Name: 在油脂中间相结构的测定生物大分子晶体生长的膜蛋白晶体收获和低温冷 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: 学习在脂质立方相和海绵相中收获膜蛋白晶体并进行低温冷冻的方法。本技术为结构生物学研究人员提供详细的操作流程，确保晶体完整性以用于X射线晶体学分析。

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许多人为本工作做出了贡献，他们大多来自Caffrey膜结构与功能生物学研究组，包括过去和现在的成员。在此，我们向所有贡献者，特别是谭景泉和Joseph Lyons，致以最诚挚的感谢与谢意。本工作部分得到了爱尔兰科学基金会（07/IN.1/B1836）、美国国立卫生研究院（GM75915、P50GM073210 和 U54GM094599）以及欧盟第七框架计划COST和玛丽·居里行动项目（CM0902 和 PIEF-GA-2009-235612）的资助。

1. 采收前实验室准备
<ol>
 <li>在准备收获晶体前，将干燥的泡沫杜瓦瓶装满液氮，并将其放置在即将进行晶体收获操作的显微镜旁。</li>
 <li>将储存卡夹（开口朝上）浸入泡沫杜瓦瓶内的液氮中，使其充分冷却。</li>
 <li>将一个尺寸与待收获晶体相匹配的微型载网固定在磁性取样棒上（图5）。应预先准备好多个已装载微型载网的备用磁性取样棒，以应对需要从同一块样品中收获多个晶体的情况。整个操作过程中应始终备有备用取样棒。</li>
 <li>将微量移液器、枪头以及用于晶体生长的沉淀剂溶液放置在收获用显微镜旁。在打开样品孔时，可能需要用这些试剂覆盖中间相以防止干燥。</li>
 <li>在实验台附近准备好笔记本和笔，和/或打开计算机，用于记录晶体在收获、冷冻冷却及储存过程中有关其质量、外观、位置、储存卡夹编号等方面的观察结果。</li>
 <li>如有助手协助进行晶体收获操作，该人员必须清楚了解将要遵循的实验方案、各步骤的执行顺序以及其在整体流程中的职责。</li>
</ol>
在准备好所有材料和设备后，我们的下一步任务是：
2. 鉴定含有晶体的培养板和孔
<ol>
 <li>寻找可收获晶体最简单直接的方法是使用显微镜在普通光和交叉偏振光下手动检查孔板。调节显微镜的照明光强度有助于定位晶体。</li>
 <li>或者，可使用成像仪对孔板进行自动扫描，通过普通光和交叉偏振光来检测晶体。</li>
 <li>在计算机显示器上目视评估所记录的数字图像。</li>
 <li>明确标记含有晶体的孔位以备收获，并在实验记录本或计算机中记录晶体在中间相中的大小、质量和位置等信息。</li>
 <li>将含有晶体的孔板从成像仪中取出，准备进行晶体收获。</li>
</ol>
3. 打开含有立方中间相的孔板。方法1
通过介相法（in meso）生长晶体所用的板为玻璃三明治板（图2）。为了接触介相及其中的晶体，需要打开孔洞。操作时使用玻璃切割工具切开密封孔洞的上层盖玻片，随后将其移除。
有多种方法可用于切割并移除覆盖在结晶小室上方的盖玻片，具体选择哪种方法取决于晶体生长所处的中间相类型。这种中间相可能是非常黏稠且具有黏性的立方相（图3A），也可能是其流动性更强的变体——海绵相（图3B）。在本视频文章中，我们将展示如何打开小室，并从这两种不同的宿主材料中收获晶体。
<ol>
 <li>将玻璃三明治式结晶板放置在光学显微镜的载物台上。</li>
 <li>使用玻璃切割工具，在隔片上方、孔周围略靠外的位置，用两个同心圆轻轻划痕。使用新的切割工具时，仅需施加极小的压力即可完成划痕。当所需划痕压力略有增加时，应立即更换为新工具；通常在打开10个孔后即会出现此情况。</li>
