Name: 诱导多能干细胞来源于小鼠的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 了解通过四倍体胚胎互补技术从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞并培育成年小鼠的完整实验流程。该方法可验证iPSC的全能性，为干细胞生物学研究提供可靠的技术方案。

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KKB、MJB、JLH 和 KLN 获得了加州再生医学研究所、佩韦慈善信托生物医学学者计划、埃丝特·B·奥基夫家族基金会以及夏皮罗家族基金会的支持。KKB 是唐纳德·E·和德莉娅·B·巴克斯特基金会的教职学者。

该方法已用于Boland报道的研究中 等 自然. 461, 91-96 (2009).1
1. 慢病毒的制备
本方案采用可由多西环素诱导的慢病毒穿梭载体，该载体在四环素反应元件（tetO）的调控下编码 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc。转基因的表达由反向四环素转录激活蛋白 rtTAM2.216 激活，该蛋白在多西环素存在时可诱导重编程因子的表达。该系统可实现对重编程因子表达的严格调控并达到高水平表达。此处使用的慢病毒载体为自我失活型，因此在整合入基因组后无法复制。然而，操作慢病毒时需格外谨慎，实验应在符合美国 BSL2 和欧洲 S2 标准的实验室中进行。
<ol>
	<li>解冻 HEK293T 细胞，并在转染前至少传代一次。细胞应在含 HEK 培养基的湿润环境中，于 37 °C、5% CO2 条件下维持在亚融合密度。常规每 2 天传代一次，传代比例为 1:6 至 1:10。</li>
	<li>在每个 T150 培养瓶中接种约 8 × 106 个 HEK293T 细胞，并加入 25 ml HEK 培养基。每种慢病毒制备使用一个 T150 培养瓶。</li>
	<li>次日采用磷酸钙沉淀法转染 HEK293T 细胞。（注意：本实验室常规使用磷酸钙沉淀法，转染效率通常可达 80–90%；但也可使用阳离子脂质转染试剂，如 Lipofectamine 2,000）。为每种待制备的病毒准备两个 15 ml 圆锥形离心管，分别标记为“A”和“B”。在 A 管中加入：编码重编程因子（或 rtTAM2.2）的慢病毒穿梭载体、病毒包装载体以及编码病毒包膜蛋白 VSVg 的质粒，各 10 μg。向 A 管中加入 186 μl 2 M CaCl2，再用无菌 H2O 补充至总体积 1.5 ml。B 管中加入 1.5 ml 2x HBS（预先温至室温）。</li>
	<li>用移液器反复吹打 A 管中的混合液，使其成为均一溶液。将 A 溶液逐滴加入 B 溶液中，室温静置 2–3 分钟。</li>
	<li>吸除 HEK293T 细胞的生长培养基，更换为 22 ml 预先温热且不含青霉素和链霉素的 HEK 培养基。</li>
	<li>将混合后的 AB 溶液（磷酸钙沉淀物）直接滴加至 HEK293T 细胞中，并通过轻轻摇晃使溶液均匀分布。</li>
	<li>HEK293T 细胞转染慢病毒 24 小时后，移除旧培养基，更换为 25 ml 新鲜预热的 HEK 培养基。将转染后的 HEK293T 细胞放回培养箱继续培养。</li>
	<li>转染 48 小时后，收集含有慢病毒颗粒的细胞培养上清液。于 4 °C 条件下，以 3,000 × g 离心 5 分钟，去除收获病毒液中的颗粒状杂质。</li>
	<li>通过在 20% 蔗糖垫（每 25 ml 病毒上清液加 2 ml 蔗糖）中进行超速离心，于 4 °C、112,000 × g 条件下离心 2 小时，浓缩病毒。将病毒沉淀物在 4 °C 条件下，用 0.4 ml MEF 培养基轻柔振荡重悬 15–30 分钟。将病毒颗粒分装成单次使用的小份（i.e. 50 μl），于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
2. 重编程用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的制备
注意：此处所述方案涉及从小鼠 E 13.5 胚胎成纤维细胞中诱导生成诱导性多能干细胞（iPSC），用于胸腺上皮细胞（TEC）检测。尽管其他研究团队已利用成年供体细胞来源成功获得完全由iPSC发育的小鼠，但我们尚未在其他细胞类型上测试该方法，因此无法确定供体细胞类型是否会影响实验结果。
<ol>
	<li>设置小鼠定时交配。在胚胎发育第13.5天（E13.5），处死怀孕雌鼠，从子宫角中分离出胚胎。将胚胎置于预冷至4 °C的1×PBS中，并在冰上放置和保存。</li>
