实时数字成像技术观察大鼠提睾肌缺血-再灌注损伤（IRI）中白细胞与内皮细胞的相互作用

活体显微观察CRE基质微循环是一种便捷的方法，可用于深入了解缺血及横纹肌组织再灌注损伤。我们通过逐步操作方案，详细描述了如何在动脉插管充分监测下，实施呼吸控制麻醉，以确保动物在较长时间内保持稳定麻醉状态。我们展示了如何进行颈静脉插管，随后描述将CRE基质制备成薄而平整的组织片，以获得优异的光学分辨率。

我们提供了一种在缺血再灌注损伤中进行白细胞成像的方案，该方案已在我们的实验室中得到充分建立。此模型可用于分析缺血过程中氧化应激的活化，以及再灌注损伤的相关研究。

缺血再灌注损伤与多种病理状态相关，例如心肌梗死、肠缺血，以及器官移植和心血管手术后的并发症。对先前缺血组织进行过度灌注虽然对于防止不可逆的组织损伤至关重要，但会引发邻近组织的过度炎症反应，导致活性氧物质的产生、补体系统的激活以及微血管通透性增加。在再灌注过程中，白细胞的活化是介导炎症性组织损伤病理级联反应的关键环节之一。

本文介绍了一种利用毛细血管后微静脉的活体显微技术，作为分析缺血-再灌注损伤中白细胞活化的便捷方法。我们进一步阐述了该方法中常见的误区，并提供了实用建议，以帮助读者充分理解并安全地开展该技术操作。在获得伦理委员会批准后，对体重为120至180克的雄性大鼠进行麻醉，将大鼠置于有机玻璃箱内，并通过异氟烷挥发器给予2%至3%体积浓度的异氟烷。

一旦达到适当的麻醉水平，立即称量大鼠体重，并剃除其颈部腹侧区域的毛发。将大鼠仰卧置于加热垫上，以维持体温在37摄氏度，并通过硅胶面罩给予2%体积浓度的异氟烷。以下操作最好在手术显微镜下进行。

在SRA胸骨切迹区域做一长约2厘米的横向皮肤切口。将腮腺向侧方游离。此时可见颈部腹侧肌肉。

沿正中线小心分离，找到气管。暴露1至2厘米的气管，并从下方置入显微镊子以抬起气管。现在从气管腹侧约一半处插入一根14号规格的导管作为气管插管，插入气管下部，该导管此前已连接至动物呼吸机。

随后可将呼吸设为容量控制模式，频率为每分钟35至45次。潮气量为4.5至5 mL，颈动脉插管时异氟烷浓度为1.5至2体积%。用钝性分离法分离右侧胸骨舌骨肌。

为了定位颈动脉，需小心地将迷走神经与颈动脉分离，并用Anki微型镊子夹住颈动脉，以阻断血液从心脏流过位于颈动脉下方的两根缝线。相对于心脏位置，远端的缝线应扎紧，而近端的缝线则应松松地围绕颈动脉打结。在使用显微剪刀移除微型镊子后，为防止出血，需在近端再加一根缝线。在两根结扎线之间于颈动脉上做一小切口。插入连接压力传感器、内含生理盐水溶液的聚乙烯导管。

移除显微镊子，并将导管进一步插入动脉。使用血气分析仪进行间歇性动脉血气分析，并将血液 pH 值维持在生理范围内，以进行荧光染料或其他目标药物的静脉给药。双手持镊，用手术显微镜聚焦于左侧颈静脉区域，撕开薄层筋膜以暴露颈静脉。

用斜角显微镊夹住静脉以阻断血流。用镊子将两段等长的缝合线以与颈动脉插管相同的方式穿过颈静脉下方，在颈静脉上做一个小切口，插入已用细胞系溶液冲洗过的聚乙烯导管。将导管向心脏方向送入，并扎紧靠近心脏侧的结扎线。

在静脉和导管周围，我们使用一种铝制的四期提睾肌成像装置，该装置可快速达到加热垫的设定温度。切口最初位于阴囊上方精索外筋膜的远端皮肤处，随后使用精细剪刀谨慎地扩张皮下间隙。一旦组织暴露，即用预热的生理盐水溶液润湿。

仔细去除外精索筋膜与CRE提睾肌之间的结缔组织，以使提睾肌从周围组织中游离出来。解剖过程中持续进行灌流，可保持组织湿润，从而提高可视性并便于操作，例如在精索远端处固定并轻微牵拉提睾肌末端，使其位于精囊腹侧远端开口内，并将切口向近端延长。使用显微剪刀仔细分离沿切口线分布的出血血管。

利用热科里针（thermal Cory），将暴露的提睾肌平放在铝制基座上，仍通过细小的韧带与睾丸下方的附睾相连，其中包括一条细小的动脉和静脉。使用电凝止血以封闭血管，并切断精索组织与提睾肌组织之间的结缔韧带。轻柔地将分离出的睾丸推回腹股沟管内。

除了第一次固定外，还需用四个镊子夹住组织和胶带，小心地将提睾肌组织在铝制载物台上呈放射状铺开。将聚乙烯导管的两端靠近提睾肌组织，以建立灌流装置。使用注射器在提睾肌周围画一圈石蜡油，以形成一个液体腔室。

将方形盖玻片置于腹股沟管组织上，并将其边缘牢固地粘附于凡士林圈上。提睾肌组织现已准备好进行活体显微成像。基本的活体成像装置可能有所不同。

我们使用配备470纳米LED光源的活体透射荧光显微镜进行EP层析成像。通过水浸物镜，利用高分辨率数码相机实现约800倍的放大观测。进行透射荧光成像时，实验应在暗室中进行。

进行白细胞标记时，通过颈静脉导管以每公斤体重0.4毫克的浓度静脉注射Rumine Six J。选择后微静脉作为观察部位，血管直径应在20至60微米之间，且血流应充足。

在缺血发生前，让组织稳定30分钟。随后，记录30秒以确定白细胞滚动和黏附的基础值。使用施用镊子，将微型血管夹轻轻放置在暴露的提睾肌组织最近端处。

缺血30分钟后移除血管夹。随后可在整个再灌注期间持续进行记录。为定量分析白细胞滚动，需定义一条与血管垂直相交的虚拟线，该虚拟线应在所有记录中保持一致。

在30秒内手动计数通过该线的滚动白细胞数量。对于黏附白细胞的定量，需选定一段一致的200微米血管节段，在所有记录中均使用该标准。

计数在30秒内保持静止且清晰可见的白细胞数量。代表性结果已在书面方案中提供。尽管缺血再灌注损伤已知与多种器官系统相关，但本文描述了一种用于分析骨骼肌组织再灌注损伤中白细胞与内皮细胞相互作用的方法。

因此，该方法对于皮瓣手术尤其具有相关性，因为人们认为其他器官的缺血后组织损伤涉及相同的炎症机制。所描述的方法可用于深入了解缺血-再灌注损伤中的病理机制。对提睾肌施加缺血处理操作简便，且能很好地模拟游离皮瓣移植术等具有临床相关性的条件。

此外，可轻松应用诸如冷缺血、热缺血，或使用影响炎症的物质进行隔室灌注等干预措施。当需要在记录前数小时或数天进行治疗时，经口内注射可能是首选方法。