计算得出。误差线表示均值的标准误。（B）对潜伏感染的培养物使用TSA及病毒DNA衣壳化抑制剂WAY-150138（20 μg/ml）进行处理。在药物处理48小时后，将EGFP+神经元数量与经DMSO和WAY-150138处理的对照组进行比较。每个数据点代表一个培养孔中1,000个神经元内EGFP+神经元的比例。柱状图显示一个孔中EGFP+神经元的平均百分比。
<img alt="使用LY、PAA及LY/PAA处理5天后的再激活孔位图，GFP检测结果。" src="/files/ftp_upload/3823/3823fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. EGFP的检测依赖于病毒DNA复制。 SCG培养物在建立潜伏感染后，用10 μM的LY29004处理，该化合物是已知的再激活诱导剂1。将LY诱导的再激活（蓝色）与使用病毒DNA合成抑制剂磷ono乙酸（PAA，300 μg/mL，红色）以及两种化合物联合处理（绿色）的情况进行比较。

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<li>Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+promoter+activity+during+latency+establishment%2C+maintenance+and+reactivation+in+primary+dorsal+root+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro.</a> J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).</li>
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<li>Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxed+repression+of+herpes+simplex+virus+type+1+genomes+in+murine+trigenminal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons.</a> J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).</li>
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<li>Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+vestibular+ganglion+neurons+demonstrate+latent+herpes+simplex+type+I+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation.</a> Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).</li>
<li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

这种原代神经元培养与感染系统为研究HSV-1潜伏与再激活的分子机制提供了一种简单而有效的方法。该系统能够真实再现人体感染及活体动物模型中公认的潜伏感染特征。当病毒在SCG培养物中处于潜伏状态时，无法检测到感染性病毒颗粒及病毒裂解期基因产物。在潜伏感染的神经元中唯一可检测到的病毒基因产物是不编码蛋白的LAT转录本，其在细胞核内积累。再激活过程伴随着病毒裂解期基因的表达，并最终产生具有感染性的病毒颗粒。此外，这种原代神经元细胞培养模型对公认的再激活诱导剂（如TSA）具有响应性，TSA可有效诱导病毒裂解性复制。
不同的化学诱导剂以不同程度和特征性动力学刺激再激活。例如，在5天的观察期内，TSA可重复地在60%–70%的培养物中诱导再激活。使用潜伏感染的、已分化的鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞17或小鼠三叉神经元培养物18，已有报道显示TSA诱导的再激活水平相似。我们观察到的再激活动力学以及TSA无法在100%培养物中诱导再激活的现象，可能反映了潜伏基因组在去抑制能力上的异质性。与此假设一致的是，据报道TSA诱导再激活...

<table><tbody><tr><td>70&amp;mu;m 尼龙滤器（细胞筛）</td><td>BD 生物科学</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1× Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS）&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;) </td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>无 CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>1x 最小必需培养基（MEM） </td><td>Invitrogen</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>5-氟-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>在1×MEM中配制20 mM储备液；于-20℃保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>96孔平底TC培养板</td><td>康宁</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>阿昔洛韦 </td><td>Calbiochem</td><td>114798</td><td>在DMSO中配制31 mM储备液；于-20℃保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>阿糖胞苷 </td><td>Calbiochem</td><td>178273</td><td>在DMSO中配制10 mM储备液；于-20℃保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>B-27 补充剂 </td><td>Invitrogen</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>在 HBSS 中配制 10 mg/ml 的储备液&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;；于 -20 保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td>在 H 中配制 40% 储存液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；滤膜除菌 &amp;& 储存于 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 </td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>在 H 中配制 1 mg/ml 储存液&lt;sub&gt;2O&lt;/sub&gt;；快速冷冻20 &amp;#x03BC;l 分装 &amp;& 储存于 -80&amp;#x00B0;C；稀释至2 &amp;#x03BC;g/ml 工作浓度，在无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Leibovit&amp;rsquo;z L-15 培养基 </td><td>Invitrogen</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>神经生长因子 </td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT.5017</td><td>准备 50 &amp;#x03BC;g/ml 储存液，溶于 HBSS&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;；于 -80 保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基 </td><td>Invitrogen</td><td>12348</td><td></td></tr><tr><td>磷ono乙酸（PAA） </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6909</td><td>在 H 中配制 75 mg/ml 储存液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；于 -20 保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴化物 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td>在 H 中配制 20 mg/ml 的储备液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；于 -20 保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>大鼠尾胶原 </td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>浓度因供应批次而异；4 ℃ 保存&amp;#x00B0;C，并在无菌 H 中稀释至 0.66 mg/ml 的工作浓度&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>曲古抑菌素 A </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>在DMSO中配制1 mM储备液；于-20℃保存&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 2.5% </td><td>Invitrogen</td><td>15090-04</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究单纯疱疹病毒潜伏与再激活的原代神经元培养系统

