Name: 内皮化微流体研究在血液病的微血管相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学习利用微流控装置培养内皮细胞单层，用于研究血液病中的细胞间相互作用。该方法可精确控制生物物理条件，适用于荧光显微镜观察，为血液学研究提供可靠的体外模型平台。

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感谢 T. Hunt、M. Rosenbluth 以及 Lam 实验室提供的建议和有益讨论。感谢佐治亚理工学院电子与纳米技术研究所的 G. Spinner 和该研究所提供的支持。本研究的经费由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 K08-HL093360、加州大学旧金山分校（UCSF）REAC 奖项、NIH 纳米医学发展中心奖项 PN2EY018244，以及亚特兰大儿童保健中心内皮细胞生物学中心的资助提供支持。

1. 内皮微装置的制备
<ol>
 <li>通过将微流控装置的计算机辅助设计（CAD）图纸提交给外部掩膜供应商，制作光掩膜。所使用的掩膜由镀在钠钙玻璃上的铬层构成。本例中，微流控通道宽度为 30 μm。</li>
 <li>用piranha溶液（浓硫酸与过氧化氢按10:1比例混合）清洗空白硅片15分钟，随后浸入氢氟酸中30秒，再用去离子水（DI水）冲洗约10秒。</li>
 <li>使用旋涂仪将Microchem SU-8 2025光刻胶旋涂于硅片上，厚度达到30 μm。对于SU-8 2025，推荐旋涂速度为3000 rpm。也可选用其他黏度的SU-8材料以达到该厚度。SU-8使用的完整说明可访问 <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> 获取。</li>
 <li>将涂有SU-8的硅片置于95 °C的加热板上加热5分钟，以去除多余的溶剂。 
 注意：使用烘箱干燥硅片的方式与加热板不同，不推荐使用。</li>
 <li>将具有所需图形结构的掩膜覆盖在硅片上，在掩膜对准仪（Karl Suss, MA-6）中用紫外光照射（在365 nm处测量为160 mJ/cm2 ），使光刻胶发生交联。</li>
 <li>将硅片再次放回95 °C加热板上，继续加热5分钟，以进一步促进SU-8的聚合反应。</li>
 <li>将硅片浸入主要成分为PGMEA（丙二醇甲醚醋酸酯）的SU-8显影液中4分钟，以去除未交联的SU-8部分。</li>
 <li>用100%异丙醇（IPA）冲洗新显影的硅片10秒。随后可通过加压氮气吹干，或在洁净通风橱中静置数分钟，使溶剂自然挥发干燥。</li>
 <li>将带有图案化SU-8结构的干燥硅片用胶带固定于培养皿边缘，防止移动。</li>
 <li>用移液器取1 mL Sigmacote试剂滴加到硅片表面，用培养皿盖盖住，轻轻旋转硅片以确保表面完全覆盖；然后移去盖子，静置数分钟，直至所有溶剂完全挥发，硅片干燥。</li>
</ol>
2. PDMS（聚二甲基硅氧烷）制备
<ol>
 <li>按10:1（w/w）的比例混合PDMS聚合物与固化剂，并使用真空干燥器去除气泡。脱气所需时间取决于所用真空系统的强度，通常为几分钟至一小时。对于直径六英寸且未预先倒入PDMS的培养皿，建议使用总体积为60 mL的聚合物。</li>
 <li>将混合物倒入硅片上，厚度约为5 mm。同时将混合物倒入平底培养皿中，制成厚度约为1 mm的PDMS薄片。在60 °C烘箱中过夜固化。</li>
 <li>使用刀片或解剖刀沿固化后的PDMS器件边缘切割，并将其从硅片上取下。另外，裁剪一块略大于该器件的PDMS薄片。</li>
 <li>使用1.0 mm打孔器在PDMS器件上制作进样口和出样口孔洞。可使用手摇钻、Harris Uni-Core或类似工具完成此操作。</li>
 <li>使用透明胶带清洁器件表面和薄片表面。</li>
 <li>使用等离子清洗仪将PDMS器件和PDMS薄片的表面暴露于氧气等离子体中处理30秒。氧气等离子体在PDMS暴露表面产生反应性基团，当两表面接触时可形成化学键合。</li>
 <li>将细管连接至一段较短（数厘米）的粗管，再将粗管连接至装有钝头针头的注射器，注射器内充满含50 μg/mL人血浆纤维连接蛋白的PBS溶液。选择合适尺寸的管路和针头，使管路之间形成紧密的摩擦配合。将细管插入PDMS微装置的进样口，推动注射器使纤维连接蛋白溶液完全填充通道，并在出口端形成约100 μL的小液滴，以确保通道保持湿润。将装置在37 °C孵育40–60分钟。</li>