 <li>击碎两个划痕圆圈之间的玻璃区域，以释放内层盖玻片。此过程会产生大量玻璃碎片和粉尘，需用湿润的纸巾清除干净。</li>
 <li>用尖头镊子夹住已松动的盖玻片，将其倾斜并从孔上取下。此时，立方相仍牢固地附着在孔的基底板上。</li>
 <li>放大观察，以更清晰地查看现已准备就绪、可用于晶体收获的立方中间相。</li>
</ol>
4. 打开含有立方中间相的孔板。方法2
<ol>
 <li>使用玻璃切割工具在盖玻片上沿培养孔一侧划出贯穿孔本身的直线刻痕，以便更方便地用镊子接触并取出盖玻片。</li>
</ol>
在此特定操作中，当从黏性间隔层表面取下盖玻片时，盖玻片发生破裂。在此过程中，盖玻片位置发生偏移，且沉淀剂与立方相分离。当抬起盖玻片时，部分沉淀剂随之被带走，最终留下一块暴露的中间相团块，周围无任何沉淀剂。应立即使用微量移液器在该团块上方加入1 μl新鲜沉淀剂，以防止中间相干燥并发生相变，从而避免晶体受损。此时，该团块已可用于晶体 harvesting。
5. 打开含有海绵相的孔板。未成功
由于海绵相具有流动性，因此在操作上容错性较低。如果这种流动导致海绵相接触到孔板边缘，毛细作用会将中间相析出，从而导致晶体丢失。本视频片段展示了发生这种情况的示例。
<ol>
 <li>放大观察海绵相，并在普通光与交叉偏振光之间反复切换，以定位海绵相中的晶体。</li>
 <li>在准备打开孔洞时，按照第3节所述对盖玻片进行划痕和切割。在此过程中，盖玻片发生破裂。在尝试打开孔洞时，沉淀剂沿裂纹方向移动，最终与间隔层接触。随着沉淀剂的移动，部分海绵相及其所含的晶体也随之流失。</li>
</ol>
在此特定序列中，显微镜的偏光镜未完全正交，晶体可呈现为明亮的物体，同时仍可观察到孔板及其内容物。
6. 打开含有海绵相的孔板。成功完成
<ol>
 <li>放大观察海绵相，并在正交偏振光和普通光下识别晶体。</li>
 <li>按照第4.1节所述方法，划线、切割并移除覆盖在孔上的盖玻片部分。使用未完全交叉的偏振光以便追踪晶体位置。</li>
 <li>将一小片干燥的滤纸通过盖玻片的开口引入孔中，直至其轻轻接触沉淀剂溶液。小心地通过毛细作用吸走溶液，直到几乎完全除去，然后移除滤纸。此操作会使剩余的沉淀剂和海绵相（晶体仍位于其中）回缩至盖玻片下方。</li>
 <li>按照第4.1节所述方法，用镊子划线、切割并移除剩余的盖玻片。此时海绵相会发生分裂：一部分留在孔中，另一部分则附着在盖玻片上。晶体位于附着在盖玻片上的凝块中。由于残留的沉淀剂极少，海绵相开始发生相变，可能是因为脱水所致。这一过程表现为双折射环从凝块边缘向中心移动。应立即向凝块中添加沉淀剂以阻止相变。此时凝块已准备好用于晶体 harvesting。</li>
</ol>
7. 从立方相中收获并低温冷冻晶体
<ol>
 <li>在开放孔中来回切换正交偏振光与普通偏振光，以定位立方相团块中的晶体。在此视频序列中，使用正交偏振光可观察到立方相团块中最多四个双折射晶体。</li>
 <li>使用固定的冷冻环（图5) 探查新暴露的中间相中是否有晶体，捞取晶体，并将载有晶体的冷冻环迅速浸入杜瓦瓶中的液氮中 立即 收获后立即进行速冻。理想情况下，收获与速冻应作为一个连续且迅速的动作完成。收获晶体时应尽量减少附着的中间相物质。根据我们的经验，无需使用冷冻保护剂 在中间相中培养的晶体。 </li>
 <li>由于在收获后无法立即检查冷冻环中的晶体，因此应检查用于收获晶体的中间相团块，以确认晶体已不存在，表明晶体已被成功收获。 </li>
</ol>
8. 从海绵相中收获并低温冷却晶体
<ol>
 <li>在开放孔中来回切换正交偏振光与普通偏振光，以定位海绵相团块中的晶体。在此视频序列中，正交偏振光下可见团块内存在大量双折射晶体。 </li>
