使用"单个病毒基因组的单病毒颗粒的分离和基因组分析'
2013年5月26日
单一的病毒基因组（SVG）是一种方法来隔离和放大的基因组单virons。病毒悬浮液的混合组合，用流式细胞仪检测到载玻片离散井含琼脂糖，从而捕获病毒粒子和减少下游加工过程中的基因组剪切排序。全基因组扩增是通过使用多重置换扩增（MDA）的产生，是适合用于测序的基因组物质中。
该程序的总体目标是从混合联盟中分离单个 varian，并对获得的基因组材料进行测序，以识别来自各种环境的病毒，而无需培养。这是通过首先使用 Flow 的细胞术分选对 aro 微珠分离单个 varian 来实现的。然后通过共聚焦显微镜验证单离子捕获。
接下来，从离子中分离基因组材料，并使用多重置换扩增或 MDA 进行扩增，以产生测序所需的 DNA 量。最后，使用高通量技术对病毒 DNA 进行测序，以产生病毒粒子基因组的过度覆盖，这极大地有助于基因组组装和注释。最终，旨在使用序列子采样方法增加 con 大小的生物信息学技术允许分析孤立的 vons。
这种方法可以通过为大量注释的 OC 浮游生物基因提供基因组背景来帮助回答病毒生态学领域的关键问题，并能够从不同的生态系统中发现新的基因组。通常，不熟悉这种方法的人可能会遇到困难，因为单离子的扩增和分离正在突破当前技术的极限。当我们评估 MDA 在 Vero 浮游生物群落上的使用时，我们首先想到了这种方法，并意识到可以对单个病毒颗粒和序列进行分类，从而从这些复杂群落中组装完整的病毒基因组要使用配备定制前向散射光电倍增管或 F-S-C-P-M-T 的流式细胞仪对病毒进行分类，首先将病毒颗粒稀释在 0.1 微米过滤的 tri 中， 对于包含 T 4 和 lambda 噬菌体颗粒的混合组合，EDTA 将 F-S-C-P-M-T 设置为 1000，将 SSC 设置为 200，以最大限度地提高信噪比。
运行对照样品后，运行约 100 微升持续病毒悬浮液，总共 5， 000 个事件。然后使用 cyber green 和 F-S-C-P-M-T 图在病毒颗粒的中心放置一个紧密的门。现在将 5 微升 1% 低熔点 aros 加入冷却至 37 摄氏度的 TBE 缓冲液中，放入 A-P-T-F-E 显微镜载玻片上的每个孔中，然后将载玻片加载到流式细胞仪中以捕获分选的病毒颗粒。
开始分选，在一些孔中捕获 10 个或更多病毒颗粒事件，以帮助在共聚焦激光扫描显微镜期间检测病毒深度。分选完成后，从流式细胞仪中取出载玻片，并向每个孔中再添加 5 微升冷却至 37 摄氏度的低熔点 aros。包埋单个变体的病毒颗粒。
将共聚焦激光扫描显微镜设置为 488 纳米。然后使用 63 x 长工作距离物镜对包埋的颗粒进行激发成像，以验证仅存在单个颗粒，并且多个病毒没有相互堆叠。然后，一旦鉴定出具有单个病毒的孔，使用剃须刀片从载玻片上去除所需的 agros 珠子，并将它们放入无菌 PCR 管中。
将试管放入设置为 94 摄氏度的热循环仪的加热块中 3 分钟，以原位虱子病毒颗粒。然后，在进行修饰的 MDA 后，将基因组 DNA 转移到 1.7 mL 浓度管中，并在 TBE 缓冲液中加入十分之一体积的 3 摩尔乙酸钠要纯化扩增的基因组材料，请将样品在 55 摄氏度下放置 10 分钟以溶解 aros，然后将试管移至 42 摄氏度以降低温度，然后再添加酶。现在向每个试管中加入两个单位的 β aase 并孵育试管 2 小时。
然后向每个试管中加入一体积的缓冲饱和苯酚溶液。剧烈混匀，并在室温下以 3， 500 倍离心 15 分钟 G.At 将含有 SUPERNATANTS 的 DNA 转移到新的 1.7 mL einor 管中。接下来，向试管中加入 1 体积的 100% 异丙醇和 1 微升糖蓝，并在再次离心试管后倒置试管以混合。
这次在 28， 000 倍 G 和 4 摄氏度下持续 60 分钟。倒出异丙醇，确保不要干扰沉淀，并向每个试管中加入 150 微升 70% 乙醇。以 28， 000 次的速度旋转试管 10 分钟。
G 在室温下。倒出乙醇风干，DNA 沉淀，并将 DNA 重悬于适当体积的 tris EDTA 缓冲液中。这种在农业速度内对网络绿色、一个染色病毒颗粒的三维重建展示了如何使用共聚焦激光显微镜来可视化和确认在捕获并嵌入 aros 后在每个孔中获得单个病毒粒子，插图显示分离的病毒颗粒的放大倍数更高。
这里显示了 aros 珠子内染色的单个病毒颗粒的相对荧光的剖面图。这最后的一系列数字显示了除了前五个碱基对之外，几乎所有的 Lambda 基因组是如何为这种代表性病毒恢复的。这是单个病毒的 GC 图。
显示已鉴定的基因组。此图显示了 lambda 的基因组图谱。最后，显示了代表性分离和扩增的细菌噬菌体 lambda 的单个病毒基因组的定位。
X 轴显示基因组位置。Y 轴显示覆盖率百分比。尝试此程序时，请务必使用无菌技术并花时间确保避免污染。
按照此程序，可以使用其他方法在全基因组测序之前评估分离的 varian 的分类学。观看本视频后，您应该对如何使用荧光激活细胞分选、共聚焦显微镜和全基因组扩增分离单个可变细胞有一个很好的了解。
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概述
单病毒基因组学（SVG）是一种旨在从混合病毒悬浮液中分离和扩增单个病毒粒子基因组的方法。该技术使用流式细胞术进行分类，并利用多重置换扩增（MDA）进行全基因组扩增，便于随后的测序。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 基因组学
- 微生物学
背景
- 分离单个病毒粒子允许在不培养的情况下研究病毒基因组。
- 流式细胞术用于将病毒粒子分类到琼脂珠上。
- 共聚焦显微镜验证了单个病毒粒子的捕获。
- 高通量测序技术用于基因组分析。
研究目的
- 从混合群体中分离单个病毒粒子。
- 对基因组材料进行测序以识别病毒。
- 通过生物信息学增强基因组组装和注释。
使用的方法
- 病毒悬浮液的流式细胞术分类。
- 从捕获的病毒粒子中分离基因组材料。
- 用于DNA扩增的多重置换扩增（MDA）。
- 用于全面基因组覆盖的高通量测序。
主要结果
- 成功从混合样本中分离单个病毒粒子。
- 通过MDA生成足够的DNA用于测序。
- 高覆盖率测序有助于基因组组装。
- 应用生物信息学技术进行数据分析。
结论
- SVG对于研究多样环境中的病毒基因组是有效的。
- 该方法在处理过程中减少了基因组剪切。
- 生物信息学增强了分离病毒粒子的分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single Virus Genomics (SVG) enables cultivation-free genomic characterization of individual virions, addressing a critical gap in viral ecology and discovery pipelines. By isolating and amplifying single viral genomes from complex mixtures, SVG supports target de-risking and predictive confidence in early-stage antiviral and phage therapy research. This method enhances portfolio relevance by providing high-resolution genomic data from unculturable viruses, informing mechanistic studies and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral hypotheses by providing genomic context to individual virions from mixed environmental samples.
