Name: 旋转壁式生物反应器的培养和应用推导出三维上皮细胞模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 了解旋转壁式生物反应器培养技术，利用微载体珠在低流体剪切力环境中培养人上皮细胞，形成具有体内组织特征的器官型三维模型，用于组织工程和再生医学研究。

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作者感谢 Brooke Hjelm 提供的技术支持以及 Andrew Larsen 进行的蛋白质分析。本工作部分由替代研究与发展基金会（MMHK）资助项目以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所性传播感染与局部微杀菌剂合作研究中心项目（IU19 AI062150-01，MMHK）资助。我们衷心感谢《生殖生物学》允许重复使用图示。

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作者无任何利益冲突需要披露。

此处介绍的RWV生物反应器技术可能使研究人员能够将其现有的细胞培养系统提升为更接近生理状态的类器官型细胞培养模型。RWV生物反应器细胞培养系统可提供低剪切力的微环境，使细胞能够形成三维细胞聚集体 体内类特性，包括紧密连接、黏蛋白分泌、胞外结构（如微绒毛）以及细胞极性。本文所展示的大部分数据和实例均采用在RWV系统中培养的阴道上皮细胞，但RWV系统也已被用于培养其他类型的上皮细胞，如小肠和大肠、肺、膀胱、肝脏及扁桃体上皮细胞，以构建三维类器官模型 1, 7-13, 18此外，该系统已被用于培养非上皮细胞类型的细胞，目前复杂的多细胞类器官培养模型的开发工作正在进行中。 2, 18.
本文所述方案旨在作为指导，可能需要根据目标细胞类型进行调整。在RWV系统中培养上皮细胞时，最常见的方案修改包括：细胞在STLV中培养的时间长度、将聚集体从STLV转移至HARV的决策及其时机，以及在STLV中初始接种时的细胞/微载体珠比例。为成功形成聚集体，还可考虑更专业的修改，例如微载体珠或支架的特性，包括表面积、直径、形状、表面涂层、密度、...

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21131</td><td>按1:500稀释使用</td></tr><tr><td>FACSDiva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>&amp;#946;-tublin 抗体</td><td>Calbiochem</td><td>654162</td><td>按1:5000稀释使用</td></tr><tr><td>Bio-Plex 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>171-000205</td><td>v5 软件</td></tr><tr><td>生物反应器及组件</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>孔径40&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>锥形管（50 mL）</td><td>Corning</td><td>5-538-60</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR international</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>细胞因子微球阵列试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>定制人源试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 微珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-500G</td><td>乙二胺四乙酸</td></tr><tr><td>上皮特异性抗体（ESA）</td><td>Chemicon International</td><td>CBL251</td><td>按1:50稀释使用</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10438</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>HARV（一次性）</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>37%</td></tr><tr><td>兜甲蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I 9018</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR international</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>MTT试剂</td><td>MP Biomedicals</td><td>194592</td><td>3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐</td></tr><tr><td>MUC1抗体（显微镜用）</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-7313</td><td>按1:50稀释使用</td></tr><tr><td>MUC1抗体（流式细胞术用）</td><td>BD Biosciences</td><td>559774</td><td>又称CD227，每次检测使用20&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;多聚甲醛&lt;/em&gt;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>用DPBS稀释至4%</td></tr><tr><td>培养皿（小号）</td><td>BD Biosciences</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>带滤膜的聚苯乙烯管</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯流式管</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>PR抗体</td><td>Dako</td><td>M3569</td><td>按1:100稀释使用</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>含DAPI的封片剂</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725</td><td></td></tr><tr><td>灭菌袋</td><td>VWR international</td><td>11213-035</td><td></td></tr><tr><td>活塞阀（单向）</td><td>MedexSupply</td><td>MX5061L</td><td></td></tr><tr><td>注射器（10 mL）</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>鲁尔锁扣式针头</td></tr><tr><td>注射器（5 mL）</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td>鲁尔锁扣式针头</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vp5抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-13525</td><td>HSV-2抗体克隆6F10；按1:5000稀释使用</td></tr></tbody></table>

