Name: 使用单个病毒基因组的单病毒颗粒的分离和基因组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 了解单病毒基因组学方法，通过流式细胞术分选单个病毒颗粒，利用多重置换扩增技术进行全基因组扩增，结合高通量测序实现无需培养的病毒基因组分析。该方法适用于病毒生态学研究。

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我们感谢 Ken Nealson 在论文准备过程中提供的见解和建议。

1. 病毒悬液的制备
在通过流式细胞术分离单个病毒颗粒之前，制备未固定的病毒悬液。
<ol>
	<li>采用已建立的方案分离病毒颗粒，确保最终病毒悬液包含于0.1 μm滤膜过滤的TE（Tris-EDTA，pH 8）中。推荐使用切向流过滤（TFF）方法6，尽管已有其他方法使用化学絮凝法7。</li>
	<li>使用已建立的方案对病毒颗粒进行计数，e.g. 使用落射荧光显微技术8-10或流式细胞术11,12。</li>
	<li>将病毒悬液分装至两个Eppendorf管中（推荐最终体积为1,000 μl）。</li>
</ol>
2. 流式细胞术
<ol>
	<li>使用配备定制前向散射光电倍增管（FSC PMT）的 BD FACSAria II 流式细胞仪对病毒进行分选时，将病毒颗粒稀释于 0.1 μm- 过滤的 TE 缓冲液，pH 8.0，调整至适当滴度以达到每秒 200 个事件的事件速率-1.</li>
	<li>设置阈值以最大化信噪比， 例如对于含有T4和λ噬菌体颗粒的混合样本，建议设置FSC PMT为1,000，SSC为200。</li>
	<li>运行 100 μl 仅含1）的“空白”样本 0.1 μm过滤的 TE 和 2） 0.1 μm过滤的 TE 缓冲液和 1e-4 稀释度（10,000 倍浓缩液）的 SybrGreen1。</li>
	<li>运行少量等分试样（100 μl 建议先使用未染色的病毒悬液进行检测以评估背景信号，随后检测经染色的病毒悬液（SYBR Green1 按原液1e-4稀释），每份样本收集总计5,000个病毒颗粒事件。此步骤用于检查浓度，并在分选前必要时调整分选门。我们建议将门设在病毒颗粒群的中心区域且范围紧凑。此外，在设置门时，我们采用SYBR Green与FSC PMT散点图。</li>
	<li>添加 5 μl 1%低熔点（LMP）琼脂糖（溶于TBE缓冲液）冷却至 37 °C 向聚四氟乙烯（PTFE）显微镜载玻片（Electron Microscopy Sciences）的每个孔中加入</li>
	<li>将PTFE显微镜载玻片装入流式细胞仪，以捕获分选的病毒颗粒。</li>
	<li>将SYBR Green染色的病毒颗粒直接分选到含低熔点琼脂糖的PTFE载玻片上。我们建议在某些孔中分选10个或更多事件（病毒颗粒），以利于在共聚焦激光扫描显微镜（CSLM）下检测病毒的定位深度。</li>
	<li>分选完成后，从流式细胞仪中取出载片并添加 5 μl 冷却至室温的更多LMP琼脂糖 37 °C 向每个孔中加入，从而包埋病毒颗粒。</li>
</ol>
3. 使用共聚焦显微镜观察单个病毒颗粒
如果需要单个病毒颗粒，则必须确定每个孔中是否含有单个病毒，此时需要使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对嵌入的病毒颗粒进行三维成像，以确认仅存在单个颗粒，并排除多个病毒相互重叠堆积的情况。
<ol>
	<li>将显微镜激光设置为 488 nm 激发波长。</li>
	<li>使用 63X 长工作距离物镜对包埋的病毒颗粒进行成像。</li>
</ol>
4. 全基因组扩增
<ol>
	<li>通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）鉴定出含有单个病毒的孔后，在琼脂糖内（原位）使用多重置换扩增（MDA）进行全基因组扩增。</li>
	<li>为降低引入DNA污染的可能性，使用无菌镊子和/或剃刀将目标琼脂糖“微珠”从载玻片上取下，并转移至无菌PCR管中。</li>
	<li>在PCR仪的加热块中，于94 °C加热3分钟，对病毒颗粒进行原位裂解。</li>
	<li>按照制造商推荐方法（GenomiPhi HY试剂盒，GE Healthcare）进行MDA反应，但作如下修改：
	<ol>
		<li>将样品和反应缓冲液体积减少至11.25 μl，并在30 °C孵育最多2小时，以减少非特异性扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将扩增后的基因组材料纯化：将基因组DNA（gDNA）转移至1.7 ml Eppendorf管中，加入1/10体积的3 M醋酸钠（NaOAc）TBE缓冲液（与低熔点琼脂糖制备所用缓冲液相同）。</li>
