Name: 组合合成和高通量的蛋白质释放的聚合物薄膜和纳米粒子库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习组合合成可生物降解的聚酸酐薄膜和纳米粒子库的方法，利用高通量自动化沉积装置进行蛋白质释放检测。该技术可加速药物递送和组织工程生物材料的合理设计与开发。

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作者感谢ONR-MURI奖（NN00014-06-1-1176）和美国陆军医学研究与物资司令部（项目编号W81XWH-10-1-0806）提供的经费支持。本研究工作得到了美国国家科学基金会（项目编号EEC 0552584和0851519）的资助。

1. 组合聚合物文库合成（聚合物化学结构变化）——机器设置见图1
<ol>
 <li>将每种单体溶解于适当的溶剂中（浓度 = 25 mg/ml），并分别装入10 cc气密式注射器中。</li>
 <li>将耐溶剂的鲁尔锁毛细管连接至每个注射器的末端。</li>
 <li>将注射器放置在注射泵（New Era Programmable Syringe Pumps）上，并固定到位。</li>
 <li>将线性驱动器（Zaber）设置至起始位置。</li>
 <li>使用铁架台夹具，将两根毛细管的末端定位至用于单体沉积的起始样品瓶/孔中。</li>
 <li>启动LabVIEW程序，该程序根据目标共聚物组成，将不同体积的每种单体泵入各个孔中。程序通过指令Z轴驱动器将毛细管下降至样品瓶/孔内，随后控制各泵 dispensing 所需体积来实现此操作。接着，程序指令Z轴驱动器返回初始位置，并控制X轴和Y轴驱动器移动至下一个样品瓶/孔的位置。此过程持续进行，直至每个孔中均沉积了目标体积的单体。</li>
 <li>完成单体沉积后，将多孔板或多瓶单体库转移至预热的真空烘箱中，在缩合聚合反应期间保持真空状态进行孵育。对于CPH:SA的合成，反应条件为180 °C、0.3 torr，持续1.5小时，但不同聚合物体系的反应条件会有所差异。</li>
</ol>
2. 组合式空白与载药聚合物纳米颗粒及薄膜文库的制备——参见图1的机器人装置
<ol>
 <li>将第一个可编程注射泵中的注射器装入溶剂（空白库）或含有分散蛋白的溶剂（蛋白负载库），第二个注射泵中的注射器保持空置。相邻样品架中用于制备纳米颗粒的试管内装入非溶剂（溶剂与非溶剂体积比为1:100）。若用于薄膜制备，则在相邻样品架中使用空的多孔板代替试管。</li>
 <li>通过LabVIEW程序，将溶剂注入聚合物库中的所有小瓶/孔（浓度 = 20 mg/ml），并孵育1–5分钟。可选地加入超声步骤（40 Hz下超声30秒），以确保聚合物完全溶解。</li>
 <li>接着，启动另一个LabVIEW程序，将样品抽吸至空注射器中，并注入相邻样品架中对应的非溶剂试管（用于制备纳米颗粒）或空孔（用于制备薄膜）中。</li>
 <li>该过程依次对离散聚合物库中的每种组分进行操作。</li>
 <li>随后将纳米颗粒库或薄膜库置于真空室中，以去除溶剂和非溶剂（纳米颗粒库也可通过真空过滤方式回收）。</li>
