Name: 纳米有限元分析:蛋白质定位的光激活定位显微镜和电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 学习纳米有限元分析方法，利用光激活定位显微镜和扫描电子显微镜在转基因线虫中精确定位组蛋白。该技术克服了传统免疫电镜的局限性，为蛋白质亚细胞定位研究提供了高分辨率工具。

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我们感谢Harald Hess和Eric Betzig提供了用于原理验证实验的PALM显微镜，感谢Richard Fetter分享固定方案、试剂以及给予的鼓励。我们感谢Michael Davidson、Geraldine Seydoux、Stefan Eimer、Rudolf Leube、Keith Nehrke、Christian Frøkjr-Jensen、Aude Ada-Nguema和Marc Hammarlund提供了DNA载体。我们还感谢Carl Zeiss公司提供了Zeiss PAL-M的使用权限，该设备是Zeiss Elyra P.1 PALM显微镜的测试版。

1. 高压冷冻
<ol>
	<li>通过将 0.2 g BSA 加入 1 ml 适合您样本的培养基中（例如，细胞培养使用培养液，秀丽隐杆线虫（C. elegans）使用 M9 培养基）来配制冷冻保护剂。将试管置于 37 °C 水浴中孵育，直至所有 BSA 完全溶解。</li>
	<li>在冷冻前，向自动冷冻置换装置（Leica AFS）中加入液氮</li>
	<li>设置 AFS 程序：-90 °C 保持 5–30 小时*，以 5 °C/hr 升温至 -60 °C，在 -60 °C 保持 2 小时（若使用 Leica AFS 2，可选择“暂停”选项），再以 5 °C/hr 升温至 -30 °C，并在 -30 °C 保持 72 小时。如果 AFS 设备支持超过五个步骤，则应将 -30 °C 步骤替换为设置为 0 小时的“暂停”选项，并额外添加两个步骤：以 10 °C/hr 升温至 -20 °C，并在 -20 °C 保持 24 小时。如果设备仅支持五个步骤，则应在另一个内存槽中设置如下程序：以 10 °C/hr 升温至 -20 °C，并在 -20 °C 保持 24 小时。 
	*此处时间可调整，以便使 -60 °C 步骤在清晨开始。</li>
	<li>通过将 0.1 g 四氧化锇晶体（EMS, RT19134）与 10 ml 无水丙酮（EMS, # RT10016）混合，配制 1% 四氧化锇储备液。在 50 ml 锥形管中按以下步骤配制固定剂：首先加入 1 ml milliQ 水，然后溶解 0.02 g 高锰酸钾（EMS, RT20200）。加入 19 ml 丙酮并充分混匀。最后向管中加入 20 μl 1% 四氧化锇储备液。丙酮是一种自由基清除剂11，因此可防止塑料聚合物发生聚合反应；但由于丙酮与脂质相互作用，有利于形态结构的保存，因此必须将其用作冷冻置换介质。在塑料包埋前，丙酮将被乙醇取代。将固定剂分装为每管 1 ml 至冻存管中，并通过将管子储存在液氮中使其保持冷冻状态。</li>
	<li>用 20% BSA 或细菌填充样本载具。20% BSA 和细菌均可作为冷冻保护剂。载具类型的选择取决于样本种类。对于 C. elegans，应使用 100 μm 深度的载具。</li>
	<li>将样本放入载具中，并使用高压冷冻仪进行冷冻。</li>
	<li>冷冻完成后，在液氮环境下将样本转移至含有固定剂的冻存管中。确保样本始终浸没在液体中。</li>
	<li>重复步骤 1.5) 至 1.7)，直至所有样本均完成冷冻。</li>
	<li>将所有冻存管转移至 AFS 装置中，并继续运行程序。</li>
</ol>
2. 冷冻置换
<ol>
	<li>当温度达到 -60 °C 时，将装有 20 ml 95% 丙酮的离心管放入 AFS 中。</li>
	<li>当温度达到 -50 °C 时，在 2 小时内用 95% 丙酮更换固定剂六次。</li>
	<li>将装有 20 ml 0.1% 醋酸铀酰（Polysciences, #21447-25）溶于 95% 丙酮的离心管放入腔室，并预冷至 -50 °C。</li>
	<li>洗涤步骤结束时，向每个离心管中加入约 1 ml 醋酸铀酰溶液。如有必要，恢复程序运行。</li>
	<li>当温度达到 -30 °C 时，在 2 小时内用 95% 乙醇更换醋酸铀酰六次。</li>
	<li>同时，配制 97% 乙二醇甲基丙烯酸甲酯树脂（GMA，SPI Supplies/Structure Probe, Inc., #02630-AA）：混合 22.3 ml GMA、10 ml 甲基丙烯酸正丁酯、1 ml milliQ 水和 0.2 g 过氧化苯甲酰（催化剂）。将其储存于玻璃离心管（EMS, #72632）中，并通过与 95% 乙醇混合配制 30% GMA。切勿将 GMA 介质储存在塑料管中，因为聚乙烯类塑料长期储存会导致聚合质量下降。将 GMA 溶液预冷至 -30 °C。 
	传统环氧树脂（如 Araldite 和 Epon）不能用于本方案，因其无水且呈酸性，会淬灭荧光蛋白。丙烯酸树脂（如 LR White）可耐受少量水分并能保存荧光蛋白，但其酸性 pH 值倾向于淬灭荧光团12。GMA 实际上耐受甚至需要少量水分，且呈碱性（pH 8）12。然而，GMA 较脆。此外，GMA 不像传统环氧树脂那样与组织发生交联。这些特性导致 GMA 在切片质量上存在不一致性，尤其是在切片厚度小于 80 nm 时更为明显。 
	尽管 GMA 的保质期约为一年，但为确保其质量，建议在购买后三个月内使用完毕。</li>
</ol>
3. 渗润与聚合
步骤 3.1-3.3 在用于冷冻置换的同一冻存管中进行。浸润和聚合在 AFS 中于 -30 °C 下进行，以保护荧光蛋白。
<ol>
	<li>通过将GMA储备液与95%乙醇混合来制备浸渗介质。将样品在30% GMA中孵育3-5小时。</li>
	<li>将样品在70% GMA中孵育4-6小时。</li>
	<li>将样品在97% GMA中过夜孵育。</li>
	<li>次日，配制新鲜的97% GMA。</li>
	<li>将样品转移至包埋模具（EBSciences, #TC）。使用3/8" DISC Punch（Ted Pella Inc.）制备一张ACLAR膜圆片（EMS, #50425-10），并将其置于BEEM胶囊底部。</li>
	<li>在-30 °C条件下，每6小时更换一次97% GMA，共更换三次。</li>