	<li>去除胚外组织（即 绒毛膜、羊膜和胎盘）。切除胚胎头部，并移除尾部（可选——如需进行基因分型时）和四肢。用镊子或勺状刮匙挖出内脏器官，再用手术刀片或锋利的剪刀将剩余的躯体组织切碎。</li>
	<li>用5 ml预冷的1×PBS洗涤绞碎的尸体。在200 × g下离心5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液。将沉淀物重悬于5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA中，于37 °C剧烈振荡孵育20–30分钟。</li>
	<li>加入5 ml MEF培养基（预热至37 °C），混匀后以200 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，并将沉淀重悬于预热的MEF培养基中。</li>
	<li>将解离的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种至预先用0.1%明胶包被的6孔板中的2-3个孔内。此为第1代传代。</li>
	<li>每48小时以1:4至1:5的比例传代MEF细胞。第3代MEF细胞可用于慢病毒转导。</li>
</ol>
3. 诱导多能干细胞系的建立
<ol>
	<li>慢病毒转导前一天：将约 3 × 105 个原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）接种至已用 0.1% 明胶预包被的 6 孔板中的一个孔内。</li>
	<li>第 1 天：原代 MEF 应达到 80–90% 汇合度以进行慢病毒转导。将慢病毒颗粒直接加入 MEF 培养基中，并在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育过夜。</li>
	<li>次日（第 2 天），吸除培养基，用 3 ml 1× PBS 洗涤两次，以去除病毒颗粒。</li>
	<li>向细胞中加入 0.5 ml 预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 3–5 分钟，期间偶尔轻轻摇动。</li>
	<li>吹打混匀以获得单细胞悬液。通过光学显微镜观察，确认形成单细胞悬液。</li>
	<li>将 MEF 转移至含有 5 ml MEF 培养基的 15 ml 圆锥形离心管中，以 200 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，轻柔地将细胞重悬于 MEF 培养基中。</li>
	<li>将细胞悬液均匀分至两个已用 0.1% 明胶预包被的 6 孔板孔中。</li>
	<li>前后、左右轻轻摇动培养板，并做一次环形晃动，使细胞在孔内均匀分布。在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育过夜。</li>
	<li>第 3 天：重复步骤 4–9，但将细胞从一个孔均匀分至三个已用 0.1% 明胶预包被的 6 孔板孔中。最终可获得 6 孔转导后的原代成纤维细胞。</li>
	<li>第 4 天：向 5/6 的孔中加入浓度为 10 μg/ml 的多西环素（dox）。保留一个孔不加处理，作为对照。</li>
	<li>向其中 3 个已加 dox 的孔中加入 1.9 mM 的丙戊酸（VPA）。VPA 可降低 MEF 的增殖速率。高密度培养的 MEF 可耐受较长时间的 VPA 处理，而未达到汇合的培养物通常在 2–5 天内发生衰老。因此，添加 VPA 时 MEF 应达到 100% 汇合度。注意：我们在重编程实验中使用 VPA，因其是一种已知的表观遗传修饰剂，已被证明可提高诱导性多能干细胞（iPSC）的生成效率17，但 VPA 在生成完全多能性 iPSC 细胞系过程中的具体作用机制尚不明确。</li>
	<li>第 5 天：吸除培养基，按前述方法洗涤并进行胰蛋白酶消化。将经 dox/VPA 处理的细胞传代至已用 0.1% 明胶预包被的 15 cm2 组织培养皿中，其余各组分别传代至预包被的 10 cm2 培养皿中，均使用添加新鲜 dox 和 VPA 的胚胎干细胞（ES）培养基。</li>
	<li>每天补充添加新鲜 dox 和 VPA 的 ESC 培养基。在 dox/VPA 处理组中，约 7 天后开始出现类似 ESC 的克隆；在仅 dox 处理组中，约 10 天后开始出现克隆。未加 dox 的组中不应出现任何克隆。</li>
