用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

本实验的总体目标是构建一种内皮细胞包被的微流控装置。首先通过制备微流控模具来实现这一目标，第二步是构建PDMS通道。

接下来，将内皮细胞接种到装置中。最后一步是在装置内培养细胞。最终，包被有内皮细胞的微流控装置可用于体外展示细胞间的相互作用。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对细胞的生物学和生物物理条件进行严格控制，并且兼容荧光显微镜检测。尽管该方法可用于研究血液系统疾病中的细胞间生物物理相互作用，也可应用于白细胞生物学、癌症转移以及造血干细胞生物学等现象的研究。通常，初学者在使用该方法时会遇到困难，因为细胞成功贴附需要对实验条件进行精确控制。

在制备过程中，通过将微流控装置的计算机辅助设计图像提交给外部掩膜供应商来制作光掩膜。收到后，该掩膜由覆盖在钠钙玻璃上的铬层构成。此处微流控通道的宽度为 30 微米。

开始制造微流控装置时，先用王水清洗一片裸露的硅晶圆15分钟，然后用去离子水冲洗10秒。接着将硅晶圆浸入氢氟酸中30秒，并用去离子水再次冲洗约10秒。随后，使用匀胶机以每分钟3000转的转速，将Micro Chem SU-8 2025光刻胶旋涂到晶圆上，使其厚度达到30微米。

将涂有 SU 8 20 25 的晶圆置于设定为 95 摄氏度的热板上加热 5 分钟，以去除多余的溶剂。此步骤不建议使用烘箱。随后，将光刻掩模覆盖在晶圆上，并在掩模对准器中用紫外光照射，使 SU 8 20 25 光刻胶发生交联。

交联后，将晶圆重新置于95摄氏度的热板上，继续加热五分钟，以进一步促进SU 8 20 25光刻胶的聚合。随后将晶圆浸入SU 8显影液中，该显影液主要成分为P-G-M-E-A，浸泡时间为四分钟。

这将去除未交联的 SU 8 20 25 光刻胶。用 100% 异丙醇冲洗新显影的晶圆 10 秒，然后使用加压氮气吹干，或在洁净的通风橱中让溶剂从晶圆表面挥发数分钟。现在，将干燥的晶圆用胶带固定在培养皿中央，注意将胶带贴在晶圆边缘。

最后，用移液器将500微升的Sigma涂层液滴加到晶圆上。用培养皿盖盖住培养皿，然后轻轻旋转培养皿，以确保晶圆表面完全被涂层覆盖。取下盖子，让晶圆静置数分钟，直至所有溶剂完全挥发。

将PDMS聚合物与固化剂按10:1的质量比混合后，根据现有真空系统的强度，使用真空干燥器脱除气泡，时间从几分钟到一小时不等。待所有气泡完全去除后，将混合物倒入培养皿中，确保硅片及培养皿表面均被覆盖，以制备厚度约为5毫米的PDMS薄膜。

同时制备一块厚度为一毫米的薄而无特征结构的PDMS片。然后将混合物置于60摄氏度的烘箱中固化过夜。次日，使用刀片或手术刀沿晶圆边缘切割，取下多个PDMS微流控装置。

然后裁剪该片材以分离单个装置。将PDMS片材裁剪得比微流控装置略大。现在使用针柄钻头（如Harris独角兽钻或其他类似工具）在微流控装置上打出入液口和出液口的孔。

接下来，使用透明胶带清洁微流控装置和片材的表面。然后使用等离子清洗机将微流控装置和PDMS片材的表面暴露于氧气等离子体中30秒。氧气等离子体在PDMS暴露表面产生反应性物质，当与物体表面直接接触时可形成化学键合。

接下来，用浓度为每毫升50微克的PBS中人血浆纤连蛋白填充一支配备20号钝头针头的1毫升注射器，然后将一段导管套在针头上。将一段较细的导管插入第一段导管中，使两段导管之间形成紧密的摩擦配合。

然后将较细的管子的另一端连接到微流控装置的入口。对注射器施加压力，使纤维连接蛋白溶液完全充满通道，并在出口端形成约100微升的小液滴，以确保通道保持湿润。现在，将微流控装置置于37摄氏度的加湿培养箱中孵育40至60分钟。

孵育结束后，将装有 PBS 的新注射器连接至钝头针上，施加压力以 PBS 冲洗微流控装置。在含有 8% 葡聚糖的内皮细胞生长培养基中，制备每毫升含 50 × 10⁴ 至 2 × 10⁶ 个人脐静脉内皮细胞（hve）的细胞悬液。

加入葡聚糖可提高细胞在微流控装置内黏附并成功培养的可能性。使用平头针头和较粗导管填充清洁注射器，其中装入细胞悬液，并连接一段长约一米的导管。必须确保导管连接紧密，以防止任何接口处发生泄漏。

用细胞溶液预润管路，确保注射器和管路中均无气泡，以优化系统性能。此时必须防止任何泄漏或气泡进入系统。若溶液发生泄漏或培养基中存在气泡，将导致内皮细胞无法成功贴壁。

当所有气泡均已排除，且整段管路均已被细胞悬液预充满后，将注射器置于泵上，并将另一端连接至微流控装置的进样口。注射泵应与微流控装置保持在同一高度。将较长的管路小心盘绕置于培养箱内，以确保细胞和培养基在进入装置前充分预热。

然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，以1.23微升/分钟的体积流速将细胞悬液注入微流控装置，持续两小时。在本系统中，1.23微升/分钟的体积流速对应最小通道中的中流速度为1毫米/秒。使用全血时，该流速在这些通道中产生的壁面剪切应力约为1达因/平方厘米。

细胞悬浮液灌注完成后，使用相同的注射泵和长管路，换用较大的注射器以每分钟1.23 µL的流速灌注新鲜培养基，持续两到八天。当细胞单层达到预期的融合度时，向系统中注入血液或细胞悬浮液以进行实验。此处所示为内皮化前的微流控装置。

已向微流控装置注入食用色素，以展示该装置的尺寸、比例及整体设计，该装置可模拟血管系统的生理结构。明场显微镜图像显示微流控装置的内皮化情况。此图像在按照所述方案接种后不到48小时采集，优化后的灌注技术可使内皮细胞在整个微流控系统内表面形成融合单层培养。

细胞接种后24至48小时内。如本共聚焦图像所示，带有微通道的芯片上微血管肿瘤接近毛细血管后微静脉的30微米大小，后者是镰状细胞微血管阻塞事件最常见的发生部位。在本实验中，来自健康患者的全血在去氧条件下被注入芯片装置中的微血管系统。

本视频显示，在我们的内皮微流控系统中，全血的流动规律、平滑且连续，微通道内无任何阻塞区域。在此，来自镰状细胞病患者的全血被注入芯片设备上的微血管结构中。在去氧条件下，血流出现显著变化，多个通道中出现完全性阻塞。

在进行该操作时，需注意更换管路时避免引入气泡。制备完成的装置适用于荧光显微镜观察，也可适配于传统的荧光检测方法。该技术为实验血液学研究者在可控的生物物理及血流动力学环境中开展单细胞实验提供了新的途径。

无气泡。