	<li>将样品置于55 °C下10分钟，以溶解琼脂糖。</li>
	<li>将管子转移至42 °C，使温度降低后再加入酶。</li>
	<li>向每管中加入2单位β-琼脂糖酶，孵育2小时。</li>
	<li>向管中加入等体积的缓冲酚饱和溶液，剧烈混匀后在3,500 × g离心15分钟。将含有DNA的上清液转移至新的1.7 ml Eppendorf管中。</li>
	<li>加入一倍体积的100%异丙醇和1 μl Glycoblue。通过反复倒置管子充分混匀。</li>
	<li>在4 °C、28,000 × g离心60分钟。小心倾去异丙醇，避免扰动沉淀。向每管中加入150 μl 70%乙醇，在28,000 × g、室温下离心10分钟。弃去乙醇，将DNA沉淀空气干燥后，用适量TE缓冲液重悬DNA。</li>
	<li>我们建议重复步骤4.4–4.9，并作如下修改：设置3–5个平行MDA反应，将30 °C孵育时间缩短至1小时。纯化后合并样品，并使用95–100%乙醇沉淀，以获得所需浓度。</li>
</ol>
5. 典型结果
图1总结了SVG流程。这些方法利用流式细胞术将病毒颗粒分选到含有琼脂糖的聚四氟乙烯（PTFE）显微镜载玻片上，从混合的病毒群落中分离单个病毒颗粒，随后通过MDA扩增获得足量的基因组DNA，用于测序。
作为概念验证，将噬菌体λ和T4混合后进行SVG处理11。病毒颗粒被捕获并包埋于琼脂糖后，采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行观察，以确认获得单个病毒颗粒；结果如图2所示。确定含有单个病毒颗粒的孔后，选择这些孔进行基因组DNA的MDA扩增。随后，我们采用针对T4和λ噬菌体的多重PCR鉴定所分离的病毒颗粒，结果如图3所示。最终选择一个分离的λ噬菌体进行基因组测序。
使用454-Titanium技术进行基因组测序，并对测序读长进行参考序列比对，以确定使用SVG获得的覆盖度。图4显示，几乎整个λ基因组均被回收（仅前5 bp除外）。
<img alt="流式细胞术过程；示意图；通过光学检测和分选进行细胞计数和分析。" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. SVG 方法学。 含有混合病毒群的病毒悬液通过流式细胞术被分离为单个病毒颗粒，随后分选至单独的琼脂糖“微珠”上。在流式细胞术分选后，通过覆盖一层额外的琼脂糖将病毒包埋于琼脂糖微珠内。最后，在原位进行全基因组扩增 in situ。
<img alt="显微镜点检测示意图；插图显示信号强度（RFU）在特定值处出现峰值。" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 包埋在琼脂糖微珠中的分选病毒颗粒的共聚焦激光扫描显微图像。 A) 琼脂糖微珠内经Sybr Green I染色的病毒颗粒的三维重建图像。插图：分离病毒颗粒的高倍放大图像。B) 琼脂糖微珠内单个染色病毒颗粒的相对荧光强度轮廓图。
<img alt="Lambda/T4 特异性 PCR 凝胶电泳图，显示 DNA 条带和分子量标记，PCR 结果对比。" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
 图 3. 利用 PCR 鉴定噬菌体。 A) 使用 T4 和 lambda 特异性引物进行多重 PCR 以进行基因分型，泳道：1. TrackIt 1 kb plus ladder (Invitrogen)，2. lambda 整合酶 (750 bp)，3. T4 主要衣壳蛋白 (1,050 bp)，4. lambda 整合酶与 T4 主要衣壳蛋白混合物。B) 随后进行 lambda 特异性 PCR，扩增额外位点以进一步确认噬菌体基因组的分离，泳道：1. lambda 整合酶 (750 bp)，2. lambda 阻遏蛋白 (356 bp)，3. lambda sie（超感染排斥）(456 bp)，4. TrackIt 1 kb plus ladder (Invitrogen)。
<img alt="基因组数据分析；基因定位、组成分布；序列波形图。" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. Lambda 基因组特征与覆盖度。 A) GC 含量图，B) Lambda 基因组图谱（改编自 <a href="http://img.jgi.doe.gov" target="_blank">http://img.jgi.doe.gov</a>），以及 C) SVG 测序读段比对至参考噬菌体 lambda 基因组的结果，横轴为基因组位置，纵轴为覆盖百分比。