	<li>当克隆呈现明亮折光性、边界清晰且包含 30–50 个细胞时，使用加样枪头手动挑取克隆，转移至含有 20 μl 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 的 U 型底 96 孔板中。消化为单细胞后，转移至平底 96 孔板中的饲养层细胞上，加入 150 μl 含 dox/VPA 或仅含 dox 的 ESC 培养基。</li>
	<li>继续在饲养层细胞上使用 ESC 培养基对分离的 iPSC 克隆进行扩增。在添加 dox 和 VPA 后的第 19 天（转导后第 23 天）去除 dox 和 VPA。弃除无法维持与 ESC 对照组相似的自我更新能力或增殖速率的 iPSC 克隆。</li>
</ol>
在尝试进行 TEC 之前，将您的 iPSC 系与 ESCs 进行比较表征可能会有所帮助。我们通过以下方法对细胞系进行了表征：1）通过免疫细胞化学检测内源性多能性标志物（SSEA-1、Oct4、Sox2、Nanog）的表达；2）通过染色体计数进行核型分析；3）拟胚体形成能力。此外，也可进行慢病毒特异性 RT-qPCR 检测，以确认前病毒转基因在 iPSC 中未表达。然而，我们在实验中仅通过形态学、免疫染色和核型分析即鉴定了完全多能性的 iPSC。在我们的实验中，基于类似 ESC 的形态和生长特性筛选 iPSC 系，可使大多数细胞系表达多能性标志物，但通常也会发现若干可能存在异常核型的细胞系。
4. 准备受精卵注射的诱导多能干细胞
已证明PSC细胞系的传代次数会影响其多能性18，尽管这种影响可能因细胞系而异19。我们使用第8–14代的iPSC建立了完全来源于iPSC的成年小鼠。
<ol>
	<li>解冻iPSCs，并将其接种于饲养层细胞上，使用ESC培养基进行培养。在用于注射前，至少需在饲养层细胞上传代一次。</li>
	<li>一个6孔板中的1个孔，若含有70–80%融合度的iPSCs，即可提供足量用于注射的细胞。吸除生长培养基，并用约3 ml 1× PBS（不含Ca2+/Mg2+）洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞中加入0.5 ml预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育10分钟，期间偶尔轻轻摇动。</li>
	<li>反复吹打以获得单细胞悬液。通过光学显微镜观察，确认细胞呈单细胞状态。iPSCs必须为单细胞悬液，因为细胞集落或细胞团块会堵塞注射移液管。</li>
	<li>一旦获得单细胞悬液，立即向孔中加入1.0 ml ESC培养基，并将培养板放回37 °C培养箱。继续孵育约15分钟，或直至大部分饲养层细胞开始贴壁。</li>
	<li>轻柔地吸除含有iPSCs的上清液，注意避免扰动贴附较弱的饲养层细胞。</li>
	<li>将iPSCs转移至含有5 ml ESC培养基的15 ml锥形离心管中，以200 × g离心5分钟。吸除上清液，并用微量移液器彻底去除残留的ES细胞培养基。轻敲离心管使沉淀松散，然后在0.2–0.5 ml预冷的FHM培养基中轻柔重悬细胞。在注射入四倍体囊胚前及注射过程中，均需将细胞置于冰上保存。</li>
</ol>
5. 四倍体囊胚的制备
本节所述操作步骤已在其他文献中详细描述5,6,20。此处我们概述针对BTX电细胞操作仪ECM 2001优化的技术方法。
<ol>
	<li>通过使用PMS和HCG对23至28日龄的雌性小鼠（C57BL/6J-Tyrc-2J/BALB/cByJ F1）进行超排处理来准备胚胎供体小鼠。在下午2点注射5 IU的PMS，47小时后注射5 IU的HCG。注射HCG后，将雌性小鼠与C57BL/6J-Tyrc-2J/BALB/cByJ F1种公鼠合笼交配。次日检查阴道栓。</li>
	<li>处死发现阴道栓的雌鼠并取出输卵管。将输卵管置于含透明质酸酶的FHM培养基中，轻轻撕开壶腹部以收集单细胞期胚胎。让卵丘细胞团在FHM/透明质酸酶溶液中孵育5–7分钟。</li>
	<li>使用口吸管收集单细胞期胚胎，并在FHM培养基液滴中清洗，随后转移至KSOM-AA培养液中。于37 °C、5% CO2条件下，在矿物油下过夜培养，并在电融合当天选择处于双细胞期的胚胎，丢弃其余所有胚胎。</li>
	<li>将BTX微型载片放入10 cm的培养皿中。加入足够量的室温电融合液，使载片完全浸没于溶液中，但避免电极的金属极板完全被淹没。</li>
	<li>打开ECM 2001和BTX Enhancer 400电源。将ECM的电缆连接至微型载片的电极上，并将电缆固定在培养皿侧壁，以防载片意外移动。</li>