 <li>将装有PBS的新鲜注射器连接至钝头针。推动注射器，用PBS冲洗装置。</li>
</ol>
3. 用内皮细胞接种微流控装置
<ol>
 <li>在含有8%葡聚糖的内皮细胞生长培养基中制备浓度为1,000,000个细胞/mL的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。已有成功应用的细胞浓度范围为500,000至2,000,000个细胞/mL。在细胞接种培养基中添加葡聚糖可增加液体黏度，从而降低内皮细胞进入纤连蛋白包被的微流控系统时的流速。这有助于提高细胞在微装置内黏附并成功培养的可能性。</li>
 <li>连接新的注射器和管路，操作同步骤2.7，但使用更长的管路（长度约1米）。</li>
 <li>为优化该系统的性能，此时必须确保整个灌注系统无泄漏或气泡；任何溶液泄漏或培养基中存在气泡均会改变流体流动，从而阻碍内皮细胞的成功接种。因此，管路连接处必须紧密贴合，以杜绝任何接口处的泄漏。在将细胞引入微装置之前，必须排除注射器和/或管路中的气泡，并在将管路连接至微流控装置前，先用细胞悬液充分预灌整个灌注系统，以避免引入空气气泡。</li>
 <li>使用注射泵，在37 °C和5% CO2条件下，以1.23 μl/min的体积流速将细胞悬液注入PDMS装置，持续2小时。当注射泵与PDMS装置处于相同高度时，可获得最佳效果。对于进样端，较长的管路可在培养箱内盘绕，确保细胞和培养基在接触装置前充分预热。在本系统中，1.23 μl/min的体积流速在最小的微通道中近似产生约1 mm/s的中流速度，若使用全血，则对应这些通道中的管壁剪切应力约为1 dyne/cm2。</li>
 <li>使用相同的注射泵和长管路，以1.23 μl/min的流速持续灌注新鲜生长培养基2至8天。成功的装置通常在24至48小时内即可在装置内壁形成单层生长的内皮细胞。先前的实验表明，融合的单层细胞在整个装置的细胞间连接处可适当地表达VE-钙黏蛋白14。</li>
 <li>向系统中注入血液或细胞悬液以进行实验。</li>
</ol>
4. 代表性结果
采用本方案，使用标准的光刻微加工技术制备用于生成微流控通道的模具，该通道在生理尺度上模拟微血管的尺寸（图1A）。通过优化的灌注技术，内皮细胞在接种后24–48小时内即可在微流控系统的整个内表面贴壁并形成融合单层（图1B）。由于微流控系统具有透明性，整个微装置可直接置于明场/荧光显微镜载物台上进行成像和数据采集。
我们的系统可用于研究涉及生物物理特性改变的血液系统疾病，例如镰状细胞病，其中镰变红细胞的刚性增加以及白细胞和内皮细胞的异常黏附共同导致微血管阻塞。一种临床批准的药物羟基脲可缓解症状，但其对微血管血流的直接作用尚不清楚。我们的检测方法同时考虑了细胞刚性和黏附特性，结果表明羟基脲能显著改善镰状细胞病中的血流（图2）。
镰状细胞病只是微血管芯片技术应用的一个例子，该系统非常适合研究血液细胞在微血管中相互之间以及与内皮细胞相互作用的任何血液学过程。其他具有临床相关性的应用包括炎症性疾病、脓毒症/肺损伤、血栓性微血管病、疟疾和癌症转移，而更基础的应用则包括白细胞生物学和造血干细胞生物学等众多领域。
<img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="微流控芯片实验；A：带连接器的装置；B：放大后的通道视图，比例尺为 30 μm。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. A) 内皮化前的初始 PDMS 微流控装置。此处向微装置中注入食用色素，以展示系统的尺寸比例和整体设计。B) 明场显微镜显示，采用本方案接种细胞后 48 小时内，微流控系统已完全实现内皮化。
<img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="用于细胞培养的微流控装置示意图，包含荧光和灰度成像；细胞观察。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. A) 带有微通道的“芯片上微血管系统”近似于后微静脉（30 μm）的尺寸，后者是镰状细胞病微血管阻塞事件最常见的发生部位。来自接受羟基脲治疗和未接受羟基脲治疗的镰状细胞病患者的全血分别流经两个不同的“芯片上微血管系统”装置。B) 来自接受羟基脲治疗的镰状细胞病患者的全血在内皮化微通道中流动较为顺畅。C) 在相同的血流动力学条件下，来自未接受羟基脲治疗的镰状细胞病患者的全血则表现出明显迟缓的流动，并伴有微通道阻塞。底部通道完全阻塞，无血液流动，而其他内皮化微通道中的流速也显著低于接受羟基脲治疗的情况。三幅图像中的比例尺均为 30 μm。