<ol><li>Raghunathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+amplification+from+a+single+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA amplification from a single bacterium.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).</li>
<li>Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomic+sequencing+using+Multiple+Displacement+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).</li>
<li>Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+single+microbial+cells+from+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).</li>
<li>Edwards, R. A., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral metagenomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).</li>
<li>Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of viruses in the environment.</a> Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).</li>
<li>Williamson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+metagenomic+characterization+of+viruses+within+aquatic+microbial+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456(2008).</li>
<li>John, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+concentration+of+ocean+viruses+by+chemical+flocculation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).</li>
<li>Noble, R., Fuhrman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li>
<li>Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+viruses+in+marine+waters%3A+assessment+by+epifluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).</li>
<li>Hennes, K. P., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+counts+of+viruses+in+natural+waters+and+laboratory+cultures+by+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol.+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy.</a> Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).</li>
<li>Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+marine+viruses+in+culture+and+natural+samples+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).</li>
<li>Brussaard, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+bacteriophages+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enumeration of bacteriophages using flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).</li>
<li>Allen, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Virus+Genomics%3A+A+New+Tool+for+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery.</a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+cloning+using+phi+29+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在应用SVG方法时，必须考虑若干重要因素。正如概念验证实验中所进行的13，基因分型对于环境样本或未知分离物而言并非可行选择，因为在所有病毒类群中并不存在保守的引物。此外，在使用MDA反应进行扩增时，常有背景DNA合成或非特异性扩增的报道14。非特异性扩增被认为源于反应试剂中的污染性DNA，和/或反应混合物中随机六聚体引发的扩增机制。在处理病毒群落时，由于病毒模板DNA的量远低于单个细菌细胞（因病毒颗粒与细菌细胞在粒径和基因组DNA含量上存在显著差异：病毒为25–100 nm，约1.5 fg；细菌为0.2–1.5 μm，约14 fg），非特异性DNA被优先扩增的可能性可能更高。为降低非特异性扩增水平，建议采取以下方法：使用DNase I处理病毒群落、利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检查含病毒的琼脂糖珠、缩短MDA孵育时间，以及提高测序深度（i.e. 借助454-Titanium和Illumina等新一代测序技术所能实现的测序能力）。
在对环境样本进行SVG操作时，应进行优化 从头合成 组装对于获得完整...

<table><tbody><tr><td>1X TE 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液饱和酚</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>GenomiPhi HY 试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>25-6600-22</td><td></td></tr><tr><td>糖蓝（Glycoblue）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>15 mg/ml</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖（LMP agarose）</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 显微镜载片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63430-04</td><td>24 孔，4 mm 直径</td></tr><tr><td>SybrGreen</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000X</td></tr><tr><td>&amp;#946;-琼脂糖酶（agarase）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0392S</td><td></td></tr></tbody></table>

单病毒基因组学用于单个病毒颗粒的分离与基因组分析

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

单个微生物细胞的全基因组扩增与测序能够实现无需培养的基因组表征1-3。病毒在地球上无处不在，数量极为庞大4，在各类环境中均具有重要作用5，但迄今尚未通过类似方法被揭示。本文描述了一种用于分离和表征单个病毒基因组的方法，称为“单病毒基因组学”（SVG）。SVG 利用流式细胞术分离单个病毒颗粒，并通过全基因组扩增获得高分子量的基因组DNA（gDNA），所得gDNA可用于后续测序反应。

单病毒基因组学（SVG）是一种用于分离和扩增单个病毒颗粒基因组的方法。通过流式细胞术将混合病毒悬液分选到含有琼脂糖的载玻片微孔中，从而捕获单个病毒颗粒，并在后续处理过程中减少基因组剪切。利用多重置换扩增（MDA）实现全基因组扩增，获得适用于测序的基因组材料。

