Name: 旋转壁式生物反应器的培养和应用推导出三维上皮细胞模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 了解旋转壁式生物反应器培养技术，利用微载体珠在低流体剪切力环境中培养人上皮细胞，形成具有体内组织特征的器官型三维模型，用于组织工程和再生医学研究。

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作者感谢 Brooke Hjelm 提供的技术支持以及 Andrew Larsen 进行的蛋白质分析。本工作部分由替代研究与发展基金会（MMHK）资助项目以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所性传播感染与局部微杀菌剂合作研究中心项目（IU19 AI062150-01，MMHK）资助。我们衷心感谢《生殖生物学》允许重复使用图示。

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<li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+models%3A+Innovative+platforms+for+studying+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处介绍的RWV生物反应器技术可能使研究人员能够将其现有的细胞培养系统提升为更接近生理状态的类器官型细胞培养模型。RWV生物反应器细胞培养系统可提供低剪切力的微环境，使细胞能够形成三维细胞聚集体 体内类特性，包括紧密连接、黏蛋白分泌、胞外结构（如微绒毛）以及细胞极性。本文所展示的大部分数据和实例均采用在RWV系统中培养的阴道上皮细胞，但RWV系统也已被用于培养其他类型的上皮细胞，如小肠和大肠、肺、膀胱、肝脏及扁桃体上皮细胞，以构建三维类器官模型 1, 7-13, 18此外，该系统已被用于培养非上皮细胞类型的细胞，目前复杂的多细胞类器官培养模型的开发工作正在进行中。 2, 18.
本文所述方案旨在作为指导，可能需要根据目标细胞类型进行调整。在RWV系统中培养上皮细胞时，最常见的方案修改包括：细胞在STLV中培养的时间长度、将聚集体从STLV转移至HARV的决策及其时机，以及在STLV中初始接种时的细胞/微载体珠比例。为成功形成聚集体，还可考虑更专业的修改，例如微载体珠或支架的特性，包括表面积、直径、形状、表面涂层、密度、...

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21131</td><td>按1:500稀释使用</td></tr><tr><td>FACSDiva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>&amp;#946;-tublin 抗体</td><td>Calbiochem</td><td>654162</td><td>按1:5000稀释使用</td></tr><tr><td>Bio-Plex 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>171-000205</td><td>v5 软件</td></tr><tr><td>生物反应器及组件</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>孔径40&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>锥形管（50 mL）</td><td>Corning</td><td>5-538-60</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>细胞因子微球阵列试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>定制人源试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 微珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-500G</td><td>乙二胺四乙酸</td></tr><tr><td>上皮特异性抗体（ESA）</td><td>Chemicon International</td><td>CBL251</td><td>按1:50稀释使用</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10438</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>HARV（一次性）</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>37%</td></tr><tr><td>兜甲蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I 9018</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR international</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>MTT试剂</td><td>MP Biomedicals</td><td>194592</td><td>3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐</td></tr><tr><td>MUC1抗体（显微镜用）</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-7313</td><td>按1:50稀释使用</td></tr><tr><td>MUC1抗体（流式细胞术用）</td><td>BD Biosciences</td><td>559774</td><td>又称CD227，每次检测使用20&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;多聚甲醛&lt;/em&gt;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>用DPBS稀释至4%</td></tr><tr><td>培养皿（小号）</td><td>BD Biosciences</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>带滤膜的聚苯乙烯管</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯流式管</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>PR抗体</td><td>Dako</td><td>M3569</td><td>按1:100稀释使用</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>含DAPI的封片剂</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725</td><td></td></tr><tr><td>灭菌袋</td><td>VWR international</td><td>11213-035</td><td></td></tr><tr><td>活塞阀（单向）</td><td>MedexSupply</td><td>MX5061L</td><td></td></tr><tr><td>注射器（10 mL）</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>鲁尔锁扣式针头</td></tr><tr><td>注射器（5 mL）</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td>鲁尔锁扣式针头</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vp5抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-13525</td><td>HSV-2抗体克隆6F10；按1:5000稀释使用</td></tr></tbody></table>