	<li>第三次更换后，向GMA中加入引发剂N,N-二甲基对甲苯胺（Sigma-Aldrich, #D9912），终浓度为1.5 μl/1 ml GMA，并将此溶液加入每个样品包埋模具中。立即在AFS中将样品定位至包埋模具内。 
	请注意，过氧化苯甲酰是催化剂，在所有浸渗步骤中均已存在，因此无需搅拌。过氧化苯甲酰不会使塑料发生聚合，直到其接触到化学引发剂N,N-二甲基对甲苯胺。该引发剂会立即启动聚合反应，甚至可在1小时内使组织内的树脂聚合。然而，由于聚合不完全，深层组织可能出现组织脱落现象。此外，GMA不能很好地将样品交联到包埋块上，因此可通过轻敲细菌基质的方式将样品与冷冻保护剂分离。 
	若在AFS之外进行聚合，必须用Aclar圆片覆盖包埋模具，以隔绝氧气。GMA在接触氧气时无法完全聚合。</li>
	<li>尽管塑料在1小时内即可完成聚合，仍需让其过夜固化。</li>
	<li>将样品储存于充满氮气的真空袋（Ziploc）中，并置于冷冻冰箱（-20 °C）中，直至后续处理，以避免荧光蛋白暴露于氧气中。</li>
</ol>
4. 切片
<ol>
	<li>对GMA包埋的样品进行切片时，操作方式与环氧树脂（epon）包埋样品类似。需格外注意避免切片表面接触水分，因为GMA具有很强的亲水性，若切片两面受潮，切片条带会被吸入水浴中。</li>
	<li>若使用全内反射荧光显微镜（TIRF）进行定位，应将切片条带（50–80 nm）收集到玻璃盖玻片上；否则，应使用透射电子显微镜专用载网。切片速度应设置为1.6 mm/s或更高，否则可能无法形成连续条带。</li>
	<li>若切片不能立即成像，应于-20 °C保存。为保护荧光染料免受紫外光损伤，需用铝箔包裹切片存放容器。</li>
</ol>
5. 光活化定位显微成像
<ol>
	<li>根据制造商的建议设置 PALM 显微镜。EMCCD 相机的温度应设置为 -70 °C 或更低。</li>
	<li>将金颗粒溶液（#790122-010 - 2 倍浓缩液，microspheres-nanospheres.com）约 50 μl 加入待成像样品中。在黑色遮光罩下，让溶液在盖玻片上静置 30 秒。</li>
	<li>通过将溶液吹至盖玻片边缘并用擦镜纸吸收，去除金颗粒溶液。</li>
	<li>将盖玻片插入圆形盖玻片 holder 中。如有需要，可在边缘涂抹真空润滑脂以固定盖玻片。</li>
	<li>在盖玻片底面、样品正下方滴加浸油。</li>
	<li>将样品 holder 插入显微镜载物台的插槽中。操作时需特别注意不要触碰物镜。</li>
	<li>调整 holder，使其固定牢固并将样品区域居中对准物镜。</li>
	<li>使用 10x 物镜定位样品区域。</li>
	<li>切换至 100x 物镜。</li>
	<li>对样品进行调焦。</li>
	<li>通过观察荧光信号的强度来定位感兴趣区域。使用 488 nm 激光，并在通道菜单中将强度调至 10%。聚焦于荧光最强的区域。注意：如果可通过明场直接肉眼识别感兴趣区域，则此步骤可省略。</li>
	<li>切换激光至 561 nm，并将强度调至 100%，以漂白背景自发荧光。漂白时间约为 2 分钟。</li>
	<li>若漂白过程中焦点发生偏移，应等待 5 分钟后再调整焦点并开始图像采集。此等待时间有助于温度稳定。若 PALM 显微镜配备培养室，应将温度设为 20 °C，并等待约 2 小时以使腔内温度稳定。</li>
	<li>漂白完成后，启动 405 nm 激光，并将其强度设为最低。</li>
	<li>以每秒 20 帧的速度开始采集图像。通常每次实验采集 5,000–6,000 帧，但具体帧数应根据实验目的进行调整。例如，若需对感兴趣区域内的所有蛋白质成像，则应增加帧数。</li>
	<li>若信号稀疏或微弱，可缓慢增加 405 nm 激光的强度。</li>
	<li>在采集过程中，需根据需要小心调节旋钮，确保样品始终处于焦点范围内。</li>
	<li>图像采集完成后，应进行 PALM 分析。对于 tdEos，我们过滤掉荧光持续时间超过 500 毫秒的信号，因为这些信号可能来源于自发荧光。</li>
</ol>
6. 扫描电镜成像
<ol>
	<li>在进行扫描电镜成像之前，使用2.5%醋酸铀酰（溶于水）对切片染色4分钟，随后用滤过的milliQ水彻底洗去醋酸铀酰。</li>
	<li>切片干燥后，使用碳溅射仪对盖玻片进行碳镀膜，直至盖玻片变得明显深暗。将碳导电胶带的一端贴在盖玻片边缘，另一端贴在金属样品台（stub）上，使盖玻片表面积累的电子得以接地。</li>
	<li>将样品装入扫描电镜腔室（FEI Nova Nano）。</li>
	<li>插入vCD检测器。</li>
	<li>关闭腔室，并使用高真空模式进行抽气。</li>
	<li>真空达到要求后，打开镜筒阀门，使电子束作用于样品。</li>
	<li>对电子束进行常规校准。</li>
	<li>定位样品。</li>
	<li>调整焦距后，联动样品台，并将样品台提升至距极靴下方5 mm处。</li>
	<li>获取样品的低倍图像（约5,000倍）。</li>
	<li>放大至目标区域，获取高倍（50,000倍）图像。</li>
	<li>移动至下一个切片，重复步骤6.10）和6.11），直至完成所有切片的成像。</li>
</ol>
7. 对齐 PALM 与 EM 图像
<ol>
	<li>打开 Photoshop 和已获取的扫描电镜（SEM）图像。</li>
	<li>创建一个新窗口，尺寸为 5,000 × 5,000 像素，分辨率为 300 像素/英寸。</li>
	<li>将低倍率的 SEM 图像复制到新窗口中（图 1A）。</li>
	<li>使用变换操作（Mac 系统按 Command + T）调整图像大小，使其充满整个窗口。</li>
	<li>复制高倍率的 SEM 图像，并根据需要进行缩放。</li>
	<li>通过图像下拉菜单中的图像旋转选项，将总和 TIRF 图像水平翻转。</li>
	<li>将总和 TIRF 图像（来自 PALM）复制并粘贴到一个新图层中。</li>
	<li>使用变换操作调整图像大小，然后根据需要旋转，使金颗粒的荧光信号（图 1A 中的白色箭头）与 SEM 中观察到的相应结构对齐（图 1B）。</li>
	<li>将 PALM 图像复制到一个新图层，并应用相同的变换（图 1C）。可从此图像中提取更高倍率的图像（图 2）。</li>
