一种用于研究单纯疱疹病毒潜伏与再激活的原代神经元培养系统

本实验的目的是演示如何利用原代神经元细胞培养系统研究单纯疱疹病毒的潜伏感染与再激活。首先从RA胚胎中分离上颈交感神经节神经元，去除非神经元细胞后，对解离神经节获得的神经元进行培养。在存在裂解复制抑制剂的条件下，使用表达EGFP的病毒感染神经元，从而建立潜伏性HSV感染模型。

下一步是诱导潜伏感染的细胞培养物发生再激活。最后，通过随时间监测EGFP的表达来评估再激活的效率。最终，可以获得结果，揭示不同的神经元信号通路如何通过化学抑制剂、RNA干扰和基因递送手段调控单纯疱疹病毒的潜伏与再激活过程。

该技术相较于现有方法的主要优势在于，它能够在分子水平上对调节单纯疱疹病毒森林潜伏期与宿主神经元之间相互作用的机制进行深入研究。该方法有助于解答单纯疱疹病毒森林潜伏期研究领域中的关键问题，例如：哪些信号参与抑制潜伏基因组？再激活过程在分子水平上是如何被触发的？在神经元中，该方法可为HSV-1潜伏期的研究提供重要见解。

该方法也可应用于其他神经营养性α疱疹病毒。演示本实验操作的是我们实验室的两位研究生Marigo Kochi和Julian Kim。本方案所用的颈上神经节（SCG）神经元取自妊娠雌性大鼠子宫中取出的E21大鼠幼崽。在解剖罩内操作，将每只幼鼠头部朝上固定，用剪刀对准肩部上方的颈部基部剪断，以处死幼鼠。为暴露神经节，使用23号针头在三个位置将头部（颈部朝上）固定于解剖蜡盘上。

首先固定脊髓。其次，将腹部皮肤拉至鼻部并固定，第三步将食管和气管从颈部后方分离并固定。通过寻找颈动脉分叉来定位颈上神经节（SCG）。

颈动脉是成对的结构。颈部两侧各有一个分叉，因此每侧各有一个星状神经节（SCG）。SCG 位于分支正下方。

用两端将分叉处拉开，从而将颈上神经节（SCG）与动脉分离。与包围分叉处的不透明淡黄色脂肪组织相比，SCG呈半透明且无色。将神经节放入12毫升L-15培养基中。

将含有葡萄糖的培养基置于冰上的15毫升锥形管中。从胚胎中收获所有s SCG并轻轻抽吸后，将神经节在600 RPM转速下离心一分钟。离心后去除多余的Reese培养基。

将神经节悬浮于1毫升含有胰蛋白酶和胶原酶的L-15培养基中，在37摄氏度下孵育24分钟。

每8分钟振荡一次。随后加入10毫升海水中止胰蛋白酶反应，600转/分钟离心1分钟。尽可能吸除胰蛋白酶-胶原酶消化液，加入10毫升C培养基重悬神经节，600转/分钟离心1分钟。

重复此洗涤步骤一次。移除洗涤液，将神经节重悬于1毫升C培养基中，使用连接5毫升注射器的21号针头进行解离，最多上下吹打15次。随后换用23号针头继续吹打，直至大部分细胞团块完全解离。

通过70微米尼龙滤网将解离的神经元过滤至50毫升锥形管中，以去除残留的细胞团块。取10微升过滤后的细胞悬液，加入台盼蓝混合，以确定活细胞数量。使用血细胞计数板计数能够主动排除染料的细胞数量。

接下来，将5,000至6,000个总活细胞加入100微升C培养基中，接种于预先包被胶原蛋白和层粘连蛋白的96孔组织培养板的每个孔内，C培养基中需含有50纳克/毫升的神经生长因子。在37摄氏度下培养过夜。次日，即体外培养第一天（DIV 1），检查神经元是否正确贴壁以及是否有部分轴突突起生长。

将孔中的 C 培养基更换为含有神经生长因子（NGF Acho）和 5-氟-2-脱氧尿苷的 50 微升神经基础培养基（NBM）。每次更换一行培养基，以确保细胞不会干燥。将培养物在 37°C 下孵育 5 天。