<ol><li>Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Level+of+Laboratory+Testing+Required+for+Diagnosis+or+Exclusion+of+a+Platelet+Function+Disorder+Using+Platelet+Aggregation+and+Secretion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays.</a> Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

我们的内皮化微装置系统最适合与体内实验联合使用，其简化论方法有助于阐明在人类和动物模型中观察到的血液学过程的生物物理机制。此外，本系统也存在一定的局限性。例如，我们的微流控通道横截面为方形。尽管技术上可以制备出圆形微通道10,11，但我们选择采用更为简化和标准化的制备工艺，以便其他研究人员能够便捷地将该系统应用于他们自己的研究中。此外，培养的内皮细胞的存在自然地“填补”了有效管腔的角落，使系统更接近生理状态。进一步地，我们的流体动力学建模表明，本系统中的流动条件与体内微血管系统中的流动条件相当。最后，近期针对血液在方形和矩形微通道中流动特性的研究表明，这些几何结构适用于血液流变学实验15。
最后，我们的检测方法并非旨在单独测量导致微血管阻塞的特定细胞生物物理特性。对于此类实验，原子力显微镜、微吸管抽吸和光镊等技术已有充分表征。相反，我们微系统的优势在于能够在一个单一系统中同时重现 体外 系统，由一系列生理过程和生物物理特性组成，包括黏附分子表达、异常的血细胞-内皮细胞相互作用、血细胞聚...

<table><tbody><tr><td>钝头针头</td><td>OK International</td><td>920050-TE</td><td>Precision TE 针头 20 号 × 1/2&quot;，粉色</td></tr><tr><td>葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>纤维连接蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>打孔器（手摇钻）</td><td>Technical Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVECs）</td><td>Lonza</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Plasma</td><td>PDC-326</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Sylgard 184 硅酮弹性体套件</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>Microchem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3008</td><td>PHD-ULTRA</td></tr><tr><td>导管（较粗）</td><td>Cole-Parmer Instrument Company</td><td>06418-02</td><td>Tygon® 微孔导管，内径 0.020&quot; × 外径 0.060&quot;</td></tr><tr><td>导管（较细）</td><td>Cole-Parmer Instrument Company</td><td>06417-11</td><td>PTFE 微孔导管，内径 0.012&quot; × 外径 0.030&quot;</td></tr></tbody></table>