 <li>使用固定的冷冻环（图5用镊子从海绵相中捞出晶体，并将载有晶体的冷冻环迅速浸入杜瓦瓶的液氮中 立即 收获后立即进行冷冻。与从立方相中收获一样，理想情况下，晶体一旦收获应立即投入液氮中冷冻，收获操作与投入液氮之间的时间应尽可能短。收获晶体时应尽量减少附着的海绵相。如前所述，该过程无需使用冷冻保护剂。 在中间相中培养的晶体。 </li>
</ol>
9. 将晶体储存于杜瓦瓶中
<ol>
 <li>将装有晶体的环浸入液氮后，将其放入泡沫杜瓦瓶中储存盒的一个插槽内。所有操作均需在液氮中进行，确保环、磁棒顶端以及样品盒完全浸没于液氮中。</li>
 <li>在实验记录本和/或计算机中记录所收获并低温冷冻晶体的位置及相关信息。</li>
 <li>当泡沫杜瓦瓶中的样品盒已满或当天的晶体收获工作完成后，将该样品盒转移至装有液氮的储存或运输用杜瓦瓶内的层架式样品盒架中。晶体可通过运输用杜瓦瓶运送至同步辐射设施进行衍射数据收集。</li>
</ol>
10. 代表性结果
本实验中展示的晶体收获与冷冻冷却操作的目标是：将晶体从宿主介相中转移至冷冻环中，对套环中的晶体进行玻璃化冷冻，并将其置于液氮杜瓦瓶中保存。理想的情况是，收获与冷冻冷却过程能够保持晶体的衍射质量。收获晶体时应尽可能减少附带的介相物质。这样做可以降低在X射线束中定位和居中晶体的难度，加快冷冻冷却速度以实现玻璃化，并在衍射数据收集过程中最大限度地减少介相带来的背景散射干扰。图6展示了若干冷冻冷却样品的实例，其中部分样品中的晶体可见，部分不可见。当晶体无法通过肉眼观察时，通常需要借助衍射光栅扫描技术来寻找晶体，并将其居中于光束中以进行数据收集27。
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="细胞膜结构；示意图显示磷脂双分子层、蛋白质和分子。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 生物膜的示意图，显示脂质双分子层及其上分布的多种蛋白质。
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="微流控结晶装置示意图；96孔板，立方相，蛋白质结晶。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 一个完全装载并密封的96孔玻璃夹心结晶板。每个孔包含50 nl立方相和1 μl沉淀剂溶液。为便于观察，立方相用苏丹红染色，沉淀剂溶液中添加了亚甲蓝。引自参考文献5。
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="显微镜图像显示了用于结构分析的25 μm和30 μm尺度下的晶体微结构。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 膜蛋白在脂质介相中生长的晶体。A. 来自H. halobium的细菌视紫红质晶体所处的立方相。B. 含有来自E. coli的维生素B12受体/转运蛋白BtuB晶体的海绵相。引自参考文献25。立方相与海绵相的外观截然不同，通过比较图A与图B可明显看出。图A中的立方相极为黏稠，能够保持其原始形状，不会流动；这一点在介相团块边缘粗糙的外观上尤为明显。相比之下，海绵相黏度显著较低，具有流动性，因此无法维持其原始形状，其边缘通常光滑。含有Jeffamine、PEG 400、2-甲基-2,4-戊二醇、季戊四醇丙氧基化物、丁二醇和己二醇的沉淀剂可导致从立方相向海绵相的转变4,26。