	<li>执行一次手动脉冲，以获取BTX增强器的读数，并记录所施加的交流（AC）和直流（DC）电流电压值。交流电流控制胚胎在电极间排列的速度，直流电流用于融合卵裂球，脉冲时间决定直流脉冲的持续时间。推荐起始参数为AC 3 V、DC 100 V、时间0.05毫秒。最佳直流电压通常在90–150伏范围内变化。</li>
	<li>使用口吸管从KSOM-AA培养液中取出约30–40个双细胞期胚胎，依次通过数滴电融合液进行清洗。从微型载片培养皿中吸取新鲜电融合液至口吸管，吸取清洗后的胚胎，将其置于微型载片上两电极之间1 mm的间隙中。注意确保胚胎位于间隙中央并沿中线排列，且彼此之间不接触。</li>
	<li>按下手动脉冲按钮施加交流电流。胚胎将在交流电场中旋转，直至卵裂球接触面与电极平行。若数秒内胚胎未完成排列，可适当提高交流电压。</li>
	<li>待胚胎排列整齐后，再次按下手动脉冲按钮施加直流脉冲以实现融合。</li>
	<li>用含有电融合液的吸管从微型载片上回收胚胎，依次通过数滴KSOM-AA培养基清洗后，置于KSOM-AA培养液中，在37 °C、5% CO2条件下继续培养。卵裂球融合过程应在培养30分钟内完成。</li>
	<li>对剩余的双细胞期胚胎重复步骤7–11。每次融合后，观察并筛选出已融合的胚胎。成功融合的胚胎将呈现单细胞形态。培养30分钟后，丢弃发生裂解或仍保持双细胞状态的胚胎。若融合率低于80%，可逐步增加电压和/或脉冲时间（每次增加5 V和0.01毫秒）；若裂解率超过20%，则相应降低直流电压和/或脉冲时间。在我们的实验中，最佳参数为AC 4 V、DC 146 V、时间0.07毫秒，该设置下融合率稳定达到90%以上，且几乎无细胞裂解。</li>
	<li>继续将融合后的胚胎在矿物油覆盖下的KSOM-AA微滴中，于37 °C、5% CO2条件下培养。预计在培养48小时后，85–95%的融合胚胎可发育为四倍体（4n）囊胚。</li>
</ol>
6. 将诱导多能干细胞显微注射至四倍体囊胚中
我们使用配备微分干涉差（DIC）光学系统和Narishige显微操作仪的尼康TE-2000U倒置显微镜进行囊胚注射。每个四倍体囊胚均按照此前JoVE发表文献中已验证的小鼠囊胚ESC注射标准方案，注射10–12个诱导多能干细胞（iPSCs）5,20,21
<ol>
	<li>在凹面载玻片中央放置一滴 20 μl 的 FHM 液滴，并覆盖 150 μl 矿物油。</li>
	<li>将持卵管和显微注射针插入 FHM 液滴中，静置 2–3 分钟，使两根针尖部分吸入 FHM 液体。</li>
	<li>将 20–30 个四倍体囊胚依次通过 FHM 液滴洗涤后，转移至载玻片上的 FHM 液滴中。</li>
	<li>用口吸移液管将 iPSC 混合液吹入液滴中。若细胞浓度过高或发生聚集，可先在 FHM 液滴中适当稀释细胞混合物。</li>
	<li>用注射针吸取 100–200 个细胞。</li>
	<li>用持卵管固定囊胚，使内细胞团位于 9 点钟位置；在 3 点钟位置穿透透明带和滋养层，将细胞注入囊胚腔，每个囊胚注射 16–18 个细胞。</li>
	<li>将注射 iPSC 的囊胚放回 KSOM-AA 培养液中继续培养。</li>
</ol>
7. 将互补的四倍体囊胚移植到受体小鼠的子宫角中
根据研究人员所在机构的指导原则，采用标准技术20将补全的四倍体囊胚通过手术移植到雌性受体小鼠的子宫角，该技术简要总结如下：选择处于动情前期的雌性CD-1小鼠，与输精管结扎的雄鼠合笼交配。次日早晨检查阴道栓。在检测到阴道栓后两天（2.5 dpc），雌鼠即可进行子宫胚胎移植。
在受体雌鼠与结扎雄鼠交配前一日，另安排CD-1雌鼠与未结扎雄鼠合笼，用于作为通过剖宫产获取的全iPSC小鼠的代孕母鼠。
8. 诱导多能干细胞来源仔鼠的剖腹产与寄养
TC 胚胎的移植通常在着床后会出现多次吸收现象，即使 iPSC 或 ESC 细胞系具有较高的发育潜能也是如此。因此，每只受体小鼠通常只能获得不超过 4 只存活的仔鼠（一般为 1-2 只）。这些产仔数量较少的窝仔通常会被受体母鼠忽视。为了提高新生仔鼠的护理水平和存活率，我们按照标准方案进行剖腹产和寄养20。进行剖宫产时，于胚胎移植后第 16 天晚上 7-8 点（受体相当于 18.5 天胚胎期）对受体小鼠实施安乐死，并从子宫角中分离出仔鼠。将存活的仔鼠寄养给同日分娩的 CD-1 母鼠哺育。

<ol><li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

利用TEC检测法通过iPSC系生成小鼠，可对iPSC系的多能性提供严格的体外功能验证。该检测可用于评估不同重编程方法的相对效率，或筛选出在生成特定细胞类型方面最具应用价值的iPSC系。 体外由iPSCs生成的小鼠可用于严格检验iPSC来源组织的长期稳定性和致瘤性。本方案将有助于希望获得完全多能性iPSC细胞系或iPSC小鼠，或比较不同重编程方法相对有效性的研究人员。