旋转壁式生物反应器衍生的三维上皮细胞模型的培养与应用

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

机体内的细胞和组织会受到其微环境的影响，从而决定其结构、细胞间通讯以及整体功能。体外细胞培养模型若要准确模拟目标组织，培养环境是必须重点考虑的关键因素。传统的细胞培养系统通常在平坦的二维（2-D）不可渗透表面上培养上皮细胞。尽管传统培养系统已使我们获得大量研究成果，但许多结果在人体临床试验或组织离体实验中无法重现，这可能是由于缺乏具有生理相关性的微环境所致。
在此，我们介绍一种培养系统，该系统利用创新的旋转壁式反应器（RWV）生物反应器技术，克服了传统二维细胞培养中的诸多培养条件限制。我们及其他研究团队已证实，由RWV构建的类器官模型能够模拟人体组织的结构、功能以及对外界刺激的真实人类反应，其特性与人源外植体组织相似。 1-6RWV 生物反应器是一种悬浮培养系统，可在低生理流体剪切力条件下支持上皮细胞的生长。该生物反应器有两种不同形式：高宽比旋转容器（HARV）和低速横向转动容器（STLV），二者区别在于通气来源。上皮细胞可与多孔、胶原包被的微载体小球共同加入所选的生物反应器中。 （图1A）细胞在生物反应器中持续自由下落期间，利用微珠作为生长支架 （图1B）生物反应器提供的微环境可使细胞形成三维（3-D）聚集体，表现出 体内-在标准二维培养条件下通常无法观察到的类似特征 （图1D）这些特征包括紧密连接、黏液分泌以及顶-基底极性。 体内 蛋白质定位及其他上皮细胞类型特异性特性
从单层上皮细胞发展为完全分化的三维细胞聚集体的过程因细胞类型而异1, 7-13。定期从生物反应器中取样，可监测上皮细胞聚集体的形成、细胞分化标志物及细胞活力（图1D）。当细胞分化和聚集体形成确立后，可将细胞从生物反应器中收获，并对三维聚集体进行类似于二维培养细胞的多种检测，但需考虑若干因素（图1E-G）。在本研究中，我们详细描述了在RWV生物反应器系统中培养三维上皮细胞聚集体的具体步骤，以及适用于这些三维聚集体的多种潜在检测与分析方法。这些分析包括但不限于：结构/形态学分析（共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜）、细胞因子/趋化因子分泌与细胞信号通路检测（流式微球阵列和Western印迹分析）、基因表达分析（实时PCR）、毒理学/药物分析以及宿主-病原体相互作用研究。这些检测方法的运用为更深入和广泛的后续研究奠定了基础，例如代谢组学、转录组学、蛋白质组学及其他基于阵列的应用。我们的目标是提供一种非常规的培养人上皮细胞的方法，以在简便且稳健的系统中构建能够模拟人体in vivo组织的类器官三维模型，供具有不同科研兴趣的研究人员使用。

一种可使上皮细胞在生理条件下生长并形成三维细胞聚集体的旋转式细胞培养系统被描述。所生成的聚集体表现出 体内-样特征，而这些特征在传统培养模型中未被观察到，因此可作为多种科学研究中更为精确的器官型模型系统。