- Operational Value: Supports biological de-risking through cultivation-free isolation, reducing false negatives in target identification.
- Predictive Value: Generates high-coverage sequencing data that aids in genome assembly and annotation, improving confidence in viral target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-molecular-weight genomic DNA via MDA, enabling reliable downstream sequencing and comparative analysis.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through flow cytometry-based sorting and confocal validation, ensuring reproducible single-virion capture.
- Scalability: Allows processing of thousands of events via flow cytometry, supporting high-throughput screening of viral diversity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viral genome data to preclinical validation by enabling sequence-based taxonomy and functional inference.
- Biomarker Alignment: Supports identification of viral genomic signatures that may correlate with pathogenic potential or host interaction profiles.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in viral target selection through direct genomic evidence.
Pipeline & Workflow Integration
SVG fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and target validation prior to lead identification and preclinical evaluation. Its output—amplified, sequencable viral DNA—directly enables genomic screening and comparative analytics workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating single virons for genomic interrogation, clarifying viral diversity and functional potential in complex communities.
- Screening: Enables assay standardization through flow sorting and MDA amplification, providing reproducible inputs for sequencing-based screening platforms.
- Analytics: Generates quantitative genomic outputs (coverage, GC content, genome maps) that allow cross-condition comparison and variant calling.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing genome-resolved data that can inform biomarker development and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for viral genome characterization across diverse ecosystems, reducing reliance on cultivation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in viral target validation by delivering cultivation-free, genome-resolved data from single particles.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through validated single-virion capture via flow cytometry and confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of viral targets, reducing investment in non-viable or poorly characterized candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering high-confidence genomic data that informs advancement decisions in antiviral and phage-derived therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, confocal microscopy, and molecular biology for single-particle handling and amplification.
- Dependent on access to flow cytometers with custom scatter detection and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation, contamination control, and bioinformatic analysis across teams.
- Must account for variability in viral size, density, and staining efficiency when adapting to diverse viral systems or environmental samples.
- Practical limitations include amplification bias and stochastic sampling effects inherent to single-cell/single-virion MDA approaches.
