采用¹⁸O富集水的蛋白酶及酸催化标记工作流程

本演示介绍了利用氧18富集水对蛋白质消化物和合成肽进行稳定同位素标记的工作流程。首先在蛋白酶催化的古时间进程实验中，将底物和蛋白酶在含50%氧18富集水的条件下孵育，以掺入氧18原子；若蛋白酶具备双重标记能力，则可对消化后的裂解产物再次与目标蛋白酶在含50%氧18富集水的条件下重复孵育。

EO 工作流程通过酸催化，在预定时间间隔内将氧18原子引入功能基团。在质谱数据采集时，将反应混合物等分试样点样至带有基质的霉变靶板，可生成肽段裂解反应的谱图时间曲线，以及标记裂解产物的各个肽段物种的氧18掺入曲线，并从中选择用于基于MS/MS的序列鉴定。最终，这些工作流程为蛋白质组学的定性和定量研究提供了多功能工具。

该方法有助于解答蛋白酶研究领域中的关键问题，例如鉴定复杂蛋白水解途径中的反应速率、限速步骤以及反应中间产物。通过古时间进程所鉴定出的蛋白水解特征，为底物特异性提供了重要信息。此外，数据的时间进程分析也利用了动力学信息。

我实验室的一名博士后将演示该实验步骤。古时间过程工作流程通过蛋白酶催化的氧18掺入来监测蛋白水解切割反应的动力学变化。对于20 µL的反应体系，将样品肽加入含有富氧18水的蛋白酶反应缓冲液中，取0.5 µL反应混合物与0.5 µL基质混合，点样至Opti-3 84孔MALDI靶板上，并在室温下静置直至溶剂液滴完全干燥。同时，将反应混合物分装至两个离心管中。

样品管的对照和样品。加入目标蛋白酶，在推荐的酶反应温度下孵育。在指定的时间点取样。

取0.5微升等分试样，与0.5微升基质混合后点样于多靶板上。随后按照本古蛋白质组学消化后标记流程中后续所述方法，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析反应动力学。例如胰蛋白酶等蛋白酶可催化羧基氧交换反应，从而掺入¹⁸O。在完成未标记¹⁸O的蛋白质消化后，将切割产物通过PepClean C₁₈离心柱，以去除残留的蛋白酶活性。

然后将样品重悬于20微升含有氧18标记水的胰蛋白酶反应缓冲液中。取0.5微升等分试样，与等体积基质混合，随后点样至Opti-TOF 384 MALDI靶板上，风干。

接下来，将反应溶液分装至对照管和样品管中。加入胰蛋白酶，并在37摄氏度下孵育。为监测反应进程，取出0.5 µL的等分试样。

加入0.5微升基质，混合后点样于Maltar板上。通过MALDI-TOF-MS分析该羧基氧交换反应的动力学。IEO时间进程工作流程依赖于酸性肽侧链和末端基团的酸催化羧基氧交换反应。

首先，将50纳摩尔的单个肽段与等比例的氧18标记水在有或无0.1%终浓度三氯乙酸的条件下孵育，每天取0.5微升反应液，连续48天直接与基质共沉淀点样至MALDI靶板上。定期将MALDI靶板送样进行MALDI-TOF质谱产物分析。该部分细节详见随附的手稿。

首先，在正离子模式下采集三份重复的质谱。校准多重检测器并设置质谱采集参数后，采集子谱图的单次扫描信号。接着，从4,000系列Explorer数据采集软件中导出质谱数据文件。

然后导入内部信息系统，该系统利用 Mascot Distiller 软件进行谱图处理和峰检测。去卷积同位素峰簇，并自动确定氧18掺入比率，将氧18掺入比率记录为各个肽段同位素物种对整个同位素峰簇的相对贡献。对时间进程实验中的每个样本，在100 ppm质量宽度范围内对二进制列表进行筛选，并至少归入三个数值。

从相关的质谱数据文件中提取所有检测到的肽段物种的分子质量。现在使用X pacey查找肽段集合，设定200 PPM的质量误差容限。将该峰列表与根据底物肽序列预测的蛋白水解裂解产物数据进行比较。

对“find pep”工具预测的所有裂解产物质量值以及与氧18掺入相关的bin值，进行msms谱图采集。每个子谱图以随机模式采集50次质谱信号，每点最多采集40个子谱图，并导出msms文件。随后将MSMS数据文件导入分析系统，进行峰检测，并生成与相应bend MS数据关联的MSMS峰列表，用于肽段鉴定。

在 Mascot 搜索引擎中设置以下搜索参数：无酶特异性，前体离子质量容差为 150 PPM，碎片离子质量容差为 0.2 Dalton。将 M-S-M-S-P 列表与 Swiss-Prot 数据库进行比对。此外，可通过数据浏览器软件验证肽段鉴定结果，方法是确认在碎裂离子的谱图时间分布中存在特征性的氧18掺入模式。

使用宏从数据浏览器软件中将每个反应时间点的质谱数据文件导出为 ASCI 文件，然后将这些文件导入数据分析与绘图软件，以瀑布图形式展示，从而为每条谱带生成氧-18掺入图。针对肽段裂解产物，提取所有反应时间点下各个肽段同位素物种的相对贡献值，并将其对时间作图。

此类光谱时间图可用于展示蛋白水解反应的动力学过程。本实验分析内皮素转换酶1（endothelium converting enzyme one）对生物活性肽endo和C的切割作用。通过瀑布图形式呈现古时间进程实验的质谱数据，可同时监测底物的降解过程以及中间产物和终产物的生成情况。

通过MSMS鉴定切割产物及其同位素峰簇中特征性的氧18掺入标记。胰蛋白酶的这一反应机制表明，丝氨酸蛋白酶可介导多达两个氧18原子掺入肽段切割产物中。在基于蛋白酶标记的工作流程中，肽键切割反应导致新生成的肽段切割产物具有50%的单氧18掺入比例；而像胰蛋白酶这类能够重新结合反应产物的蛋白酶，会进一步通过羧基氧交换反应催化第二个氧18原子的掺入。

在平衡状态下，氧18标记在未标记、单标记和双标记产物中的分布比例为1:2:1。在蛋白水解末端预消化标记的工作流程中，不会发生肽键断裂，而是仅通过羧基氧交换反应实现最多两个氧18原子的掺入。

因此，只有能够重新结合其肽段切割产物的蛋白酶才会发生氧18的掺入。酸催化介导的氧18标记会导致每个羧基中掺入两个氧18原子。在本实验过程中，通过氧18原子的摄取，可以观察到血管紧张素一的同位素峰簇出现多个+2道尔顿的质量偏移。

通过以时间分辨的方式结合OPE标记与高分辨质谱技术，古时间进程法可实现对肽段产物生成过程的动态分析。该检测方法可用于生成稳定且经局部标记的肽段，以用于定性和定量蛋白质组学研究，并可用于评估他克莫司肽段生成的动力学过程。

古法时间进程旨在生理相关条件下评估蛋白水解途径。该技术为近期我们对人类癌症微环境中裂解过程的系统研究奠定了基础。