	<li>用于展示时，将已变换的 PALM 图像复制到一个新图层。在“选择”下拉菜单中使用“色彩范围”功能，仅选择 PALM 信号而不选背景。确保选择一个背景像素作为参考像素，并启用“反向”选项。</li>
	<li>剪切所需的 PALM 信号并粘贴到新图层中。</li>
	<li>对背景图层应用透明度，设置为 10%。这可在不降低信号强度的前提下使背景透明，从而清晰显示 PALM 信号（图 2D）。</li>
</ol>
8. 代表性结果
利用 tdEos 标记的组蛋白可在线虫 C. elegans 中稳定表达，转基因动物按照上述方案进行处理。PALM 图像与电子显微图像来自同一组织切片（图 1）。为实现图像对齐，将全时程荧光信号叠加生成的 TIRF 总和图像覆盖在电子显微图像上。金纳米颗粒在荧光图像和电子显微图像中均可被识别，可用于在 Photoshop 中通过“变换（transform）”功能对两幅图像进行对齐（图 1A 和 B）。随后，将相同的“变换”参数应用于 PALM 图像（图 1C）。在此放大倍数下，无法分辨结构细节，因此我们对显微图像顶部区域进行了局部放大（图 2）。在高倍图像中，可观察到细胞核、核仁、核孔和内质网等亚细胞结构细节。此外，如预期所示，标记的组蛋白分子仅定位于细胞核内，而不存在于核仁中。因此，关联的 PALM 与电子显微技术能够实现蛋白质在最高分辨率下的精确定位。
有五个问题可能影响图像质量。第一，冰晶损伤会破坏超微结构（图3A和B）。将样品置于细菌等冷冻保护剂中可减少冰晶扩散，从而减轻此类损伤。然而，仍需通过电子显微镜筛选样品，并剔除存在冷冻伪影的样本。第二，GMA不像环氧树脂那样与组织发生交联，因此样品常从周围塑料包埋介质中脱落，导致切片发生拉伸、收缩甚至脱落（图3C和D）。在包埋前将样品从细菌或其他冷冻保护剂中分离，可增强塑料与样品之间的黏附性（图3C）。类似地，由于缺乏交联作用，肠道中的脂滴等结构也常从组织中分离（图3E）。第三，塑料聚合不完全会导致组织拉伸或折叠（图3F）；样品中残留的氧气也会阻碍GMA的聚合反应。第四，GMA切片质量较差常导致形态不一致（图3G和H）。为尽量减少切片伪影，GMA切片应切至70 nm或更厚，切割速度约为1.6 mm/s。第五，盖玻片或切片表面灰尘引起的背景自发荧光难以避免。通过使用预先清洁的盖玻片，并避免使用kimwipes和滤纸引入灰尘污染（如实验方案所述），可尽量减少灰尘导致的自发荧光。PALM分析程序可去除来自样品或塑料中荧光持续时间长于典型荧光蛋白信号的荧光信号（图2 A和B），最终获得的图像将无此类伪影。
<img alt="细胞成像比较：电子显微镜图像、全反射荧光总和图像、PALM图像；显微技术分析。" src="/files/ftp_upload/3995/3995fig1.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3995/3995fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 利用金纳米颗粒对齐荧光图像与电子显微镜图像。（A）来自表达标记组蛋白tdEos::HIS-11的秀丽隐杆线虫（C. elegans）横切面的低倍电子显微镜图像。白色箭头指示在PALM成像前施加的100 nm高电子密度金纳米颗粒，用作定位标记（fiducial marks）。（B）这些金珠在暴露于约580 nm光时产生荧光，从而在荧光图像中形成定位标记。通过定位标记的位置，将全反射荧光总和图像（sum TIRF image）与电子显微镜图像对齐。该sum TIRF图像代表实验时间过程中相机检测到的所有光子总和。请注意，左上方的亮斑（白色箭头）来源于金颗粒的聚集体。（C）随后将PALM图像叠加到电子显微镜图像上，并根据（B）中sum TIRF图像对齐所确定的旋转和平移参数进行调整。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3995/3995fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="使用TIRF和PALM显微镜观察组蛋白-tdEos的定位，揭示亚细胞结构。" src="/files/ftp_upload/3995/3995fig2.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/3995/3995fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 利用组蛋白融合蛋白进行相关联的纳米级荧光电子显微镜（nano-fEM）分析。 （A）从薄切片（70 nm）获得的tdEos::HIS-11的TIRF叠加图像。（B）tdEos::HIS-11对应的PALM图像。持续时间超过500毫秒的自发荧光（白色箭头）已被PALM程序滤除。（C）从同一薄切片获得的细胞核的透射电子显微图像。（D）tdEos::HIS-11的PALM图像与电子显微图像的关联叠加。荧光信号在细胞核内紧密定位于染色质区域。
<img alt="显示冰晶损伤效应和切片质量比较的肌肉组织电子显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3995/3995fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 与纳米级电子显微镜（nano fEM）相关的问题。（A）未受冰晶损伤的C. elegans体壁肌肉电子显微图像。（B）存在冰晶损伤的体壁肌肉电子显微图像。由于冰晶形成，肌动蛋白和肌球蛋白丝状结构未保持独立的横切面形态，而是塌陷聚集为团块。（C, D）低倍电子显微图像，显示线虫与其周围介质分离的情况。当样本被冷冻保护性细菌包围时（D），切片形变更严重；相比之下，样本被塑料包埋时（C）形变较轻。在进行塑料包埋前，应将载样铜网中的细菌冷冻保护剂从固定样本周围解剖清除。（D）中右侧动物为斜切切面，因此其形状并非由组织扭曲造成。（E）肠组织电子显微图像，显示组织脱落区域（黑色箭头）。（F）神经环电子显微图像，显示因塑料未完全聚合导致的切片折叠（黑色箭头）。（G, H）来自同一样本、在不同日期切片的神经元电子显微图像。某一天的组织保存质量极佳（G），但另一天因切片质量不一致，导致此类形态结构无法辨认（H）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3995/3995fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。