控制完全多能性诱导多能干细胞（iPSCs）生成与鉴定的机制仍不明确，因此使用本方法产生的某些iPSC细胞系可能无法通过TEC检测。许多因素在不同实验之间可能存在差异，包括遗传背景、慢病毒滴度、慢病毒插入模式、供体细胞群体的细胞周期参数、不同实验室在TEC操作各步骤中的差异，以及iPSCs携带遗传或表观遗传异常的倾向性。为了最大程度确保成功，我们在iPSC诱导实验中会谨慎确定慢病毒基因表达的适当水平，通过在对照小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上测试病毒稀释度，确保每种病毒的浓度足够高，能够在至少80%、理想情况下达到100%的MEFs中产生可检测的基因表达。这使我们能够在限制MEFs毒性的前提下，识别出携带多种不同慢病毒多个拷贝的细胞系，并形成不致密过度生长的克隆。需要注意的是，已有多种其他实验方案被证实可通过不同方法和供体细胞来源获得具有完全发育潜能的iPSCs，提示实现完全多能性可能存在多种途径1,8-13,15。然而目前尚未发现能够明确标识完全多能性iPSCs的生物标志物，因此TEC检测仍是判断一个iPSC细胞系是否具备生成生物体内所有细胞谱系能力的金标准检测方法。

<table><tbody><tr><td>DMEM（高糖）</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胚胎干细胞专用FBS</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 明胶</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO（小鼠LIF）</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>丙戊酸</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/毫克&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/毫克&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 自由</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素，用于超数排卵，冻干粉，2,000 IU</td><td>Harbor-UCLA 研究所</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素</td><td>Sigma</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>含透明质酸酶的 FHM 培养基</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>KSOM-1/2 AA 培养基</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>家族性偏瘫型偏头痛</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>水，用于胚胎移植，已检测胚胎</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>矿物油，胚胎检测</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），胚胎检测级</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞，非辐照</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;本方案中使用的培养基与缓冲液&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;HEK293T 生长培养基。90% DMEM，10% FBS，100 U/ml 青霉素和 10 mg/ml 链霉素。转染当天所用 HEK 培养基中不添加青霉素和链霉素。HEK 培养基可在 4℃ 保存 &amp;deg;最多可于 C 保存 1 个月。&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;2x HBS。