</ol>
3. 高通量蛋白质释放动力学
<ol>
 <li>为研究聚合物库中蛋白质的高通量释放动力学，需对一个96深孔（2 ml/孔）聚丙烯板进行改造，即将相邻列（如A和B、C和D、E和F、G和H）的孔壁上部1/3部分切除，使各孔相互连通。必须在此板中制备载蛋白薄膜或将纳米颗粒转移至其中，以开展高通量释放动力学研究。载蛋白纳米颗粒或薄膜样品仅可放置于相邻列中的一个孔内（如A、C、E和G列）。详见图4。</li>
 <li>将纳米颗粒转移至96深孔释放板后，静置使其沉降。缓慢向每个样品孔（A、C、E和G列）加入PBS缓冲液（0.1 mM，pH 7.4），随后向每个相邻孔（B、D、F和H列）加液，直至孔完全充满，缓冲液可在连通孔之间自由流动。对于纳米颗粒，此过程需格外小心，确保颗粒保留在样品孔底部（A、C、E和G列），不进入相邻的释放孔（B、D、F和H列）。在某些情况下，需通过离心使纳米颗粒样品沉降至样品孔底部（A、C、E和G列）。</li>
 <li>随后，用盖子密封释放板，并在实验期间置于设定温度（即 37 °C）下持续振荡。</li>
 <li>在设定的时间点（即 0.04、1、2、3、5、7、9、12、15、19、24和30天），使用9,400 Typhoon平板式荧光扫描仪（GE Healthcare）定量检测释放出的荧光染料标记蛋白的量。将释放板置于扫描仪表面，选择适当的激发激光和发射滤光片进行扫描，并定量释放孔（B、D、F和H列）中释放蛋白的荧光强度（Image Quant）。建议在孔板中加入已知浓度的蛋白标准品，用于计算蛋白含量并校正荧光染料的淬灭效应。</li>
</ol>
4. 代表性结果
聚合物库制备完成后，采用1H NMR、GPC 和 FTIR 进行表征，以验证该组合方法的有效性1,7,8,11。分子量范围为 10,000–20,000 g/mol，多分散指数范围为 1.5–3.0，化学组成准确，与聚酸酐合成的传统方法结果一致12-15。类似地，纳米粒子库的扫描电镜（SEM）图像显示，其表面形貌、粒径及粒径分布与传统方法制备的纳米粒子相似2。聚酸酐纳米粒子或薄膜的蛋白质释放动力学在改良的孔板中进行，具体方法如前所述1。结果表明，蛋白质的释放近似为零级释放，是否出现突释效应取决于蛋白质载量和聚合物化学性质（图 2 和 图 3）1,12,14,16。
<img alt="聚合物分配装置示意图；毛细管、注射泵、线性执行器；仅供科研使用。" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 组合式聚合物薄膜与纳米颗粒制备装置。
<img alt="随时间累积释放的TRBSA；分析Poly SA、CPH:SA聚合物组成的图表。" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 来自CPH:SA聚合物纳米颗粒库的德克萨斯红标记牛血清白蛋白（TRBSA）的高通量释放。富含SA的聚合物体系最快释放包封的TRBSA，而富含CPH的聚合物体系释放最慢。误差线表示标准偏差，n=4。经Petersen et. al.1许可转载。版权所有 2010 美国化学会。
 