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<li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching%2Fblinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
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本文的制作与免费访问由卡尔蔡司公司（Carl Zeiss, Inc.）赞助。

本文介绍了如何在塑料包埋介质中保存荧光蛋白，对切片中的荧光蛋白进行定位，并利用电子显微镜观察其超微结构。采用光激活单分子显微镜（PALM）技术，将蛋白质的定位精度提升至纳米级别，突破了衍射极限。为了将本实验方案适配于特定样品，需考虑以下参数：荧光染料、定量分析以及图像对齐。
荧光蛋白或有机荧光染料的选择取决于具体应用和模式系统。我们测试了多种荧光蛋白，包括 EGFP、YFP、Citrine、mEosFP、mEos2、tdEos、mOrange、PA-mCherry 和 Dendra12。每种荧光染料的荧光保留情况相似，表明所有荧光蛋白均可通过所述方法得以保存。我们选择 tdEos 是因为它在 C. elegans 中表达良好，与 tdEos 融合后蛋白仍保持功能，且其光激活特性最适合 PALM 显微镜成像。然而，偶尔也会观察到 tdEos 的聚集或表达失败12.
根据具体应用，可能更适合使用不同的荧光团。在许多情况下，并不需要使用光激活荧光蛋白。简单的相关荧光显微镜-电子显微镜技术并不需要光激活荧光蛋白。可以使用GFP或有机染料对切片中超过衍射极限的标记蛋白进行荧光成像。例如，可利用荧光显微镜对神经纤维网中的轴突进行成像，并将荧光信号与电镜图像中的特定轴突进行关联。其他超分辨率成像技术，如受激发射损耗显微镜（STED）12、基态耗尽显微镜后接单分子返回成像（GSDIM）13以及结构照明显微镜（SIM）14，也不需要光激活荧光蛋白。此外，使用有机染料9,15,16或荧光探针固有特性17的超分辨率成像技术也可直接应用。
在PALM中，由于每个分子的荧光在空间和时间上是分离的，因此可以对分子数量进行定量。然而，定量结果可能因以下四个原因而产生误导：氧化、计数不足、重复计数和过表达。首先，在样品处理过程中，部分荧光蛋白可能发生变性或氧化5,12。尽管在我们的实验方案中，固定和包埋过程保留了约90%的荧光信号，但在样本切片后，表面暴露于氧气中，荧光蛋白仍可能发生氧化。其次，光激活蛋白的激活是随机的，因此在特定的衍射极限光斑内可能同时激活多个分子8。来自多个分子的荧光将表现为一个光斑，从而导致蛋白总数被低估。第三，类似的问题可能导致重复计数。在PALM中，每个荧光蛋白被定位后会通过漂白“擦除”。然而，荧光蛋白可能在未被永久漂白的情况下从暗态恢复18，这些分子将被多次计数。第四，标记蛋白以转基因形式表达，通常存在多个拷贝，可能导致过表达。因此，PALM的定量结果可用于估算、但不能精确确定特定位置的分子数量。
由于光学显微镜与电子显微镜之间的分辨率差异以及电子束引起的畸变，将PALM图像与电子显微照片对齐也具有挑战性。金颗粒在电子显微照片中可作为精确定位的基准标记。然而，金颗粒的荧光并非光激活，其呈现为一个较大的衍射极限光斑。因此，将荧光图像叠加到电子显微照片上的位置仅为一种估算。电子与塑料切片之间的相互作用也可能引起畸变。丙烯酸树脂（如GMA）在电子束下稳定性较差，塑料的尺寸可能发生改变。在此情况下，将荧光信号与超微结构对齐可能需要对基准标记进行非线性变换。