单个微生物细胞的全基因组扩增与测序能够实现无需培养的基因组表征 1-3。病毒，其……

本实验的总体目标是从混合的病毒群落中分离单个病毒颗粒，并对获得的基因组材料进行测序，从而在无需培养的条件下鉴定来自多种环境中的病毒。该目标首先通过流式细胞分选技术将单个病毒颗粒分离并捕获到琼脂糖微珠上实现，随后利用共聚焦显微镜验证单个病毒颗粒的捕获情况。接下来，从病毒颗粒中分离基因组物质，并通过多重置换扩增（MDA）技术扩增DNA，以获得测序所需的足够量DNA。最后，利用高通量测序技术对病毒DNA进行测序，从而获得病毒基因组的深度覆盖，显著促进基因组的组装与注释。最终，通过采用序列子抽样策略以增加重叠群（contig）长度的生物信息学方法，可实现对分离病毒颗粒的分析。该方法可通过为大量未注释的病毒浮游生物基因提供基因组背景，帮助解答病毒生态学领域的关键问题，同时能够从多种生态系统中发现新的基因组。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为单个病毒粒子的扩增与分离已接近当前技术的极限。我们最初提出该方法的设想，是在评估多重置换扩增（MDA）技术用于病毒浮游生物群落研究时，意识到有可能对单个病毒颗粒进行分选并测序，从而从这些复杂的群落中组装出完整的病毒基因组。使用配备定制前向散射光电倍增管（FSCPMT）的流式细胞仪对病毒进行分选。首先将病毒颗粒悬浮于0.1微米过滤的Tris-EDTA缓冲液中。对于含有T4和λ噬菌体颗粒的混合样品，将FSCPMT设为1000，侧向散射光（SSC）设为200，以最大化信噪比。运行对照样品后，将约100微升染色后的病毒悬液上样，总计获取5,000个事件。然后利用SYBR Green I与FSC-PMT图在病毒颗粒中心设置一个严密的门控。接着，向聚四氟乙烯（P-T-F-E）载玻片的每个孔中加入5微升已冷却至37摄氏度的含1%低熔点琼脂糖的TBE缓冲液，随后将载玻片装入流式细胞仪，以捕获分选后的病毒颗粒。开始分选，在部分孔中捕获10个或更多病毒颗粒事件，以帮助在共聚焦激光扫描显微镜下检测病毒的深度。分选完成后，将载玻片从流式细胞仪中取出，并向每孔中加入5微升已冷却至37摄氏度的低熔点琼脂糖，以包埋病毒颗粒。对于单个病毒颗粒，将共聚焦激光扫描显微镜设置为488纳米激发波长。然后使用63倍长工作距离物镜对包埋的颗粒进行成像，以确认仅存在单个颗粒且多个病毒颗粒未重叠堆积。在确定含有单个病毒颗粒的孔后，使用刀片将目标琼脂糖珠从载玻片上切下，并放入无菌PCR管中。将离心管置于设定为 94 摄氏度的 PCR 仪热块中，加热 3 分钟，以原位裂解病毒颗粒。随后进行改良的 MDA 反应，将扩增的基因组 DNA 转移至 1.7 毫升的 Eppendorf 管中，并加入 1/10 体积的 3 摩尔醋酸钠（溶于 TBE 缓冲液），以纯化扩增的基因组物质。将样品置于 55 摄氏度下 10 分钟，以溶解琼脂糖，然后将离心管转移至 42 摄氏度，降低温度后再加入酶。现在向每管中加入 2 单位的 β-琼脂糖酶，并孵育 2 小时。然后向每支试管中加入等体积的缓冲饱和酚溶液。充分混匀后，在室温下以3,500 × g离心15分钟。将含有DNA的上清液转移至新的1.7毫升Eppendorf管中。接着，向每管中加入等体积的100%异丙醇和1微升甘油蓝（glyco-blue），倒置混匀。再次离心，此次在4°C、28,000 × g条件下离心60分钟，小心倾去异丙醇，避免扰动沉淀，并向每管中加入150微升70%乙醇。在室温下以28,000 × g离心10分钟，弃去乙醇，将DNA沉淀空气干燥，然后用适量体积的Tris-EDTA缓冲液重悬DNA。该三维重建图像显示了琼脂糖微珠内经SYBR Green I染色的单个病毒颗粒，展示了共聚焦激光扫描显微镜如何用于可视化并确认在捕获后嵌入琼脂糖的每个微孔中均获得了单个病毒粒子，插图为分离的病毒颗粒的高倍放大图像。此处显示了琼脂糖微珠内染色的单个病毒颗粒的相对荧光强度轮廓图。本组最后一系列图示表明，对于该代表性病毒，除前五个碱基对外，几乎整个λ基因组均被成功回收。此处展示了所鉴定的单个病毒基因组的GC含量图。该图显示了λ噬菌体的基因组图谱。最后，展示了代表性分离并扩增的λ噬菌体单个病毒基因组的比对结果。X轴表示基因组位置，Y轴表示覆盖百分比。在进行该实验操作时，重要的是采用无菌技术，并花费足够时间确保避免污染。完成此操作后，可采用其他方法在全基因组测序前评估所分离病毒颗粒的分类学特征。观看本视频后，您应能够清楚掌握如何利用荧光激活细胞分选、共聚焦显微镜和全基因组扩增技术来分离单个病毒颗粒。

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