利用GST标记的突变型Rho蛋白（GST-RhoA(G17A)）从上皮细胞裂解液中亲和沉淀活性Rho-GEFs

本实验的总体目标是利用一种对激活态 G 蛋白具有高亲和力的突变型 RO A GST 融合蛋白，通过培养细胞来追踪特定的 G 蛋白-鸟苷酸交换因子（GAFs）的活化过程。该目标首先通过在细菌中表达带有 GST 标签的突变型 RO 蛋白来实现，随后对偶联在磁珠上的 GST-RO A 蛋白进行纯化。

然后通过 SDS-PAGE 分析评估 GST RO A 蛋白的纯度和浓度。最后制备细胞裂解液，并利用 GST RO A 蛋白进行 GEF 沉淀实验。最终可通过 Western 印迹法对沉淀蛋白使用特异性抗 GF 抗体进行检测，并通过密度测定法进行定量，获得结果显示经处理的细胞中活化的 GS 沉淀量增加。

该方法有助于回答原始 GTPS 领域中一些令人关注的问题，例如众多的 Rho G-D-P-G-T-P 交换因子是如何以信号特异性方式被调控的，以及它们的活性如何协调？通常，初次接触该方法的研究者在初期会遇到困难，因为 GST RO G 17 A 蛋白相对不稳定，在制备过程中容易降解。此外，务必记住要快速且一致地进行 GF 沉淀实验。本实验操作将由我实验室的硕士研究生 Pfizer Vahid 演示。用于转化大肠杆菌。

迅速将一管 DH5α 感受态细胞置于冰浴中，加入 1 微升浓度为 25 至 50 纳克/微升的 PX row A G17A DNA。轻弹管壁混匀，冰上孵育 30 分钟。42 摄氏度热激 45 秒，然后放回冰上放置 2 分钟。

加入 900 µL 培养基，在 37 °C 下振荡培养 1 小时。使用无菌弯头塑料移液管将 50 至 100 µL 转化后的细菌均匀涂布于预先制备好的 LB 琼脂和 persin 平板上。将平板正置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟，随后倒置并过夜培养。

挑选一个分离良好的转化细菌单菌落，用其接种含有氨苄青霉素的50毫升LB培养基。在37摄氏度下振荡培养过夜。当菌液达到完全密度时，用450毫升含氨苄青霉素的LB培养基稀释，并继续培养30分钟。在37摄氏度条件下，向500毫升菌液中加入500微升100毫摩尔的IPTG，诱导细菌表达目的蛋白。

将温度降至22至24摄氏度，培养约16小时。在4摄氏度下以3,600 ×g离心10分钟。将沉淀物在-80摄氏度下冷冻至少1小时，或最好过夜。

按照书面实验方案配制 200 毫升裂解缓冲液后，通过在 10 毫升裂解缓冲液中添加 1 毫摩尔 DTT、1 毫摩尔 PMSF 和一片蛋白酶抑制剂片剂，在冰上制备裂解缓冲液增强液。向 Thor 沉淀物中加入 10 毫升裂解缓冲液增强液，通过移液和涡旋充分混匀。将悬浮液在冰上超声处理 1 分钟，设置为 4 档，脉冲占空比 50%。

将超声裂解液在4°C下以15,000至20,000 × g离心15分钟，然后将澄清的上清液转移至一个无菌带盖的15毫升离心管中。通过轻轻混匀75%悬液，并使用宽口吸头转移335 µL至一个15毫升离心管中，以制备谷胱甘肽琼脂糖珠。加入10 mL冷PBS缓冲液，在4°C下以500 × g离心5分钟。

弃去上清液。向珠子中加入 1 毫升裂解缓冲液 plus，再次离心。再次弃去上清液，并加入裂解缓冲液。

此外，为制备50%的悬浮液，将两份各50 µL的平衡化珠悬浮液与制备好的上清液混合。在4°C下旋转孵育45分钟。通过向100 mL HBS缓冲液中添加5 mmol/L氯化镁和1 mmol/L DTT来配制HBS plus缓冲液。在4°C、500 × g条件下离心上清液和珠子5分钟。

弃去上清液，用 10 毫升裂解缓冲液（含添加剂）洗涤磁珠两次，再用 10 毫升 HBS 缓冲液（含添加剂）洗涤两次。最后一次洗涤后，加入含蛋白酶抑制剂的 HBS 缓冲液（含添加剂）重悬磁珠，制成 50% 的悬液。取 10 微升最终磁珠悬液，加入两倍体积的含 β-巯基乙醇的上样缓冲液进行稀释。

然后通过混合10微升、5微升和2.5微升的2毫克/毫升BSA储备液与10微升拉米缓冲液，制备三种BSA标准样品。

将样品煮沸5分钟，然后短暂离心，并在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上与分子量标记物一起电泳。染色并脱色后，以BSA标准品为参考，估计GST-Row A G17A的分子量。取含有约10至15微克蛋白的等体积珠子，分装到1.5毫升微量离心管中。为进行GF下拉实验，将待用细胞在10厘米培养皿中培养至融合，并在实验前至少进行3小时的无血清饥饿处理。

在开始实验前，准备好含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，并置于冰上操作。从培养皿中移除培养基，并用冰预冷的HBS洗涤。

移除所有 HBS，向每个培养皿中加入 700 微升裂解缓冲液。轻摇培养板，确保液体覆盖所有区域。

然后刮取并收集裂解液至编号的1.5毫升离心管中。在4°C条件下，以15,000 ×g离心1分钟。若每孔细胞数量相等，则保留上清液用于后续检测；取30微升上清液，与30微升2倍还原性Laemmli样品缓冲液混合。

然后煮沸，并置于冰上备用。将剩余的上清液加入到 GST 树脂（G 17 A beads）的等分试样中，4 °C 旋转孵育 45 分钟。在 4 °C 条件下，以 6,800 ×g 离心 10 秒收集树脂珠。

弃去上清液，用裂解缓冲液洗涤磁珠三次。使用配有30号针头的1毫升注射器彻底吸除最后一次洗涤液，加入20 µL的2×还原型Laemmli上样缓冲液。将样品煮沸5分钟，离心使磁珠沉淀，随后根据所研究的GF蛋白大小，将全细胞裂解液和沉淀的蛋白样品上样至相应浓度的SDS-PAGE凝胶进行电泳分析。

最后，进行蛋白质印迹以检测相关的GFA，从而成功完成GF检测。此处展示的是交换因子GFH1激活的检测结果。A组G17A蛋白从对照细胞裂解液中捕获到部分GFH1，表明GFH1具有基础活性。

然而，在用炎性细胞因子肿瘤坏死因子α处理的细胞中，沉淀量增加，这与TNFα可激活G FH 1的观点一致。重要的是，总细胞裂解液显示对照组和处理组样品中的G FH 1含量相似，表明处理并未改变G FH 1的水平，且实验中所用的输入量是相等的。在进行此操作时，必须将GSE RO G 17 A蛋白和CELLIS eights保持在冰上。

快速且一致地进行GF检测，并使用适当的阳性对照，以便进行结果无效化判断和故障排查。