<table><tbody><tr><td>高压冷冻仪</td><td>ABRA</td><td>HPM 010</td><td>也可使用徕卡（Leica）的 EMPact 和 HPM 100，或 Wohlwend 的 hpf-01。</td></tr><tr><td>自动冷冻置换仪</td><td>Leica Microsystems</td><td>AFS 2</td><td>AFS 1 也可使用。</td></tr><tr><td>蔡司 PALM 系统</td><td><a href="http://www.zeiss.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Zeiss, Inc.</a></td><td>ELYRA P.1</td><td>尼康（Nikon）和 Vutara 也销售商用 PALM 显微镜。</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>FEI</td><td>Nova nano</td><td>也可使用其他高分辨率 SEM 显微镜。</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>EMS</td><td>RT10016</td><td> </td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td> </td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>EMS</td><td>RT19134</td><td> </td></tr><tr><td>高锰酸钾</td><td>EMS</td><td>RT20200</td><td> </td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-50G</td><td> </td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>21447-25</td><td>该公司的醋酸铀酰 pH 值略高。</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸乙二醇酯（GMA）</td><td>SPI Supplies</td><td>02630-AA</td><td>低酸性，透射电镜级。</td></tr><tr><td>N,N-二甲基对甲苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9912</td><td> </td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5000-0020</td><td> </td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>EMS</td><td>72632</td><td> </td></tr><tr><td>Aclar 膜</td><td>EMS</td><td>50425-10</td><td> </td></tr><tr><td>BEEM 胶囊</td><td>EBSciences</td><td>TC</td><td>聚丙烯</td></tr><tr><td>3/8" 圆形打孔器</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>54741</td><td> </td></tr><tr><td>金纳米颗粒</td><td>microspheres-nanospheres.com</td><td>790122-010</td><td>请索取 2 倍浓度的溶液</td></tr></tbody></table>