42 mM Hepes，274 mM NaCl，10 mM KCl，1.5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O₂，12 mM 葡萄糖，pH 调至 7.1 ± 0.1。pH 值至关重要！经无菌滤膜过滤后，4 ℃保存 &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）生长培养基（也可用于饲养层）。70% DMEM，20% Medium 199，10% FBS，100 U/ml 青霉素和 10 mg/ml 链霉素。4 ℃保存 &amp;deg;最多可于 C 保存 1 个月。&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;ESC 培养基。85% DMEM，15% 胚胎干细胞专用胎牛血清，1x Glutamax，0.1 mM 非必需氨基酸，0.1 mM &amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇，1,000 U/ml ESGRO，100 U/ml 青霉素和 10 mg/ml 链霉素。ESC 培养基可在 4℃ 保存 &amp;deg;最多可保存三周。&lt;/p&gt; &lt;p 类=&quot;jove_content&quot;&gt;电融合介质。0.3 M 甘露醇，0.1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，50 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，以及胚胎测试水中含3% BSA。4℃保存 &amp;deg;C，最长可达3个月。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）为开展基础研究提供了重要的工具，也可能为再生医学疗法提供患者匹配的细胞来源。iPSCs可通过多种实验方案、从多种细胞来源获得。在成功建立iPSC系后，需通过多种方法进行鉴定，包括对多能性标志物进行免疫染色、在拟胚体和畸胎瘤中形成三个胚层、与胚胎干细胞（ESCs）进行基因表达谱比较，以及生成嵌合小鼠（无论是否具有生殖系嵌合能力）2。值得注意的是，即使通过上述检测的iPSC细胞系，其向不同类型分化细胞分化的潜能仍存在差异2。这使得研究人员难以确定在不同应用场景下，哪种iPSC诱导方案、供体细胞来源或筛选方法最为有效。
检验干细胞系是否具有足以生成生物体存活所需全部组织的发育潜能（称为完全多能性）的最严格标准是四倍体胚胎互补（TEC）3-5从技术上讲，TEC 涉及两个细胞胚胎的电融合，以产生可培养的四倍体（4n）单细胞胚胎 体外 至囊胚阶段6二倍体（2n）多能干细胞（例如 将ESCs或iPSCs注射到四倍体囊胚的囊胚腔中，随后移植至受体雌性动物体内进行妊娠（参见 图1). 补足胚胎中的四倍体组分几乎完全贡献于胚外组织（胎盘、卵黄囊），而二倍体细胞则构成胚胎本体，从而产生完全来源于所注射干细胞系的胎儿。
近期，我们报道了可通过四倍体囊胚互补（TEC1）技术稳定产生成年小鼠的诱导性多能干细胞（iPSC）系。这些iPSC系产生可存活仔鼠的效率为5–13%，与胚胎干细胞（ESCs）3,4,7相当，且高于大多数其他iPSC系所报道的效率8–12。这些研究结果表明，直接重编程能够产生完全多能性的iPSCs，其在发育潜能以及TEC测试中产生仔鼠的效率方面均可与ESCs相媲美。目前尚不清楚完全多能性的iPSCs与多能性较低的细胞系之间存在哪些差异13–15，也不明确哪种重编程方法能够以最高效率产生此类细胞系。本文介绍了一种可产生完全多能性iPSCs及“全iPSC”小鼠的方法，可能有助于希望比较不同iPSC系多能性水平或验证不同重编程方法等效性的研究人员。

在第3步“从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）诱导生成诱导性多能干细胞（iPSCs）”中，应在添加强力霉素/VPA后4-5天开始观察到形态学上的异质性以及未成熟iPSC克隆的形成，并在7-10天之间观察到成熟克隆（图2）。第5步中产生单细胞四倍体胚胎的效率非常高（图3）。我们通常观察到，高达95%经处理的双细胞胚胎能够成功融合，形成四倍体单细胞胚胎。将iPSCs注射入四倍体囊胚的实验方案（第6步，图4）与将胚胎干细胞（ESCs）注射入二倍体囊胚以生成嵌合小鼠的方案类似，可由经验丰富的显微注射操作人员完成。出生的活仔数量取决于细胞系（表1）。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">MEF 预编程效率 0.01-0.03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">通过 TEC 法生成小鼠诱导多能干细胞的效率</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>名称</td>