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="蛋白质结晶流程图，详细说明步骤、阶段和实验结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 该流程图总结了在in meso条件下生长的膜蛋白晶体的制备、收获和低温冷冻过程中的各个步骤（A）。本JoVE文章仅涵盖由红色虚线框出并在（B）中详细描述的步骤。图A来自参考文献3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="电生理实验装置：膜片钳电极，移液管尖端。神经研究中的信号记录。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 一个空的冷冻环固定在针头上，针头由磁性操作棒固定。图中展示了该工具用于晶体 harvesting 和冷冻冷却的针头（A）和微载具（B）的放大视图。B 中微载具末端的空环直径为 30 μm。尽管我们尚未广泛测试其他类型的环，但我们发现所示的 MiTeGen 环在立方相和海绵相中均表现良好。
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="显示晶体生长的显微镜图像，带有测量标尺，突出显示25-50 µm尺度下的微观结构。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 在同步辐射光束线上通过在线显微镜观察到的、收获后冷冻冷却的膜蛋白晶体，晶体位于冷冻环中。A, B. 收获的晶体示例（caa3细胞色素氧化酶34（A），二酰基甘油激酶DgkA（B）），其中晶体（蓝色箭头）可通过冷冻冷却的中间相在冷冻环中清晰可见。C. 一个收获的晶体在冷冻环上的冷冻冷却中间相中不可见的示例。环的尖端以红色箭头标识，附着的冷冻冷却中间相以蓝色箭头标识。

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</ol>

无利益冲突声明。

在本视频文章中，我们演示了如何从脂质介相中生长的晶体进行收获并进行低温冷冻，以备用于衍射数据收集，最终用于结构测定。所用的宿主介相可能是黏稠且具有黏性的立方相，也可能是流动性更强的海绵相4。玻璃三明治板的开启方式以及晶体的收获方法在很大程度上取决于介相的类型。因此，提前明确所使用的是哪一种介相至关重要。在此方面，宿主脂质的种类以及所用的沉淀剂均具有重要意义，同时可通过观察结晶孔中介相团块的物理外观来加以区分（图3）。本文已对两种介相类型的晶体收获方法进行了演示。
从玻璃三明治板中的脂质介相中收获小晶体是一个费力的过程，需要时间、技巧、经验、耐心和稳定的手法。应预留足够的时间用于收获操作，并提前布置好实验室，确保所有耗材和设备都触手可及。收获过程中不一定需要第二人协助，但建议配备。助手可协助提供预先标记好的板，并将已收获晶体的冷冻环放入储存盒中。此外，助手还可协助记录收获过程中对晶体的观察结果，这些信息可能在后续衍射数据收集中起到关键作用。若无助手，可使用语音激活的录音设备进行有效记录。
遵循本文所述方案将有助于启动 Viewer 并进行晶体收获。然而，需要注意的是，该过程并不简单，在开始收获珍贵的膜蛋白晶体之前，必须经过练习。因此，建议首先使用含有非重要蛋白晶体的测试板进行实验。这将使初学者获得切割玻璃、清除玻璃碎片、从中间相上方提起盖玻片、利用显微镜的偏光功能观察晶体并在收获过程中追踪晶体，以及处理不同类型中间相并从中收获晶体的宝贵经验。中间相的质地及其晶体收获的难易程度在结晶过程中会随时间发生变化。因此，使用与珍贵晶体在相同条件下生长但价值较低的晶体进行练习至关重要。可以通过 in meso 或脂质立方相方法28培养溶菌酶和甜蛋白的晶体，以熟悉相关材料和方法。此外，还应考虑先使用不含蛋白的中间相进行操作，以了解其特性变化。