旋转壁式生物反应器衍生的三维上皮细胞模型的培养与应用

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

机体内的细胞和组织会受到其微环境的影响，从而决定其结构、细胞间通讯以及整体功能。体外细胞培养模型若要准确模拟目标组织，培养环境是必须重点考虑的关键因素。传统的细胞培养系统通常在平坦的二维（2-D）不可渗透表面上培养上皮细胞。尽管传统培养系统已使我们获得大量研究成果，但许多结果在人体临床试验或组织离体实验中无法重现，这可能是由于缺乏具有生理相关性的微环境所致。
在此，我们介绍一种培养系统，该系统利用创新的旋转壁式反应器（RWV）生物反应器技术，克服了传统二维细胞培养中的诸多培养条件限制。我们及其他研究团队已证实，由RWV构建的类器官模型能够模拟人体组织的结构、功能以及对外界刺激的真实人类反应，其特性与人源外植体组织相似。 1-6RWV 生物反应器是一种悬浮培养系统，可在低生理流体剪切力条件下支持上皮细胞的生长。该生物反应器有两种不同形式：高宽比旋转容器（HARV）和低速横向转动容器（STLV），二者区别在于通气来源。上皮细胞可与多孔、胶原包被的微载体小球共同加入所选的生物反应器中。 （图1A）细胞在生物反应器中持续自由下落期间，利用微珠作为生长支架 （图1B）生物反应器提供的微环境可使细胞形成三维（3-D）聚集体，表现出 体内-在标准二维培养条件下通常无法观察到的类似特征 （图1D）这些特征包括紧密连接、黏液分泌以及顶-基底极性。 体内 蛋白质定位及其他上皮细胞类型特异性特性
从单层上皮细胞发展为完全分化的三维细胞聚集体的过程因细胞类型而异1, 7-13。定期从生物反应器中取样，可监测上皮细胞聚集体的形成、细胞分化标志物及细胞活力（图1D）。当细胞分化和聚集体形成确立后，可将细胞从生物反应器中收获，并对三维聚集体进行类似于二维培养细胞的多种检测，但需考虑若干因素（图1E-G）。在本研究中，我们详细描述了在RWV生物反应器系统中培养三维上皮细胞聚集体的具体步骤，以及适用于这些三维聚集体的多种潜在检测与分析方法。这些分析包括但不限于：结构/形态学分析（共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜）、细胞因子/趋化因子分泌与细胞信号通路检测（流式微球阵列和Western印迹分析）、基因表达分析（实时PCR）、毒理学/药物分析以及宿主-病原体相互作用研究。这些检测方法的运用为更深入和广泛的后续研究奠定了基础，例如代谢组学、转录组学、蛋白质组学及其他基于阵列的应用。我们的目标是提供一种非常规的培养人上皮细胞的方法，以在简便且稳健的系统中构建能够模拟人体in vivo组织的类器官三维模型，供具有不同科研兴趣的研究人员使用。

一种可使上皮细胞在生理条件下生长并形成三维细胞聚集体的旋转式细胞培养系统被描述。所生成的聚集体表现出 体内-样特征，而这些特征在传统培养模型中未被观察到，因此可作为多种科学研究中更为精确的器官型模型系统。