			<td>描述</td>
			<td>注射的胚泡数</td>
			<td>存活新生小鼠</td>
			<td>存活成年小鼠</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1 (0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 代表性结果。
<img alt="Tetraploid blastocyst complementation diagram; iPSC mouse creation from diploid, E13 embryos." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 实验设计示意图。左上：四倍体囊胚的制备。将白化小鼠的受精二细胞胚胎进行电融合，生成四倍体单细胞胚胎，随后进行培养 体外 至囊胚阶段。左下：重编程。小鼠胚胎成纤维细胞通过编码 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 以及反向四环素转录激活蛋白 rtTAM2.2 的慢病毒颗粒进行转导。加入多西环素后可诱导转基因表达，启动向诱导多能干细胞（iPSCs）的重编程过程。右：诱导多能干细胞来源小鼠的制备。将来源于有色小鼠的诱导多能干细胞注射到四倍体囊胚的囊胚腔中，随后通过手术植入假孕受体小鼠体内。新生的诱导多能干细胞小鼠通过剖宫产分娩，并进行交叉哺育。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<img alt="细胞重编程过程；显微镜图像；MEFs 转化为 iPSCs 的过程，10x、20x 放大倍数。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 与重编程相关的形态学变化。从左至右：重编程实验过程中，成纤维细胞向诱导多能干细胞（iPSC）克隆演化的形态学进展示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="胚胎发育阶段：2-细胞（2n）、卵裂球融合、1-细胞（4n）；显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 四倍体胚胎的制备。将二倍体两细胞胚胎施加电脉冲，诱导卵裂球融合，从而生成单细胞四倍体胚胎。
<img alt="将iPSC注射到囊胚中，产生iPSC新生小鼠和3周龄小鼠；细胞研究结果。" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. iPSC小鼠的制备。左图：将iPSC注射至四倍体囊胚的囊胚腔中。中图：通过有色眼睛区分新生iPSC小鼠。右图：出生后三周的iPSC小鼠。

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。

体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的制备为开展基础研究提供了重要的工具，并可能……

本实验的总体目标是通过四倍体胚胎互补法，利用诱导性多能干细胞（iPSCs）产生成年小鼠。首先，使用携带OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc的慢病毒，将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为iPSCs，并在培养基中添加丙戊酸（VPA）进行补充。获得诱导多能细胞（IPCs）后，需通过免疫染色、染色体计数及胚胎体形成实验对其进行表征。下一步是通过细胞融合及体外培养制备受体四倍体囊胚辅助结构。随后，将诱导多能干细胞（IPSC）注射至四倍体囊胚辅助结构中，并将完成互补的囊胚辅助结构移植至受体雌性动物体内进行妊娠。在最后一步中，通过剖宫产将足月动物取出并交给代孕母体，以便监测其出生后的发育情况。最终确定是否成功产生了可存活的足月动物。该检测用iPSC细胞系被认为具有完全多能性。与其它生成iPSC的方法相比，本技术的主要优势在于能够可重复地产生完全多能性的iPS细胞系。通过这些方法获得的iPS细胞系可能对希望比较其iPS细胞多能性水平，或验证其他重编程方法等效性的研究人员具有参考价值。