每天监测培养物，以确认非神经元细胞的死亡和神经元的生长。从体外培养第六天开始进行本操作步骤时，需确认大部分非神经元支持细胞已被清除。在任何时候都必须尽量减少对神经元不必要的物理操作，这一点极为重要。

更换培养基时操作必须非常轻柔缓慢，否则由此产生的机械应力可能影响神经元的存活率。向每个孔中现有的培养基添加阿昔洛韦或CV，使其终浓度为100微摩尔。应缓慢而轻柔地加入CV，以确保机械力不会在次日对细胞产生不利影响。

在DIV 7时，用一种表达EGF报告基因与病毒裂解蛋白US11融合蛋白的重组HSV-1感染SCG培养物，感染复数为1至2。将稀释后的病毒直接加入孔中现有的培养基中。设置未感染的对照组和裂解性感染组。

在不含CV的培养基中设置阳性对照。在37摄氏度下孵育两到三小时以允许感染进行。随后，将感染培养基更换为含有NGF和CV的新鲜NBM。更换感染培养基时操作务必极其轻柔。将培养板向您倾斜，从孔的底部缓慢吸出培养基。

然后将移液器枪头对准孔板的孔壁，而不是孔底，使培养基轻轻沿孔壁滑下，覆盖细胞。每次更换一行培养基，以避免细胞干燥。将培养物放回培养箱，操作时务必轻柔，以避免影响细胞维持HSV-1潜伏感染的能力。

在37摄氏度下培养6天，使病毒建立潜伏感染。在此期间，使用荧光显微镜监测us11 EGFP的表达，作为裂解性复制的指标。

正如预期，模拟感染对照组中不应有GFP表达。S 11 EGFP仅应在感染组中被检测到。未进行CV处理的阳性对照孔表明初次感染成功并发生了有效的裂解性复制。

在DIV 14评估再激活时，小心地将含有CV的培养基更换为不含CV的新鲜培养基，操作方式同前。若条件允许，将移液器枪头对准孔壁而非孔底，使培养基沿孔壁轻轻流下，避免直接冲击细胞。加入药物或生物变量因素，例如20 µM的LY29004。

在A CV处理的潜伏感染培养物中，不应检测到GFP表达。将细胞放回37摄氏度环境中，持续培养5至6天。使用荧光显微镜监测活体培养物，以检测发生再激活的神经元。

通过计算含有EGFP阳性神经元的孔数，并将其表示为样本总孔数的比例，来确定再激活频率。该图展示了一个示例，其中使用已知的再激活诱导剂trigger statin处理晚期感染的SCG培养物。在药物处理后，每天通过荧光显微镜对再激活情况进行监测和评分，持续五天。

通过TSA处理，两天内再激活达到最大值的50%，五天内再激活达到DMSO处理组所代表的基础水平或自发再激活的60%。在此实验中，经处理的对照组培养物的再激活率约为10%，在该体外系统中通常范围为5%至20%。感染后期的SCG培养物还接受了LY29004处理。

将已知的再激活诱导剂LY诱导的再激活培养物与使用病毒DNA合成抑制剂PAA（磷ono，no乙酸）处理、以及同时使用这两种化合物处理的培养物进行比较，如图所示。在使用LY294002诱导再激活的培养物中，PAA抑制了US11-EGFP的表达，表明US11-EGFP的表达依赖于病毒DNA的复制。在进行该操作时，必须严格注意无菌操作技术，并尽可能轻柔地处理CG培养物，以避免因应激或机械运动导致自发性再激活增加。在完成建立HSV-1潜伏感染及培养神经元的操作后，可进一步开展其他方法，如S-H-R-N-A、基因敲低以及野生型和突变型基因的异位表达等，以鉴定调控HSV-1潜伏与再激活的神经元功能。

请务必注意，HSV-1 是一种人类病原体，需要采取 PSL-2 级别的安全防护措施。在进行本实验操作前，您应熟悉在 PSL-2 条件下的实验操作规范。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立 SCG 培养体系以建立 HSV-1 的潜伏感染，并有效诱导神经元中的病毒再激活。