用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

微加工技术的进步使得能够低成本且可重复地制造用于在微米和纳米尺度下进行生物及生化实验的微流控系统1,2。此外，由于微流控技术能够便捷地调控动态流体环境和生物学条件，它已被专门用于定量分析血液学和微血管过程3-6。因此，研究人员最近利用微流控系统研究了血细胞变形性、血细胞聚集、微血管血流以及血细胞与内皮细胞之间的相互作用6-13。然而，这些微流控系统要么未包含培养的内皮细胞，要么其尺寸大于与微血管病理过程相关的尺度。为了进一步理解涉及微血管系统的血液疾病中潜在的生物物理病理生理机制，亟需一种包含培养内皮细胞、并能准确模拟微循环中细胞、物理及血流动力学环境的微流控平台。
此处，我们报告一种构建“内皮化”的方法 体外 利用一种简单的单掩模微加工工艺，结合标准的内皮细胞培养技术，构建微血管系统的模型，用于研究血液疾病中发生的病理学微血管生物物理相互作用。该“芯片上的微血管系统”为研究人员提供了一种可靠的检测方法，可精确控制生物学及生物物理条件，并可通过标准的注射泵和明场/荧光显微镜进行操作。微循环血流动力学条件、内皮细胞类型、血细胞类型及浓度、药物/抑制剂浓度等参数均可轻松调控。因此，本微系统提供了一种定量研究疾病过程的方法，可用于分析因细胞黏附性、聚集性和变形性改变而导致微血管血流受损的病理机制，这是现有检测方法所不具备的能力。

一种在具有微血管尺寸通道的微流控装置整个内部三维表面培养内皮细胞单层的方法&lt;30 μm）被描述。 这一 体外 微血管模型可用于研究血液疾病中血细胞、内皮细胞与可溶性因子之间的生物物理相互作用。

微加工技术的进步使得能够生产出低成本且可重复的微流控系统，用于开展生物学和……

本实验的总体目标是构建一种内皮细胞包被的微流控装置。首先通过制备微流控模具来实现这一目标，第二步是制备PDMS通道。接下来，将内皮细胞接种到装置中。最后一步是在装置内培养细胞。最终，包被有内皮细胞的微流控装置可用于体外展示细胞间的相互作用。与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对细胞的生物学和生物物理条件进行严格控制，并且兼容荧光显微镜观察。尽管该方法可为血液系统疾病的细胞间生物物理相互作用提供深入见解，但也可应用于白细胞生物学、癌症转移以及造血干细胞生物学等现象的研究。通常，初学者在使用该方法时会遇到困难，因为要实现细胞的有效贴附，必须对实验条件进行精确控制。在制备过程中，通过将微流控装置的计算机辅助设计图像提交给外部掩膜供应商，来制作光刻掩膜。收到掩膜后，可见其由覆盖在钠钙玻璃上的铬层构成。此处微流控通道的宽度为 30 µm。开始制造微流控装置时，先用食人鱼溶液清洗一片裸硅晶圆15分钟，然后用去离子水冲洗10秒。接着将硅晶圆浸入氢氟酸中30秒，并用去离子水冲洗约10秒。接下来，使用匀胶机将SU-8 2025光刻胶以每分钟3000转的转速旋涂到晶圆上，厚度达到30微米。将涂有 SU 8 20 25 的晶圆放置于设定为 95 摄氏度的热板上加热五分钟，以驱除过量溶剂。此步骤不建议使用烘箱。接着，将光刻掩膜置于晶圆上方，在掩膜对准器中用紫外光照射，使 SU 8 20 25 光刻胶发生交联反应。交联后，将晶圆放回95 °C的热板上再加热5分钟，以进一步促进SU 8 20 25光刻胶的聚合。随后将晶圆浸入SU 8显影液中，该显影液主要成分为P-G-M-E-A，浸泡4分钟。这将去除未交联的 SU 8 20 25 光刻胶。用 100% 异丙醇冲洗新显影的晶圆 10 秒，然后使用加压氮气吹干，或在洁净通风橱中让溶剂在晶圆表面挥发数分钟。接着，将干燥后的晶圆用胶带固定在培养皿中央，注意将胶带贴在晶圆边缘处。最后，用移液枪吸取500微升sigma涂层液滴加到晶圆片上。用培养皿盖盖住培养皿，然后轻轻旋转培养皿，以确保晶圆片表面完全被覆盖。移去盖子，静置数分钟，使溶剂完全挥发，晶圆片干燥。将PDMS聚合物与固化剂按10:1的质量比混合后，根据所用真空系统的强度，将混合物置于真空干燥器中抽气数分钟至一小时，以去除其中的气泡。待所有气泡完全去除后，将混合物倒入培养皿中，确保硅片及培养皿表面均被覆盖，以制备厚度约为5毫米的PDMS薄膜。另制备一块厚度为一毫米的薄而无特征的PDMS片。然后将混合物置于60摄氏度的烘箱中固化过夜。次日，使用刀片或手术刀沿晶圆边缘切割，取出多个PDMS微流控装置。然后裁剪该片材以分离出单个装置。将PDMS片材裁剪得比微流控装置略大。现在使用针柄钻头（如Harris独角兽钻或其他类似工具）在微流控装置上打出入液口和出液口的孔。接下来，使用透明胶带清洁微流控