纳米级荧光-电子显微：利用光激活定位显微镜与电子显微镜进行蛋白质定位

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

绘制蛋白质分布图对于理解蛋白质在细胞中的功能至关重要。荧光显微镜被广泛用于蛋白质定位，但荧光图像通常缺乏亚细胞结构背景。另一方面，免疫电镜技术虽可实现蛋白质定位，但受限于兼容性抗体的缺乏、形态结构保存不佳，以及大多数抗原未暴露于样品表面等问题。关联成像方法可首先对完整细胞获取荧光图像，该图像可来源于免疫荧光标记或基因编码的荧光蛋白标记。随后将样品固定并包埋用于电镜观察，并将两种图像进行关联1-3。然而，由于荧光图像分辨率较低，且缺乏定位参照标记物，难以实现蛋白质的精确定位。
或者，也可在将样本包埋于塑料介质中后进行荧光成像。该方法中，对包埋块进行切片，并对同一片层获取荧光图像与电子显微图像并进行关联4-7。然而，关联图像中光的衍射极限会模糊单个分子的具体位置，且荧光信号常会超出细胞边界。
纳米分辨率荧光电子显微镜技术（nano-fEM）通过在同一超薄切片上依次采用光激活定位显微镜（PALM）和电子显微镜成像，实现蛋白质在纳米尺度上的精确定位。PALM 技术通过逐个成像单个荧光蛋白分子，并随后绘制每个荧光点的质心位置，从而突破光学衍射极限8-10。
我们通过五个步骤概述纳米级荧光电子显微镜技术（nano-fEM）。第一步，采用能够保存标记蛋白荧光特性的条件对样品进行固定和包埋。第二步，将树脂块切成超薄切片（70–80 nm），并将其贴附于盖玻片上。第三步，使用蔡司PALM显微镜对这些切片进行荧光成像。第四步，使用扫描电子显微镜对同一组切片中的电子致密结构进行成像。第五步，利用金颗粒作为定位标记，将荧光图像与电子显微图像进行对齐。总之，可在约一周时间内以纳米级分辨率确定荧光标记蛋白的亚细胞定位。

我们描述了一种在电子显微照片中定位荧光标记蛋白的方法。首先在超薄切片上利用光激活定位显微镜对荧光信号进行定位，然后将这些图像与同一切片的电子显微照片进行配准对齐。