人体内的细胞和组织会经历各种环境条件，这些条件会影响其结构、细胞间通讯以及整体功能。

本非传统方案提供了一种简便且稳健的系统，用于将人上皮细胞培养成可模拟人体内组织的类器官三维模型。首先，在组织培养瓶中将上皮细胞培养至融合单层，收集后与微载体珠粒混合，置于STLV生物反应器中，将STLV放置于旋转平台上以形成持续自由下落的低流体剪切环境，使细胞附着于珠粒表面并生长，96小时后形成细胞聚集体，此后约每天观察一次。在形成聚集体后，每周通过光学显微镜观察样本以监测发育进程，并根据细胞代谢情况补充SDLV中的培养基。一旦聚集体完全形成并发生细胞分化，即可将聚集体接种用于后续实验分析和检测。最终，该系统可生成类似于体内环境的类器官模型系统，适用于多种科学研究。与传统的细胞培养等现有方法相比，该技术的主要优势在于上皮细胞将分化并极化形成类似组织的聚集体，因此在形态和功能上更接近真实的人体组织。这种三维模型系统为进一步研究上皮细胞生物学、宿主与病原体相互作用，以及可引入系统中的不同类型细胞之间的复杂相互作用提供了有力工具。Andrea Radkey 博士。我实验室的一名博士后将演示此程序，以对慢速旋转横向培养器进行脱毒处理。用旋盖封闭开放的端口。用95%乙醇填充STLV，并平衡24小时。移除乙醇，然后用灭菌的蒸馏水充满，并使用供应商提供的工具孵育24小时，松开所有螺丝，从STLV中取出中心塞。将它们放入灭菌袋中，在110摄氏度下高压灭菌20分钟。重新组装STLV，并重复脱毒步骤以确保无菌。接下来，拧紧STLV的螺丝。将预先灭菌的单向止流阀连接到每个端口。现在，从10毫升和5毫升螺口注射器上取下推杆，并将推杆保留在包装袋内。为保持无菌状态，将注射器拧到止流旋塞阀上。随后向10毫升注射器中加入DPBS，直至STLV充满且5毫升注射器开始充液。然后将无菌推杆插入各注射器中，并通过交替推动注射器推杆的方式排出生物反应器中的残留气泡。关闭旋塞，将STLV连接至旋转垂直平台。旋转至少24小时，在50毫升锥形管中监测是否泄漏。向250毫克Cytodex微载体珠中加入15毫升DPBS，冷却后进行高压灭菌。用培养基将上皮细胞洗涤三次，去除DPBS。轻轻旋转离心管使珠子重悬，然后将珠子重悬于15毫升培养基中。首先，在组织培养瓶中以每毫升1×10⁷个上皮细胞的密度进行单层培养。收集细胞，计数，并通过台盼蓝排斥染色法测定细胞活力。将细胞加入预先准备好的微珠中。冲洗锥形管，以确保所有细胞均被转移。接下来，从STLV中移除DPBS和注射器。同时，使用10毫升血清移液管从中心端口移除塞子。将上皮细胞磁珠悬液加入STLV中。用一次冲洗锥形管，以转移所有细胞和磁珠。然后更换中心端口塞。接下来，从5毫升和10毫升注射器中取出活塞，并将活塞保留在包装膜内。为保持无菌状态，将注射器的鲁尔接头端口与打开的旋塞阀拧紧封闭。用培养基填充STLV。更换柱塞并关闭旋塞。现在将新接种的STLV培养物置于37°C培养箱中平衡30分钟，期间不旋转。从培养箱中取出STLV后，打开旋塞。使用推杆去除气泡并关闭旋塞。然后将STLV置于培养箱中，以20 RPM的转速持续旋转。96至120小时后，通过移除注射器并打开两个旋塞，将STLV倾斜，使微珠和细胞沉降，从而更换培养基。静置后，使用注射器从侧口倒出约75%的培养基，以执行换液操作。根据细胞代谢情况，继续按需补充新鲜培养基。同时，每五至七天监测一次类器官聚集体的生长状态和存活率。为避免聚集体剪切，使用已从尖端截去约两厘米并经过灭菌的1000微升移液枪头。小心从中心孔吸取200微升聚集体，分装至两个1.5毫升离心管中。取其中一份用于监测细胞活力。在将细胞从微珠上解离后，通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。用于成像细胞聚集体的染色。使用截断的1000微升移液器吸头，将0.5至1毫升培养基加入第二个1.5毫升细胞聚集体等分试样中，并转移至小型培养皿中，以成像细胞聚集体。对于某些上皮细胞模型，使用倒置光学显微镜观察时，需在收获细胞聚集体前约一周将聚集体转移至一次性半腔装置中，以增强培养物的通气。进行分析时，从STLV中取出注射器，从侧端口倒出约50%的培养基。移除中心塞，然后从中央端口小心地将所有内容物倒入50毫升锥形管中。用五毫升培养基将STLV冲洗两次，并将冲洗液与收集的聚集体合并。接着，将聚集体从50毫升锥形管转移至Harv装置中。一周后，小心收集聚集体，用于潜在的检测形式、检测及分析；分化的人类上皮聚集体在STLV生物反应器系统中培养而成。扫描电镜和透射电镜图像取自在STLV中培养39天的人类阴道细胞。可见三维细胞聚集体呈现出与组织相似的超微结构特征，包括微脊、凹陷、细胞内分泌囊泡以及顶端表面的微绒毛。三维阴道细胞的共聚焦免疫荧光显微图像显示黏蛋白以及上皮细胞特异性标志物和终末分化标志物的表达。这些具有生理相关性的表型也为评估化合物的毒性提供了优良的平台。MTT 检测是一种常用于测量细胞活力、代谢或增殖的检测方法，可用于评估各种化学物质和化合物的毒性。或者，可通过台盼蓝排斥法测定经测试化合物处理后的毒性。在此示例中，经壬基酚聚氧乙烯醚九（NONOXINOL nine）处理后，阴道类聚集体表现出的毒性反应与宫颈 X 外植模型相似，但与单层培养细胞相比则呈现出不同的毒性特征。三维细胞聚集体具有功能响应性，例如，在受到微生物来源的、可被Toll样受体识别的分子刺激时，这些聚集体能够响应并分泌促炎性细胞因子，包括IL-6蛋白以及孕酮受体的转录表达。在阴道细胞中也可观察到能响应激素刺激的受体。3D 细胞聚集体不仅能够对病原体和激素分子产生响应，还能够功能性地支持单纯疱疹病毒 2 型（HSV-2）感染。一幅 HSV-2 感染的 3D 阴道细胞聚集体的共聚焦显微镜图像展示了感染情况。还可通过流式细胞术定量分析聚集体内单个细胞的物理和功能特性，例如，通过流式细胞术检测单个阴道细胞表面黏蛋白 1（mucin 1）的表达水平。与单层培养相比，3D 阴道类器官在其发育后表面表达的黏蛋白1（mucin one）百分比较低。该技术使组织生物学和传染病领域的研究人员能够研究结构以及对刺激的生理反应。利用这些类器官模型，我们能更好地模拟人类生物学特性。

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旋转壁式生物反应器的培养和应用推导出三维上皮细胞模型

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