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在外周神经元中建立终身潜伏感染。这种潜伏储存库是病毒反复再激活的来源，导致病毒传播并引发临床疾病。目前的抗病毒药物无法清除潜伏储存库，且尚无有效疫苗。尽管裂解性复制的分子机制已被充分阐明，但调控神经元中潜伏感染的机制仍不清楚。目前对潜伏感染的认识主要来源于使用小型动物模型的体内研究，这些模型在定义病毒基因需求以及免疫应答作用方面发挥了不可替代的作用。然而，在活体动物中，无法区分对病毒-神经元相互作用的特异性影响与免疫细胞或非神经元支持细胞介导的感染的一般性后果。此外，动物实验成本高、耗时长，且在宿主过程调控方面的可选手段有限。为了克服这些局限性，迫切需要一种仅包含神经元的系统，既能重现体内潜伏与再激活的特征，又能提供组织培养在均一性和可及性方面的优势。
本文介绍了一种利用培养自大鼠颈上神经节（SCG）的原代交感神经元的体外模型（图1），用于研究HSV-1的潜伏感染与再激活，该模型符合大多数甚至全部理想标准。在去除非神经元细胞后，获得近乎均一的TrkA+神经元培养体系，并在阿昔洛韦（ACV）存在下接种HSV-1，以抑制裂解性复制。去除ACV后，可高效建立非生产性HSV-1感染，该感染状态忠实呈现公认的潜伏感染特征。值得注意的是，即使不进行筛选，裂解期mRNA、蛋白质和感染性病毒均无法检测到，但潜伏相关转录本（LAT）在神经元细胞核中持续表达。病毒基因组以平均每神经元25个拷贝的数量维持，并可通过干扰PI3-激酶/Akt信号通路或单纯撤除神经生长因子1来诱导其进入生产性复制。一种编码EGFP与病毒裂解蛋白Us11融合蛋白的重组HSV-1，可作为再激活后复制过程的功能性实时标记物，便于定量检测。除化学处理外，该系统还可成功应用RNA干扰或慢病毒载体介导的基因递送等遗传学方法，从而开展在动物体内极难甚至无法实现的机制性研究。综上所述，基于SCG的HSV-1潜伏/再激活系统为解析控制HSV-1在神经元中潜伏与再激活的分子机制提供了强大而必要的工具。这一长期困扰病毒学领域的难题，其解答可能为靶向潜伏性疱疹病毒储存库的新疗法开发带来全新见解。

本方案描述了一种高效且可重复的模型系统，用于研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的潜伏感染与再激活。该检测方法采用均一的交感神经元培养体系，可利用多种工具（包括RNA干扰和重组蛋白表达）对病毒与神经元之间的相互作用进行分子层面的解析。

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在外周神经元中建立终生潜伏感染。该潜伏储库是反复复发的来源……