绘制蛋白质分布图对于理解蛋白质在细胞中的功能至关重要。荧光显微镜被广泛用于……

以下实验的总体目标是利用荧光显微镜与电子显微镜联用技术，对蛋白质进行定位并获取相应的电子显微图像。该方法称为纳米级荧光-电子显微联用技术（nano FEM），用于在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中定位蛋白质。首先，将表达组蛋白TD-eos的转基因线虫包埋于塑料介质中，并进行切片处理。每个切片均通过光激活定位显微镜（PALM）和扫描电子显微镜成像。每个切片的两张显微图像使用 Photoshop 软件，借助定位标记进行对齐。该关联图像展示了组蛋白分子在细胞核内的定位情况。因此，我们今天要介绍的这项技术的主要优势在于，与使用免疫电镜（immuno em）不同，我们采用的是基因编码的荧光蛋白，使得每种蛋白质都与一种荧光蛋白相关联。在使用免疫电镜时，许多抗体无法与塑料相容，或者即使相容，抗体也无法深入渗透到含有抗原的切片内部。通过使用荧光蛋白，每种蛋白质都会被标记上一种荧光基团。今天，Shige Wbi 将演示这一技术。以下操作步骤将利用表达组蛋白并带有荧光蛋白 TDE os 标记的转基因线虫进行演示。本演示中，我们将使用细菌作为冷冻保护剂，但您也可以使用 20% BSA 来冷冻海葵。在冷冻置换前一小时，用液氮填充自动冷冻置换仪或 FS 装置。同时提前按照随附文件中的说明配制所需的固定剂，将固定剂分装至冻存管中，每管一毫升，并将其置于液氮中保存，直至使用。使用画笔从细菌菌苔中挑取生物样本，并转移至一个100微米的样品载具中，略微过量填充，以确保无气泡产生。完成后，将样品杯置于高压冷冻仪的夹具中进行冷冻。随后立即将样品转移至冷冻室旁的液氮浴中。接下来，使用移液器和一对镊子将样本转移至含有固定剂的冻存管中。确保样本始终浸没在液氮中。对每个样本重复此操作，然后将所有冻存管转移至冷冻替代装置（FS unit）中。将所有冻存管放入程序降温仪后，启动程序。冷冻与处理流程如本图所示。在初始 -90 °C 的孵育过程中，玻璃态冰被丙酮中的固定剂取代。随后，随着样品温度升高，液体丙酮中的固定剂会交联样品以保存其结构。当冷冻替代仪（FS单元）内的温度降至零下60摄氏度时，将装有20毫升95%丙酮的闪烁瓶放入FS中进行预冷。当温度升至零下50摄氏度时，使用带有P200吸头的巴斯德移液管去除固定剂，并向每个样品中加入约1毫升预冷的95%丙酮。胆汁。每20分钟重复此步骤，持续两小时。同时，在-50°C孵育期间，将含有20毫升0.1%醋酸铀酰（urinal acetate）溶于95%丙酮的闪烁瓶放入FS腔室中，预先冷却至-50°C。最后一次丙酮洗涤后，向每个闪烁瓶中加入约1毫升醋酸铀酰溶液，对样品进行染色以增强膜的对比度。如果程序已暂停，请重新启动。当温度降至零下40摄氏度时，将含有95%乙醇的闪烁小瓶放入FS室中。当温度达到零下30摄氏度时，使用巴斯德吸管每20分钟更换一次乙酸戊酯，替换为95%乙醇，持续两小时。此步骤中必须使用乙醇，因为树脂在丙酮存在下不会发生聚合。在该实验方案的下一部分中，将样品在零下30摄氏度条件下包埋于塑料介质中。在冷冻替代装置（FS）中，用预冷的含30%乙二醇甲基丙烯酸酯树脂（GMA）的95%乙醇溶液替换95%乙醇；三至五小时后，将30% GMA替换为70% GMA；四至六小时后，去除70% GMA，并将样品在97% GMA中过夜孵育。逐步增加GMA浓度可使介质渗透到组织中。注意，由于在GMA树脂中添加了3%水，因此97%GMA并未被稀释。次日用乙醇处理时，使用巴斯德移液管将样品转移至A FS中的包埋模具中，先将样品放入包埋模具，然后在-30摄氏度条件下，于六小时内将97%GMA更换为新配制的GMA三次。第三次置换后，轻敲细菌基质以将样品与冷冻保护剂分离。在通风小瓶中，将引发剂NN-二甲基脲啶加入97%GMA中。每1毫升GMA加入1.5微升引发剂，立即向每个包埋模具中加入GMA溶液，并将样本在模具中摆放均匀，确保间距一致。重新启动程序，使温度升至零下20摄氏度。尽管树脂在一小时内即可快速聚合，仍需让塑料在零下20摄氏度下过夜固化，以确保其充分聚合。塑料固化后，将样品存放在充满氮气的真空袋中，于零下20摄氏度保存。GMA包埋样品的切片应按照随附文件中针对光激活定位显微镜（photo activated localization microscopy）或PALM成像所述的方法进行。显微镜系统应配置为E-M-CCD相机温度设置在零下70摄氏度或更低。使用移液器，将约 50 微升浓度为每毫升 1×10¹⁰ 个颗粒的 100 纳米金颗粒溶液加到待成像的样品上。将黑色盖板覆盖在样品上，使溶液在盖玻片上静置 30 秒。去除金溶液时，将其吹至盖玻片边缘，并用无尘纸（kim wipe）吸除溶液。然后将真空脂涂抹在圆形盖玻片夹持器上，并插入盖玻片。将浸油涂抹在盖玻片的底面，将盖玻片置于样品正下方。将样本架插入显微镜载物台的插槽中，并调整位置，使其紧密固定并将切片对准物镜上方。务必小心，避免触碰物镜。接着，使用明场照明，通过10倍物镜找到切片位置。然后换用100倍物镜，并对样本进行聚焦。如有需要，切换至荧光照明，使用波长为488纳米的激光，激光强度设置为10%。等待五分钟，使样品温度达到平衡。随后识别荧光最强的区域，并将其调至清晰对焦。将激光切换至561纳米，并将强度增加至100%。为消除背景自发荧光，需对样品进行约两分钟的漂白。若漂白过程中焦点发生变化，应等待五分钟后再调整焦点并采集图像。漂白完成后，启动405纳米激光，并将其设为最低强度。以每秒20帧的速度开始采集图像。根据实验目的采集足够数量的帧数。此处采集5,000至6,000帧，用于确定细胞核内584个组蛋白的定位。当采集到 5,000 帧后，成像软件将识别并定位所有分子。最终的荧光图像，即所谓的“some turf”图像，是相机检测到的所有荧光信号的叠加图像。相比之下，PALM 图像则映射每个荧光点的 OID，仅显示每个蛋白质所在的位置。在进行扫描电镜成像之前，使用2.5%醋酸铀水溶液对切片染色4分钟。用过滤的Milli-Q超纯水彻底洗去醋酸铀。切片干燥后，使用溅射仪对盖玻片进行碳镀膜，直至其颜色变得较深。在一端将碳导电胶带贴在盖玻片边缘，在另一端贴在金属载物台上，以使积聚在盖玻片表面的电子接地。将盖玻片安装到扫描电镜腔室中，并在显微镜下定位样品。先获取样品的低倍图像，然后放大至感兴趣区域，获取高倍图像。使用新的切片重复此过程，直至所有切片均已完成成像。接下来，需对掌状图像和电镜图像进行对齐。首先，在 Photoshop 中打开已获取的扫描电镜（SEM）图像以进行对齐。创建一个尺寸为 5,000 × 5,000 像素、分辨率为每英寸 300 像素的新窗口。将加载放大倍数的扫描电镜图像复制到新窗口中。使用编辑菜单下的自由变换命令调整图像大小，使其充满整个窗口。然后复制高倍率的SEM图像，并根据需要进行缩放和变换。从图像下拉菜单栏中选择图像旋转，将总草皮图像水平翻转。将总草皮图像复制并粘贴到新图层中。使用编辑菜单下的自由变换命令缩放图像，使图像大小与低倍电子显微照片大致相同。然后根据需要旋转图像，使金颗粒的荧光与扫描电镜中观察到的相应结构对齐。接下来，将手掌图像复制到新图层，并应用相同的变换以提取更高倍数的图像。放大至目标区域，并从该区域复制手掌图像。将图像粘贴到更高分辨率的扫描电镜（SEM）图像中用于展示。应对手掌图像应用渐变透明度，使得只有黑色背景变为透明，而手掌信号保持不透明。将手掌变换图像复制到一个新图层。在“选择”下拉菜单中使用颜色范围，选中手掌信号部分，但不选中背景。然后选择一个背景像素作为参考，并启用反选选项。剪切所需的掌纹信号并将其粘贴到新图层。将背景图层设置为10%透明度，这可以在不损害信号强度的情况下通过使背景透明化来清晰显示掌纹信号。组蛋白蛋白。在秀丽隐杆线虫中稳定表达了带有 His 11 标签的 TD eos，转基因动物按照本视频中描述的方案进行处理和成像。从同一组织切片获取了荧光显微镜和电子显微镜图像。金纳米颗粒在荧光显微镜和电子显微镜图像中均可见，随后被用于对齐这两幅图像。我们在此放大显微照片顶部区域附近。如图所示，可观察到细胞核等亚细胞结构细节。可以观察到细胞核、核孔和内质网。然而，标记的组蛋白分子仅定位于细胞核内，而不在细胞核外。正如预期的那样，相关联的PALM显微镜与电子显微镜技术因此能够实现最高分辨率的蛋白质定位。完成该操作后，可将这些显示蛋白质分布的切片通过阵列断层成像技术进行叠加，从而构建出显示蛋白质在细胞内分布位置的三维结构。请记住，使用四氧化锇时要格外小心，因为它是一种非常危险的化学物质，操作时应始终佩戴手套。