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Bioengineering

生物工程

内皮化微流体研究在血液病的微血管相互作用

本文介绍一种将人脐带血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）和骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）包埋于胶原蛋白/纤连蛋白凝胶中，皮下植入免疫缺陷小鼠的方法。该细胞与凝胶的组合可形成功能性人源血管网络，并与小鼠的脉管系统相连接。...

在免疫缺陷小鼠中构建人类微血管网络的生物工程方法

采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。...

芯片上内皮炎症表型分析

一种微通道芯片平台通过结合光刻可重铸光刻胶技术、软光刻技术和微流控技术而开发。该内皮化微通道平台可模拟三维（3D）几何结构 体内...

多深度圆形截面血管内皮化微通道芯片的制备方法

采用血液重建和微流控流动腔模拟血小板输注与止血过程，以研究血液库保存血小板的功能。体外实验数据展示了血小板储存损伤对止血功能的影响。...

使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

将原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在微流控网络装置中培养至融合状态。展示了内皮细胞连接和F-肌动蛋白的分布，并在单细胞水平实时定量了对三磷酸腺苷（ATP）刺激响应的细胞内钙离子浓度变化和一氧化氮生成情况。...

发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca2+]i 和一氧化氮的产生

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。...

三维微血管的微图形化与组装

我们提出一种体外血管疾病模型，用于研究全血与患者来源内皮细胞的相互作用。该系统可在不同条件下研究原代内皮细胞的血栓形成特性。该方法特别适用于评估凝血不同阶段的原位血栓形成能力及抗凝治疗效果。...

用于实时研究全血-内皮相互作用与血凝块动态的体外微流控疾病模型

本文提供了一种微流控芯片及一种可自动控制、高效循环的微流控系统，可重现血管新生的初始微环境，使内皮细胞（ECs）同时受到高管腔剪切应力、生理水平的跨内皮流动以及不同分布的血管内皮生长因子（VEGF）的刺激。...

模拟新生血管化初始事件的微流控模型

在本方案中，采用了一种仿生微流控检测方法，该方法能够重现生理相关的微血管环境，并完整再现白细胞黏附/迁移级联过程，用于研究炎症疾病中的白细胞-内皮细胞相互作用。...

一种用于研究炎症过程中白细胞与内皮细胞相互作用的微生理系统

利用微流控装置可评估血小板在流动条件下的功能，并模拟止血复苏过程，该技术在创伤和输血医学中具有应用价值。...

微流控技术在血小板功能评估中的应用

在此，我们介绍一种用于构建和运行微流控系统的方案，该系统可使内皮细胞同时暴露于振荡性高血糖和脉动性剪切应力。该方法具有生理相关性...

一种用于模拟生理脉动剪切应力与振荡性高血糖共同作用下内皮功能障碍的微流控系统

学习利用微流控装置培养内皮细胞单层，用于研究血液病中的细胞间相互作用。该方法可精确控制生物物理条件，适用于荧光显微镜观察，为血液学研究提供可靠的体外模型平台。

用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

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