本实验的目的是演示如何利用原代神经元细胞培养系统来研究单纯疱疹病毒的潜伏感染与再激活。该目标通过以下步骤实现：首先从RA胚胎中分离颈上神经节神经元，消化神经节后分离神经元，并在去除非神经元细胞后进行培养；随后，在存在裂解复制抑制剂的条件下，使用表达EGFP的病毒对神经元进行感染，从而建立潜伏性HSV感染模型。下一步是诱导潜伏感染的细胞培养物发生再激活。最后，通过随时间监测EGFP的表达来评估再激活的效率。最终，可以获得结果，以展示不同的神经元信号通路如何通过化学抑制剂、RNA干扰和基因递送手段调控单纯疱疹病毒的潜伏与再激活过程。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对调节宿主神经元中单纯疱疹病毒森林潜伏感染的相互作用进行分子水平的详细研究。该方法有助于回答单纯疱疹病毒森林潜伏领域中的关键问题，例如：哪些信号参与抑制潜伏基因组？以及在分子水平上，再激活是如何被触发的？在神经元中，该方法可为HSV-1潜伏感染提供深入见解。该方法也可应用于其他神经营养性α疱疹病毒。演示本实验操作的是我们实验室的两位研究生 Marigo Kochi 和 Julian Kim。本方案所用的颈上神经节（SCG）神经元取自妊娠雌性大鼠子宫中取出的 E21 大鼠幼崽。在解剖罩内操作，将每只幼鼠置于解剖盘中，剪刀对准肩部上方的颈部基部，剪下头部以处死幼鼠。为暴露神经节，使用23号针头在三个位置将头部（颈部朝上）固定。首先固定脊髓。其次，将前部皮肤拉至鼻部上方并固定，第三步将食管和气管从颈部后方分离并固定。通过寻找颈动脉分叉来定位颈上神经节（SCG）。颈动脉是成对的结构。颈部两侧各有一个分叉，因此每侧各有一个星状神经节（SCG）。SCG位于分支正下方。用两端将分叉处拉开，从而将颈上神经节（SCG）与动脉分离。与包围分叉处的不透明黄色脂肪组织相比，SCG呈半透明且无色。将神经节放入12 mL的L-15培养基中。将含有葡萄糖的培养基置于冰上的15毫升锥形管中。从胚胎中收获所有s SCGs后，轻轻离心神经节1分钟。在600 RPM条件下，去除多余的培养基Reese。将神经节悬浮于1 mL L-15培养基中，培养基中含有胰蛋白酶和胶原酶。在37°C下孵育24分钟。每8分钟振荡一次。随后加入10毫升海水中止胰蛋白酶反应，600转/分钟离心1分钟。尽可能吸除胰蛋白酶-胶原酶消化液，加入10毫升C培养基重悬神经节，600转/分钟离心1分钟。重复此洗涤步骤一次。移除洗涤液，将神经节重悬于1毫升C培养基中，使用连接5毫升注射器的21号针头进行解离，最多上下吹打15次。随后换用23号针头继续吹打，直至大部分细胞团块完全解离。通过70微米尼龙滤膜将解离的神经元过滤至50毫升锥形管中，以去除残留的细胞团块。取10微升过滤后的细胞悬液，加入台盼蓝混合，以确定活细胞数量。使用血细胞计数板计数能够主动排除染料的细胞数量。接下来，将5,000至6,000个总活细胞加入100微升C培养基中，接种于预先包被胶原蛋白和层粘连蛋白的96孔组织培养板的每个孔内，C培养基中需含有50纳克/毫升的神经生长因子。在37摄氏度下培养过夜。次日，即体外培养第一天（DIV 1），检查神经元是否正确贴壁以及部分轴突突起的生长情况。将孔中的 C 培养基替换为 50 微升含有 NGF、Acho 以及 5-氟-2-脱氧尿苷的神经基础培养基或 NBM。每次更换一行培养基，以确保细胞不会干燥。将培养物在 37°C 下孵育 5 天。每天监测培养物，以确认非神经元细胞的死亡和神经元的生长。从体外培养的第6天开始进行该步骤时，需确认大部分非神经元支持细胞已被清除。在整个操作过程中，务必尽量减少对神经元不必要的物理操作。更换培养基时操作必须轻柔缓慢，否则由此产生的机械应力可能影响神经元的存活率。向每孔现有的培养基中加入阿昔洛韦或CV，使其终浓度为100微摩尔。应缓慢轻柔地加入CV，以确保机械力不会在次日对细胞产生不利影响。在体外培养第7天，用一种重组的表达EGF报告基因与病毒裂解蛋白US11融合蛋白的HSV-1病毒感染SCG培养物，感染复数控制在1至2之间。