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纳米有限元分析：蛋白质定位的光激活定位显微镜和电子显微镜

本视频介绍了BiFC-PALM技术——即光激活定位显微镜与双分子荧光互补技术的结合，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。双分子荧光互补（BiFC）技术涉及将两种目标相互作用蛋白分别与两个荧光蛋白片段融合。当这两个蛋白发生相互作用时，荧光蛋白片段被拉近至彼此邻近的位置，从而能够结合并重建出具有功能的完整荧光蛋白。通过PALM技术，可在单分子水平上对细胞内单个荧光分子的荧光信号进行精确定位。...

双分子荧光互补偶联光激活定位显微镜技术

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

光激活定位显微镜（PALM）结合单分子示踪技术，可直接观察并定量活体大肠杆菌（Escherichia...

利用光激活单分子示踪技术在活体细菌细胞中可视化蛋白质-DNA相互作用

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单纳米荧光成像（FIONA）

通过将双分子荧光互补（BiFC）与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在细胞中以纳米级空间分辨率可视化蛋白质-蛋白质相互作用。本文描述了在U2OS细胞中利用BiFC-PALM成像Ras-Raf相互作用，以观察单个Ras-Raf复合物的纳米级簇集和扩散行为。...

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

本文展示了如何在活体运动神经末梢上进行单分子光激活定位显微镜成像 黑腹果蝇...

体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

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活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

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用于超微结构完整细胞中膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

本实验方案描述了一种可克隆的电子显微镜标记技术，该技术利用基于新型自成核抑制机制的金纳米颗粒合成方法，用于检测细胞中金属硫蛋白标签蛋白。...

细胞内直接合成电磁可见金纳米颗粒用于超微结构良好保存的蛋白质定位分析

学习纳米有限元分析方法，利用光激活定位显微镜和扫描电子显微镜在转基因线虫中精确定位组蛋白。该技术克服了传统免疫电镜的局限性，为蛋白质亚细胞定位研究提供了高分辨率工具。

纳米级荧光-电子显微：利用光激活定位显微镜与电子显微镜进行蛋白质定位

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