本文所展示的所有操作均在约 20 °C 的舒适温度下进行。通过 in meso 法在较低温度下生长晶体也是可行的。因此，作为载体脂质的单油精在亚稳相状态下可在 4 °C 下使用1,2,29,30。另一种选择是使用经合理设计的 7.9 MAG 以实现低温结晶31。我们对某些膜蛋白靶标常规性地进行低温结晶实验。在此情况下，晶体的生长与收获均在可步入式 4 °C 冷藏室内完成。在这种条件下操作存在其特有的挑战，其中最不容忽视的是需要穿着保暖且舒适的衣物。
使用大分子晶体学进行结构测定的整体流程中，下一步是对本文章所述方法收获并快速冷却的晶体收集衍射数据。原位生长的晶体通常较小，但已有研究表明，最大尺寸为20 μm的晶体仍可获得有用的衍射数据9。为此，需使用微束同步辐射X射线，该技术也是本系列另一篇JoVE文章的重点内容32,33。

<table><tbody><tr><td>弯头镊子</td><td>Sigma</td><td>F4142</td><td>工具</td></tr><tr><td>一次性移液器吸头</td><td>Gilson</td><td>Various</td><td>耗材</td></tr><tr><td>泡沫杜瓦瓶</td><td>Spearlab</td><td>FD-500</td><td>工具</td></tr><tr><td>玻璃和金属废弃物容器</td><td>Daniels Healthcare</td><td>DD479OL</td><td>工具</td></tr><tr><td>收获环</td><td>MiTeGen</td><td>Various</td><td>工具</td></tr><tr><td>收获显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>工具</td></tr><tr><td>实验记录本</td><td>Various</td><td>NA</td><td>工具</td></tr><tr><td>磁性按钮式样品装载棒</td><td>Hampton Research/Molecular Dimensions</td><td>HR4-729/MD7-411</td><td>工具</td></tr><tr><td>原始型Puck（仅适用于ALS型机器人）</td><td>Crystal Positioning Systems</td><td>CP-111-035</td><td>工具</td></tr><tr><td>移液装置</td><td>Gilson</td><td>Various</td><td>工具</td></tr><tr><td>沉淀剂溶液</td><td>Various</td><td>Various</td><td>试剂</td></tr><tr><td>弯曲型Puck冷冻钳</td><td>Crystal Positioning Systems</td><td>CP-111-030</td><td>工具</td></tr><tr><td>带钩手柄和锁杆的架式Puck运输 cane（原始ALS型）</td><td>Crystal Positioning Systems</td><td>CP-111-029</td><td>工具</td></tr><tr><td>纯化水</td><td>Millipore</td><td></td><td>试剂</td></tr><tr><td>安全护目镜</td><td>Various</td><td>NA</td><td>工具</td></tr><tr><td>样品针基座 - 磁性（非铜制）</td><td>Crystal Positioning