<img alt="聚合物释放研究；CPTEG:CPH比率下累积质量分数随时间变化的曲线图。" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 从CPTEG:CPH聚合物薄膜文库中高通量释放德克萨斯红标记的牛血清白蛋白（TRBSA）。富含CPTEG的聚合物体系释放包封的TRBSA速度最快，而富含CPH的聚合物体系释放最慢。误差条表示标准偏差，n=3。
<img alt="聚合物修饰示意图；比较聚合物薄膜涂覆前后的表面。" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 显示96孔深孔聚丙烯板中两个相邻孔在修饰“前”和“后”的图像。右侧的“修饰后”图像还展示了在左侧孔底部形成含包埋荧光分子的聚合物薄膜，该荧光分子从两孔之间释放至缓冲液中，并在右侧孔中被检测到。

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial%2Fhigh-throughput+methods+for+the+determination+of+polyanhydride+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior.</a> J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).</li>
<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

了解必要的合成条件和玻璃化转变温度（Tg聚合物合成的特性对于文库制备至关重要。如果 Tgs 低于室温时，纳米颗粒的制备步骤可能需要在低于 T 的受控温度环境中进行g 聚合物的。此外，需注意确保所有接触高温和溶剂的设备均能耐受相应条件。本方案中的多个参数可进行调整（即温度、真空度、孵育时间、溶剂、非溶剂、聚合物浓度、溶剂与非溶剂比例等）以适应不同聚合物体系的合成或颗粒/薄膜制备。在某些情况下，纳米颗粒在溶剂中长时间内（足以通过真空干燥去除溶剂）不稳定，因此可采用两种替代的溶剂去除方法：1）将颗粒缓慢离心，倾去上清液溶剂，随后干燥剩余颗粒；或 2）通过真空过滤分离颗粒，然后进行干燥。在制备空白或载蛋白纳米颗粒/薄膜后，可进行高通量表征或测试，以筛选生物材料在蛋白、细胞或宿主相互作用方面的性能。该高通量方法可实现针对特定应用的生物材料性能快速优化。

<table><tbody><tr><td>电动XYZ载物台：3台T-LSM050A，每轴行程50 mm</td><td>Zaber Technologies</td><td>T-XYZ-LSM050A-KT04</td><td></td></tr><tr><td>NE-1000 单通道注射泵</td><td>New Era泵系统</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex* Vista* 无沿可重复使用玻璃培养管</td><td>康宁</td><td>07-250-125</td><td></td></tr><tr><td>玻璃比色皿</td><td>科学策略</td><td>G102</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>国家仪器</td><td>776671-35</td><td></td></tr><tr><td>SGE 气密型注射器，鲁尔锁扣</td><td>Sigma Aldrich</td><td>509507</td><td></td></tr><tr><td>U96 深孔板 1.3 ml &amp;amp; 2.0 ml</td><td>赛默飞世尔科技：Nunc</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>封板膜</td><td>赛默飞世尔科技：Nunc</td><td>276000</td><td></td></tr><tr><td>台风 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-79</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 50 圆形滤纸 90 mm</td><td>Whatman</td><td>1450-090</td><td></td></tr></tbody></table>

聚合物薄膜与纳米粒子库的组合合成及高通量蛋白质释放

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

聚酸酐是一类具有良好生物相容性和药物递送能力的生物材料。尽管过去已广泛采用传统的单一样品逐一合成方法对其进行研究，但近年来发展出一种高通量的新方法，能够实现大量聚酸酐库的合成与测试1。该方法将显著提高这些生物材料在药物和疫苗递送应用中的优化与设计效率。本文所述方法包括可生物降解聚酸酐薄膜和纳米粒子库的组合合成，以及对这些库中蛋白质释放的高通量检测。在此由机器人操作的方法（图1）中，线性执行器和注射泵由LabVIEW控制，从而实现无需人工干预的自动化流程，避免人为误差。此外，该方法能够快速制备微尺度聚合物库，在减小批次规模的同时，生成多变量的聚合物体系。这种组合合成策略可在合成一种聚合物所需的时间内，完成多达15种不同聚合物的合成。另外，通过将聚合物库溶解于溶剂后沉淀至非溶剂中（用于制备纳米粒子）或通过真空干燥（用于制备薄膜），可将组合聚合物库加工成空白或负载蛋白质的几何结构，如薄膜或纳米粒子。当将荧光染料标记的蛋白质载入聚合物库后，可采用基于荧光的检测方法对蛋白质释放动力学进行高通量评估（图2和图3），如先前所述1。该组合平台已通过传统方法验证2，并对聚酸酐薄膜和纳米粒子库进行了1H NMR和FTIR表征。这些库已系统筛选了蛋白质释放动力学、稳定性及抗原性；体外细胞毒性、细胞因子产生、表面标志物表达、黏附、增殖与分化；以及体内生物分布和黏膜黏附性能1-11。本文开发的组合方法实现了高通量聚合物合成及蛋白质负载纳米粒子与薄膜库的制备，进而可对其进行体外和体内筛选，以优化生物材料性能。