人体内的细胞和组织会经历各种环境条件，这些条件会影响其结构、细胞间通讯以及整体功能。

本非传统方案提供了一种简便且稳健的系统，用于将人上皮细胞培养成可模拟人体内组织的类器官三维模型。首先，在组织培养瓶中将上皮细胞培养至融合单层，收集后与微载体珠粒混合，置于STLV生物反应器中，将STLV放置于旋转平台上以形成持续自由下落的低流体剪切环境，使细胞附着于珠粒表面并生长，96小时后形成细胞聚集体，此后约每天观察一次。在形成聚集体后，每周通过光学显微镜观察样本以监测发育进程，并根据细胞代谢情况补充SDLV中的培养基。一旦聚集体完全形成并发生细胞分化，即可将聚集体接种用于后续实验分析和检测。最终，该系统可生成类似于体内环境的类器官模型系统，适用于多种科学研究。与传统的细胞培养等现有方法相比，该技术的主要优势在于上皮细胞将分化并极化形成类似组织的聚集体，因此在形态和功能上更接近真实的人体组织。这种三维模型系统为进一步研究上皮细胞生物学、宿主与病原体相互作用，以及可引入系统中的不同类型细胞之间的复杂相互作用提供了有力工具。Andrea Radkey 博士。我实验室的一名博士后将演示此程序，以对慢速旋转横向培养器进行脱毒处理。用旋盖封闭开放的端口。用95%乙醇填充STLV，并平衡24小时。移除乙醇，然后用灭菌的蒸馏水充满，并使用供应商提供的工具孵育24小时，松开所有螺丝，从STLV中取出中心塞。将它们放入灭菌袋中，在110摄氏度下高压灭菌20分钟。重新组装STLV，并重复脱毒步骤以确保无菌。接下来，拧紧STLV的螺丝。将预先灭菌的单向止流阀连接到每个端口。现在，从10毫升和5毫升螺口注射器上取下推杆，并将推杆保留在包装袋内。为保持无菌状态，将注射器拧到止流旋塞阀上。随后向10毫升注射器中加入DPBS，直至STLV充满且5毫升注射器开始充液。然后将无菌推杆插入各注射器中，并通过交替推动注射器推杆的方式排出生物反应器中的残留气泡。关闭旋塞，将STLV连接至旋转垂直平台。旋转至少24小时，在50毫升锥形管中监测是否泄漏。向250毫克Cytodex微载体珠中加入15毫升DPBS，冷却后进行高压灭菌。用培养基将上皮细胞洗涤三次，去除DPBS。轻轻旋转离心管使珠子重悬，然后将珠子重悬于15毫升培养基中。首先，在组织培养瓶中以每毫升1×10⁷个上皮细胞的密度进行单层培养。收集细胞，计数，并通过台盼蓝排斥染色法测定细胞活力。将细胞加入预先准备好的微珠中。冲洗锥形管，以确保所有细胞均被转移。接下来，从STLV中移除DPBS和注射器。同时，使用10毫升血清移液管从中心端口移除塞子。将上皮细胞磁珠悬液加入STLV中。用一次冲洗锥形管，以转移所有细胞和磁珠。然后更换中心端口塞。接下来，从5毫升和10毫升注射器中取出活塞，并将活塞保留在包装膜内。为保持无菌状态，将注射器的鲁尔接头端口与打开的旋塞阀拧紧封闭。用培养基填充STLV。更换柱塞并关闭旋塞。现在将新接种的STLV培养物置于37

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生物学

旋转壁式生物反应器的培养和应用推导出三维上皮细胞模型

过去，许多体外培养系统——主要是单层培养——常常存在一个缺点，即分化的原代细胞寿命相对较短，并在培养过程中发生去分化。因此，它们的大多数器官特异性功能迅速丧失。为了在体外更好地重现这些细胞的生理条件，人们已对传统的单层培养方法进行了多种改进和优化。...

访谈：用于干细胞研究的生物反应器及表面修饰三维支架

传统的二维细胞培养技术通常会导致分化标志物、细胞因子和生长因子等特性的改变。在旋转细胞培养系统（RCCS）中进行三维细胞培养可重建许多此类因子的表达，本文以绒毛外滋养层细胞系为例展示了这一效果。...

用于人类细胞培养的旋转细胞培养系统：以人类滋养层细胞为模型

通过在更适宜的条件下培养，可以改善细胞在培养过程中的功能行为。 体内类三维培养环境16-21. 本文描述了一种用于中空纤维生物反应器系统的建立与操作方法...

中空纤维生物反应器用于 体内类哺乳动物组织培养

在三维（3-D）环境中生长的细胞相较于在二维（2-D）环境中培养的细胞具有显著改进例如，培养瓶或培养皿）。本文描述了一种在旋转壁式生物反应器（RWV）提供的微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的建立方法。...

在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的构建

本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。...

在细胞外基质中构建三维上皮组织

该方案描述了如何在球状体中构建可灌注的血管网络。通过设计球状体周围的微环境，可诱导血管生成，并将球状体与微流控装置中的微通道连接。该方法实现了对球状体的灌注，这是三维培养领域长期期待的技术。...

微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。...

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

本方案介绍了一种在微重力条件下培养成釉细胞样细胞并实现其三维生长的方法，以维持细胞的细长极化形态及牙釉质特异性蛋白的表达。同时描述了牙周组织工程构建物和肺器官在微重力条件下的培养条件。...

微重力条件下牙源性和呼吸系统细胞与器官的增殖

本文介绍了一种新设计的3D打印插入式装置，作为共培养模型，并通过研究内皮细胞与角质形成细胞之间的旁分泌细胞间通讯对其进行了验证。...

一种创新的3D打印插件，旨在实现简便的二维与三维细胞培养

在此，我们展示了在基于纳米纤维膜的双层系统中与成纤维细胞共培养的上皮细胞能够稳定地黏附于膜上并生长。...

利用纳米纤维膜建立上皮细胞三维共培养模块

了解旋转壁式生物反应器培养技术，利用微载体珠在低流体剪切力环境中培养人上皮细胞，形成具有体内组织特征的器官型三维模型，用于组织工程和再生医学研究。

旋转壁式生物反应器衍生的三维上皮细胞模型的培养与应用

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