Systems</td><td>CP-111-015</td><td>工具</td></tr><tr><td>运输用杜瓦瓶</td><td>Taylor-wharton</td><td>CX100</td><td>工具</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>NA</td><td>NA</td><td>耗材</td></tr><tr><td>碳化钨玻璃切割器（TCT Scriber）</td><td>Silverline Tools (Yeovil, UK)</td><td>633657</td><td>工具</td></tr></tbody></table>

从脂质介相中生长的膜蛋白晶体的收获与冷冻冷却用于大分子晶体学结构测定

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

在机制层面上理解蛋白质功能的一个重要途径是获得目标蛋白质的结构，理想情况下应达到原子分辨率。目前，对于整合膜蛋白（图1）及其所形成的复合物，只有一种方法能够获取此类信息，即大分子X射线晶体学（MX）。进行MX研究需要获得可用于衍射的高质量晶体，而膜蛋白通常难以形成此类晶体。近年来，一种利用脂质介相（特别是立方相和海绵相）来结晶膜蛋白的方法引起了广泛关注，因其在G蛋白偶联受体领域的多项成功案例而备受瞩目1-56-21（<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>）。然而，这种方法（下文简称in meso法或脂质立方相法）也带来了特有的技术挑战。部分困难源于脂质介相本身通常具有高黏性和黏附性，晶体（常为微晶）即在此环境中生长。这使得晶体操作变得困难，尤其是在收获过程中22,23。此外，在收获前的步骤中也存在问题：需要打开用于晶体生长的玻璃三明治板（图2）24,25，以暴露含有晶体的介相团块，进而进行收获、冷冻冷却以及最终的X射线衍射数据收集。
必须收获晶体的立方相和海绵相介晶相变体（图3）具有截然不同的流变特性4,26。立方相黏稠且具有黏性，类似于浓稠的牙膏；而海绵相则更为流动，具有明显的流动性。因此，针对含有在立方相和海绵相中生长晶体的结晶井，需要采用不同的开启方法，同样地，从这两种介晶相中收获晶体也需要不同的技术。这些操作方案已在膜结构与功能生物学（MS&amp;FB）研究组中经过优化并实施，并在本JoVE文章中进行了详细描述（图4）。文中举例说明了成功收获晶体并进行低温冷冻的情况，同时也提供了因出现问题而导致晶体无法挽回丢失的实例，并阐述了如何避免这些问题。本文为读者提供了逐步操作指南，涵盖如何打开玻璃三明治式结晶井、如何收获以及如何对在立方相和海绵相中生长的膜蛋白晶体进行低温冷冻。

本文描述了Caffrey膜结构与功能生物学研究组采用的实验步骤，用于收获在脂质立方相和海绵相中生长的膜蛋白晶体，并将其冷冻冷却，以用于大分子X射线晶体学方法进行结构解析。

理解蛋白质在分子机制层面发挥作用的重要途径之一，是获得目标蛋白质的结构信息，理想情况下应达到……

您好，欢迎来到膜结构与功能生物学研究组。我是 Martin Caffery。这是 JoVE 关于使用介观内相法（in meso）或立方相脂质法结晶膜蛋白以进行结构测定的系列文章之一。在第一篇文章《Jo of 1 7 1 2》中，我们演示了如何制备富含蛋白质的立方相，以及如何将粘稠且具有黏性的介相手动分配至玻璃三明治式结晶板中，以进行结晶实验。本视频文章将介绍通过介相法生长晶体后的收获与冷冻冷却方法。此处展示了在介相中生长晶体所需进行收获和冷冻冷却的材料与设备。它们包括用于记录晶体信息和收获细节以供将来参考的实验记录本、安全护目镜、玻璃和金属废弃物容器、用于收获晶体的玻璃三明治式结晶板。