本方法描述了可生物降解聚酸酐薄膜和纳米颗粒库的组合合成，以及从这些库中高通量检测蛋白质释放的技术。

聚酸酐是一类具有良好生物相容性和药物递送能力的生物材料。尽管已有大量研究针对……

本视频介绍了可生物降解聚酸酐薄膜和纳米粒子库的组合合成方法，以及从这些库中高通量检测蛋白质释放的技术。首先，使用高通量自动沉积装置将组成多样的单体阵列沉积到玻璃比色皿中。随后在180摄氏度、0.3托的条件下进行1.5小时的缩聚反应。这些反应条件专用于C-P-H-S-A聚酸酐聚合物的合成。使用自动点样装置，将溶剂及用于包封的任何组分沉积到含有聚合物文库的比色皿中。可进行超声处理以确保聚合物完全溶解，并使其他组分均匀分散。然后将溶解的聚合物转移至含有非溶剂的试管中，通过纳米沉淀法制备纳米颗粒文库。通过真空干燥或过滤回收纳米颗粒，随后转移至经修饰的96孔释放板中。最后，在生理条件下孵育载蛋白文库，并采用荧光标记检测法评估蛋白释放动力学。最终可以获得显示蛋白质释放动力学随聚合物特性或释放环境条件变化的结果。与传统的逐个样品检测方法相比，该方法的主要优势在于能够同时合成多个样品。随后可对这些样品进行高通量筛选，用于研究蛋白质-聚合物、细胞-聚合物或宿主-聚合物之间的相互作用。这将加速用于药物递送和组织工程的这些生物材料的合理设计与开发。演示该操作的是我实验室的术后研究员 La Tricia Peterson。在本视频部分，使用 Hyatt 高通量沉积装置，在聚合物合成后沉积具有组成多样性的单体库。该装置用于制备空白或负载蛋白质的聚合物薄膜或纳米颗粒的组合材料库。该自动化平台由两个可编程的注射泵和三个线性驱动器串联连接至计算机组成。通过 LabVIEW 软件向注射泵和驱动器发送控制指令。将10 cc气密型注射器装入注射泵中，并通过鲁尔锁接头连接金属毛细管，将聚合物溶液注入玻璃比色皿中。本演示实验中，将使用癸二酸（seic acid，SA）与1,6-双（对氧苯基）乙烷（six Biss para oxy heane，CPH）制备一系列包载德克萨斯红标记牛血清白蛋白（Texas Red Boan serum albumin）的纳米颗粒库。本视频及配套文档中的操作说明可调整用于制备和测试多种聚合物薄膜及纳米颗粒库。合成文库时，首先将每种单体和氯仿在玻璃小瓶中溶解，终浓度为每毫升25毫克。接下来，通过将溶液从注射器的鲁尔锁端吸入，将每种溶液装入10毫升气密注射器中。去除所有气泡。接下来，将耐溶剂的螺口不锈钢毛细管连接到注射器末端。用夹子固定毛细管，并将其固定在铁架台上。然后将两根毛细管的末端置于起始液中。用于单体沉积。将注射器放置在可编程注射泵上，并在实验室视图软件中将其锁定到位。在软件中将线性执行器设置到起始位置。启动自动化沉积系统，将SA和CPH单体分别注入玻璃比色皿的x、y和Z轴位置。驱动器将准确定位毛细管至各个位置，并通过编程控制向每个比色皿泵入设定体积的各单体，从而构建组分可变的单体文库。完成单体沉积后。将单体库转移至预热的真空烘箱中，在180摄氏度和0.3托条件下孵

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生物工程

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用于生物材料高通量发现的聚合物微阵列

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基于微流控平台的高通量蛋白质表达仪

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一种在无模板基底上功能化并自组装宏观纳米粒子-配体单层膜的技术

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纳米凝胶是一种用于递送生物制剂的优良且多功能的纳米颗粒平台。采用一步交联共纳米聚合策略，在水相条件下合成了能够包载基于蛋白质的有效成分的响应性聚乙二醇基聚合物纳米凝胶。本文介绍了这些新型纳米颗粒的最佳制备方法及其表征过程。...

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将无细胞蛋白质合成反应嵌入宏观水凝胶的方法

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