将稀释后的病毒直接加入孔中现有的培养基中。设置未感染的对照组和裂解性感染组。在不含CV的培养基中设置阳性对照。在37摄氏度下孵育感染体系2至3小时。随后，将感染培养基更换为含有NGF和CV的新鲜NBM。更换感染培养基时务必操作轻柔。将培养板向自己方向倾斜，从孔底部缓慢吸出培养基。然后将移液枪的枪头对准孔板的孔壁而非孔底，使培养基轻轻沿壁滑下，缓慢加入至细胞中。每次更换一行培养基，以避免细胞干燥。更换完成后，将培养物放回培养箱，操作过程中应尽量轻柔，以免影响细胞支持HSV-1潜伏感染的能力。在37摄氏度下培养6天，使病毒建立潜伏感染。在此期间，使用荧光显微镜监测us11 EGFP的表达，作为裂解性复制的指标。正如预期，空白感染对照组中不应出现GFP表达。S 11 EGFP仅应在感染组中被检测到。未进行CV处理的阳性对照孔表明初级感染成功且存在有效的裂解性复制。为了在DIV 14评估再激活，需小心地将含有CV的培养基替换为不含CV的新鲜培养基，操作方式与之前相同。若条件允许，应将移液器枪头对准孔壁而非孔底，使培养基沿孔壁缓慢流下，轻柔地覆盖细胞。实验中应包含药理学或生物学变量，例如添加20微摩尔的LY 29004。在经 A CV 处理的潜伏感染培养物中，不应检测到 GFP 表达。将细胞放回 37 摄氏度培养 5 至 6 天。使用荧光显微镜监测活体培养物，以检测发生再激活的神经元。通过计算含有 EGFP 阳性神经元的孔数，并将其表示为样本总孔数的比例，来确定再激活频率。该图展示了一个示例，其中使用已知的再激活诱导剂触发素（trigger statin）处理晚期感染的 SCG 培养物。在药物处理后连续五天，每天通过荧光显微镜监测并评分再激活情况。通过 TSA 处理，两天内再激活达到最大值的 50%，五天内再激活达到 60% 基线水平，即 DMSO 处理组所代表的自发再激活水平。本实验中，经处理的对照组培养物约为 10%，在此体外系统中通常范围为 5% 至 20%。感染后期的 SCG 培养物也用 LY294002 进行处理。使用LY诱导的再激活培养物与使用病毒DNA合成抑制剂磷ono醋酸（PAA）处理的培养物，以及同时使用这两种化合物处理的培养物进行了比较，如图所示。在由LY294002诱导再激活的培养物中，PAA抑制了US11-EGFP的表达，表明US11-EGFP的表达依赖于病毒DNA的复制。在进行该操作时，必须严格注意无菌操作技术，并尽可能轻柔地处理CG培养物，以避免因应激或机械运动导致自发性再激活增加。在通过该方法建立HSV-1潜伏感染的培养神经元后，可进一步开展其他实验方法，如S-H-R-N-A、基因敲低以及野生型与突变型基因的异位表达，以鉴定调控HSV-1潜伏与再激活的神经元功能。请务必注意，HSV-1 是一种人类病原体，需要采取 PSL-2 安全防护措施。在进行本实验操作前，您应熟悉在 PSL-2 条件下的实验操作规范。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立 SCG 培养体系以建立 HSV-1 的潜伏感染，并有效诱导神经元中的病毒再激活。

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科研

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Immunology and Infection

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来源：Nguyen, H., 等. 溶瘤单纯疱疹病毒的培养、纯化与滴定.J. Vis. Exp.

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一种用于研究单纯疱疹病毒潜伏与再激活的原代神经元培养系统

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