含有晶体的孔需清晰标记，还需准备用于打开结晶孔的玻璃切割工具、纸巾和水瓶、弯头镊子、沉淀剂筛选溶液、移液器及吸头、用于收获晶体的冷冻环、磁力棒、用于存放含晶体冷冻环的存储盒、装有液氮的泡沫杯以用于晶体的冷冻冷却、镊子、运输或储存用杜瓦瓶以及收获晶体用的显微镜。在准备收获晶体之前，应提前将液氮罐装满液氮，并放置在即将进行显微操作的显微镜旁。将储存载具（puck）开口朝上浸入液氮罐中的液氮内，使其充分冷却。选择与待收获晶体大小相匹配的冷冻环，将其固定在磁性操作杆的微型支架上，并确保所有材料和设备均已就位。接下来的任务是识别含有晶体的培养板及孔位。我们可以通过以下两种方式之一来实现。最简单且最直接的方法是使用显微镜，在普通光和偏振光下人工检查孔板。第二种方法则是利用成像仪，通过普通光和偏振光对孔板进行自动筛选。成像仪记录数字图像，并在计算机显示器上进行评估。应清晰标记含有待收获晶体的孔。关于图像中晶体的大小、质量和位置的备注，应记录在实验记录本或计算机中。这将有助于在收获阶段的操作。此处，将含有待收获晶体的培养板从成像仪中取出，打开培养孔。通过末端微流法（meso method）生长晶体的培养板为玻璃三明治结构，类型如图所示。为了接触微流通道（mease）及其内部的晶体，必须打开培养孔。通过使用玻璃切割工具切开密封孔的上层盖玻片，随后将其移除。实现此操作有多种方法，具体采用哪种方法取决于晶体生长所处的结晶板类型。这可能是非常黏稠的立方相，或是其流动性较强的变体，即所谓的海绵相。在本视频文章中，我们展示了如何打开样品池并从这两种承载材料中收获晶体。在此段视频中，我们演示了在含有黏稠立方相的样品池上对盖玻片进行划线的两种方法。通过光学显微镜观察，可以详细展示评分和切割过程。我们首先检查一个结晶孔，并识别其不同部分。第一个红色箭头指向含有晶体的胰蛋白酶团块。需要注意的是，在此特定序列中无法观察到晶体。第二个箭头指向包围着液滴的沉淀剂溶液。第三个箭头指向孔的边缘。第四个箭头指向双棒状垫片，盖玻片借助玻璃切割刀放置其上。使用玻璃切割刀在孔边缘稍外的位置沿两个同心圆对盖玻片进行轻划刻痕。然后用玻璃切割刀将两个刻痕圆之间的玻璃部分击碎去除。为了释放内层盖玻片，此步骤会产生大量玻璃碎片和粉尘，可用湿润的纸巾擦拭清除。松动的盖玻片沿其圆形边缘搁置在隔片上。用尖头镊子夹住盖玻片，将其倾斜并从孔中移出即可取下。在这种情况下，立方相停留在孔底部并保持原位。部分沉淀剂随盖玻片被移除，但仍有相当一部分沉淀剂保留在团块周围。放大后，可以更清晰地观察到立方相团块，此时已可用于晶体 harvesting。在接下来的步骤中，我们展示第二种打开含有黏稠立方相的结晶井的方法。在此情况下，于结晶井一侧的盖玻片上制作额外的直线划痕和杯状刻痕，这些刻痕延伸至井的边缘。这使得镊子更容易接触并移除盖玻片。在此特定演示中，盖玻片发生破裂，在将盖玻片从粘性空间或表面分离时，盖玻片本身发生移动，且沉淀物与立方相分离。当抬起盖玻片时，部分沉淀物随之被带走。插图展示了该过程的缩小视图。现在，麻疹病毒团块暴露在外，周围没有沉淀剂保护，可能导致病毒团块脱水并发生相变，从而损坏晶体。使用微量移液器在团块上方加入新鲜的沉淀剂。此时，该团块已准备好用于晶体收获。由于海绵相具有流动性，因此在操作时容错性稍差。如果这种流动导致海绵相接触到孔板边缘，溶液会被吸出，从而导致晶体丢失。下一个视频片段展示了这种情况的发生实例。首先放大观察海绵相，然后在普通光与交叉偏振光之间来回切换。在普通光下难以辨认的晶体，在交叉偏振光下则清晰可见，表现为黑色背景上的明亮弯曲条纹。为准备打开孔板，按照上述方法对盖玻片进行划痕并切割。然而，在此过程中，盖玻片在不应破裂的位置发生了开裂。