旋转壁式生物反应器衍生的三维上皮细胞模型的培养与应用

本非传统方案提供了一种简便且稳定的培养系统，可将人上皮细胞培养成类器官三维模型，以模拟人体内组织的生理环境。首先，在组织培养瓶中将上皮细胞培养至形成融合的单层，收集细胞后与微载体珠粒混合，置于STLV生物反应器中，将STLV放置于旋转平台上，以形成持续自由下落的低流体剪切环境，使细胞附着于珠粒表面并生长，96小时后形成细胞聚集体，此后约每天持续培养。

在形成聚集体后，每周通过光学显微镜观察样本以监测发育进程，并根据细胞代谢情况补充 SDLV 中的培养基；一旦聚集体完全形成并发生细胞分化，即可将聚集体接种用于后续实验分析和检测。最终，该系统可构建出类似于体内环境的类器官模型系统，用于多种科学研究。

与传统的细胞培养等现有方法相比，该技术的主要优势在于上皮细胞将分化并极化形成类似组织的聚集体，因此在形态和功能上更接近真实的人体组织。这种三维模型系统为进一步研究上皮细胞生物学、宿主与病原体相互作用，以及可能引入系统中的不同类型细胞之间的复杂相互作用提供了有力工具。Dr. Andrea Radkey。

我实验室的一名博士后将演示此程序，以对慢速旋转横向培养器进行去毒处理。用旋盖封闭开口端口。用95%乙醇填充STLV，并平衡24小时。

移除乙醇，然后用灭菌的蒸馏水充满，并使用供应商提供的工具在37℃下孵育24小时，松开所有螺丝，从STLV中取出中心塞。将它们放入灭菌袋中，在110摄氏度下高压灭菌20分钟。重新组装STLV，并重复脱毒步骤以确保无菌状态。

接下来，拧紧STLV的螺丝。将预先灭菌的单向止流阀连接到每个端口。现在，从10毫升和5毫升螺口注射器上取下推杆，并将推杆保留在包装袋内。

为保持无菌状态，将注射器拧到三通旋塞上。继续向10毫升注射器中加入DPBS，直至STLV充满且5毫升注射器开始充液。然后将无菌推杆插入各注射器中，并通过交替推动注射器推杆的方式排出生物反应器中残留的气泡。

关闭旋塞，将STLV连接至旋转垂直平台。旋转至少24小时，以监测50毫升锥形管是否存在泄漏。向250毫克Cytodex微载体珠中加入15毫升DPBS，冷却后进行高压灭菌。

用培养基将上皮细胞洗涤三次，去除DPBS。轻轻旋转离心管以重悬磁珠，然后将磁珠重悬于15毫升培养基中。

首先在组织培养瓶中以每毫升1×10⁷个上皮细胞的密度进行单层培养。收集细胞，计数，并通过台盼蓝排斥染色法测定细胞活力。将细胞加入预先准备好的微珠中。

冲洗锥形管，以确保所有细胞均被转移。接下来，从STLV中移除DPBS和注射器。同时，使用10毫升血清移液管从中心端口移除塞子。

将上皮细胞磁珠悬液加入STLV中。用缓冲液冲洗一次锥形管，以转移所有细胞和磁珠。然后更换中心端口塞。

接下来，从5毫升和10毫升注射器中取出活塞，并将活塞保留在包装膜内。为保持无菌状态，将注射器的接口端与打开的旋塞阀拧紧封闭。用培养基填充STLV装置。

更换活塞并关闭旋塞。现在将新接种的STLV培养物置于37°C培养箱中平衡30分钟，期间不旋转。从培养箱中取出STLV后，打开旋塞。

使用注射器推杆去除气泡，并关闭旋塞。然后将STLV置于培养箱中，以20 RPM的转速持续旋转。96至120小时后，通过移除注射器并打开两个旋塞，将STLV倾斜，使微珠和细胞沉降，从而更换培养基。

静置后，使用注射器从侧端口吸出约75%的培养基，以执行换液操作。根据细胞代谢情况，继续按需补充新鲜培养基。同时，每5至7天监测一次类器官聚集体的生长状态和存活率。

为避免聚集体剪切，使用已从尖端起剪去约两厘米并经过灭菌的1000微升移液器吸头。小心从中心孔吸取200微升聚集体，分装至两个1.5毫升离心管中。取其中一份分装样品用于监测细胞活力。细胞从微珠上解离后，通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。

用于成像细胞聚集体的染色。将0.5至1毫升培养基加入第二个1.5毫升细胞聚集体等分试样中，并使用截断的1000微升移液枪头转移至小型培养皿中，以成像细胞聚集体。

对于某些上皮细胞模型，使用倒置光学显微镜观察时，需在收获细胞聚集体前约一周将聚集体转移至一次性半腔装置中，以增强培养物的通气。进行分析时，从STLV中取出注射器，从侧孔倒出约50%的培养基。移除中心塞，然后从中央孔小心地将所有内容物倒入50毫升锥形管中。

用五毫升培养基将STLV冲洗两次，并将冲洗液与收集的类器官合并。接着，将类器官从50毫升锥形管转移至Harv中。一周后，小心收集类器官，用于后续可能的检测方法、检测及分析。分化的人类上皮类器官在STLV生物反应器系统中培养。

扫描电镜和透射电镜图像取自在STLV中培养39天的人阴道细胞。可见三维细胞聚集体呈现出与组织相似的超微结构特征，包括微脊、凹陷、细胞内分泌囊泡以及顶端表面的微绒毛。三维阴道细胞的共聚焦免疫荧光显微镜图像显示黏蛋白以及上皮细胞特异性标志物和终末分化标志物的表达。这些具有生理相关性的表型也为评估化合物的毒性提供了优良的实验平台。

MTT 检测是一种常用于测量细胞活力、代谢或增殖的检测方法，可用于评估各种化学物质和化合物的毒性。或者，可通过台盼蓝排斥法测定经测试化合物处理后的毒性。在此示例中，经壬基酚聚氧乙烯醚九（NONOXINOL nine）处理后，阴道类聚集体表现出的毒性反应与宫颈 X 外植模型相似，但与单层培养细胞相比则呈现出不同的毒性特征。

这些三维细胞聚集体具有功能响应性，例如，在受到微生物来源的、可被Toll样受体识别的分子刺激时，聚集体能够响应并分泌促炎性细胞因子，包括IL-6蛋白以及孕酮受体的转录表达。在阴道细胞中也可观察到能够响应激素刺激的受体。

三维细胞聚集体不仅能够对病原体和激素分子产生响应，还能够功能性地支持单纯疱疹病毒2型（HSV-2）感染。一张HSV-2感染的三维阴道细胞聚集体的共聚焦显微镜图像展示了感染情况。还可通过流式细胞术定量分析聚集体内单个细胞的物理和功能特性，例如通过流式细胞术检测单个阴道细胞表面黏蛋白1（mucin 1）的表达水平。

与单层培养相比，在3D阴道类聚集体发育后，其表面黏蛋白1的表达百分比较低。该技术使组织生物学和传染病领域的研究人员能够研究结构以及对刺激的生理反应。利用这些类器官模型，我们能更好地模拟人类生物学特性。