尽管进行了一些操作试图继续打开孔洞的步骤，但沉淀剂向裂纹方向移动，最终与间隔层接触；更不巧的是，部分海绵相及其所携带的物质也随之进入沉淀剂中。当然，在该特定序列中，显微镜的偏光镜并未完全交叉，因此晶体呈现为明亮的物体，同时仍可清晰观察到孔洞及其内容物。在下一个片段中，我们展示了如何通过首先去除过量的沉淀剂来解决该问题。我们从放大观察海绵相开始，分别在普通光线下和交叉偏振器之间识别出一颗晶体，将盖玻片的一部分刺穿并切割，然后小心地从上方移除。再次使用不完全偏振光来观察晶体，此时晶体清晰可见并呈现出良好的发光效果。将一小片干燥的滤纸从盖玻片的开口处引入并插入孔中，直至其刚好接触到沉淀剂溶液。小心地通过毛细作用将溶液吸走，直至几乎完全除去，此时海绵相开始向滤纸方向移动。移除滤纸后，残留的沉淀剂以及含有晶体的海绵相会随之回缩至盖玻片下方。为便于理解，此处以慢动作重复显示最后这一序列。其余的盖玻片被划开并切割。如前所述，现在用镊子将盖玻片取下。插图展示了该过程的宏观视图。在本例中，海绵相分裂后，部分残留物留在孔板中，另一部分则附着在盖玻片上。结果发现，晶体位于盖玻片上的团块中，可通过交叉偏振器观察到。晶体在海绵相中清晰可见，但由于沉淀剂含量极少，晶体开始发生相变，可能是由于干燥所致。这一现象表现为向液滴中心移动的生物条纹环。通过向液滴中添加沉淀剂，可以阻止并逆转这一过程，为下一步晶体收获做好准备。打开孔板并暴露含有Misa相后，接下来的步骤是收获晶体。在接下来的片段中，我们将展示从立方相和海绵相中收获晶体的示例。在显微镜下检查新打开孔板中的mea相，以定位合适的晶体。在普通光与偏振光之间反复切换可极大辅助此过程。应预先准备好沉淀剂溶液，以便随时添加至液滴中，减缓或阻止其干燥。随后，使用已安装的冷冻环探取新暴露的黏稠相，从中捞取晶体，并在收获后立即将载有晶体的冷冻环迅速浸入杜瓦瓶中的液氮内。接下来，我们将展示从黏稠且具有黏性的立方相中进行收获的过程，在此收获序列中最多可获得四个生物膜干涉条纹，使用偏振光可在立方相团块中观察到晶体。从右侧插入的冷冻环尽可能少地沾取周围基质，迅速捞取晶体后立即进行冷冻冷却，并将冷冻环置于液氮中的储存卡具内。在此视频片段中，该收获过程重复进行了三次。每次使用偏振器检查晶体的位置。由于在收获后无法观察悬丝环中的晶体，因此最好检查晶体所来源的 Mesa 相，以确认晶体已不再存在，这表明晶体已被成功收获。在接下来的步骤中，展示了从流动性更强的海绵相中进行收获的过程；与立方相类似，应尽量减少收获并保留在晶体上的海绵相物质。围绕晶体的冷冻环中物质越多，就越难用肉眼定位晶体。在进行衍射数据收集时，这将导致更多的背景散射，从而在衍射测量过程中产生干扰。在接下来的步骤中，我们将展示冷冻冷却过程，该过程应立即进行。在实际收获晶体后，应尽可能缩短时间，立即将其浸入液氮中。将安装好晶体的环浸入液氮后，将其置于门上储存卡盒的其中一个存放槽中（本例中为1号位置），并从磁性取样棒上释放。此时，应将已收获并进行冷冻冷却的晶体的位置和详细信息记录在实验记录本或计算机中。当泡沫抽屉中的载物盘已装满，或当天的晶体收集工作完成后，将载物盘转移至装有液氮的储存或运输用J型架中的分层载物盘架内。接下来的两张图片显示的是已收集的、处于低温环中的低温冷却晶体。按照上述方案，可以清楚地看到晶体位于环内的玻璃化相中。然而，在此情况下晶体不可见，必须通过衍射扫描来定位。利用大分子晶体学进行结构测定的整体流程中的下一步，是收集本篇文章所展示的已收获晶体的衍射数据。这一步骤通常使用同步辐射X射线完成，也是本系列另一篇JoVE文章的重点内容。

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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