这些方法对于希望为特定下游应用（如体外分化检测）生成完全多能性iPS细胞系的研究人员也将具有实用意义。进一步生成所有诱导性多能干细胞（iPSC）小鼠。利用四倍体胚胎互补法可能是一种有效手段，用于评估不同细胞系的遗传和表观遗传稳定性。四倍体胚胎互补过程中所涉及的显微操作在技术上具有较高挑战性。掌握iPSC技术可能需要数月时间，因为该技术所需的培养条件与传统ES细胞基因靶向实验所用的条件相似。在用慢病毒感染HEK 293T细胞24小时后，移除生长培养基，并更换为25毫升新鲜预温的培养基。转染后48小时，从转染了慢病毒的HEK293T细胞中收集含有慢病毒颗粒的生长培养基，将培养基放回培养箱中24小时。通过在4°C下以3000 × g离心五分钟，去除含病毒培养基中的颗粒状碎片。接下来，在4°C下通过20%蔗糖垫以112,000 × g超速离心两小时，浓缩病毒。小心地将上清液倒入废物容器中进行去污处理，注意不要扰动病毒沉淀。用 0.4 毫升小鼠胚胎成纤维细胞培养基重悬病毒沉淀，并密封试管。然后在 4°C 下轻轻摇动 15 至 30 分钟。将病毒颗粒和单次使用分装样品储存在负80摄氏度。IPSC细胞系源自小鼠胚胎成纤维细胞或meth细胞。当IPSC集落具有明亮、折光性强且边界清晰的特征，并含有30至50个细胞时，即可进行人工挑选，并作为独立的IPSC细胞系扩增培养。用移液枪枪头挑取单克隆，将每个克隆直接转移至含有 20 µL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 的 U 型底 96 孔板的单个孔中，在 37 °C 下孵育约 8 分钟，或直至克隆解离为单细胞。通过光学显微镜监测解离过程的进展。可能需要轻柔振荡。将解离的细胞悬液转移至含有饲养层及150微升添加了多西环素和VPA的ESC培养基的96孔板中。当每个孔中重新出现iPSC克隆时，按照标准的ESC建系和细胞培养操作，将其传代至更大的培养孔中进行分析和细胞保种，以开始四倍体囊胚互补实验。从雌性小鼠收集的单细胞胚胎在KSOM培养基中于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜，发育为二细胞胚胎。次日，将BTX微型载玻片放入10厘米的培养皿中。加入足量的室温电融合介质，使载玻片完全浸没于溶液中，但避免液体过多导致电极的电极头完全浸没。打开 BTX 电融合仪 ECM 2001 和 BTX 增强器 400。将 ECM 的电缆连接至微载玻片的电极上，并将电缆固定在培养皿侧壁，以防止载玻片发生意外移动。运行一次手动脉冲，以获取 BTX 增强器的读数，并记录所施加直流电流的电压。交流电流将控制胚胎在电极之间排列的速度，直流电流将促使囊胚融合，而脉冲时间将设定直流脉冲的持续时长。一个良好的起始条件是交流电三伏，直流电100伏，持续时间为0.05毫秒。最佳直流电压范围在90至150伏之间。使用口吸移液管。从 KSOM 培养液中取出 30 至 42 个细胞的胚胎，转移至电融合液滴中。通过数滴电融合培养基进行洗涤。接着，用口吸管从微型载玻片皿中吸取新鲜的电融合培养基。取洗涤后的胚胎，将其置于显微载片上两个电极之间的一毫米间隙中。注意使胚胎位于间隙中央并彼此不接触。通过按下手动启动按钮施加交流电流。胚胎将在交流电场中旋转，直至胚泡接触面与电极平行。如果数秒内胚胎仍未对齐，请调高交流电设置。胚胎对齐后，再次按下手动启动按钮，以在移液管中含有电融合介质的情况下施加直流脉冲。从微载玻片上收集胚胎，用数滴 KSOM 培养基洗涤胚胎，然后将胚胎置于 KSOM 培养基中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下、矿物油下进行培养。细胞融合操作应在 30 分钟内完成。在培养过程中，监测并筛选出卵裂球成功融合的胚胎。融合后的胚胎在培养30分钟后应呈现单细胞阶段，弃去已裂解及处于双细胞阶段的胚胎。将融合后的胚胎继续在矿物油覆盖下的KSOM微滴中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。为准备囊胚注射用诱导多能干细胞（IPCs），需解冻先前冻存的IPCs，并将其接种于饲养层细胞上，使用胚胎干细胞（ESC）培养基进行培养。在用于注射前，至少应在饲养层细胞上传代一次。一个六孔板中的单孔，含有70%至80%融合度的IPCs，可提供足够数量的细胞用于注射。吸去培养基，用三毫升不含钙和镁的PBS洗涤细胞，加入0.5毫升预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37摄氏度孵育10分钟，期间偶尔轻摇。加入3.0毫升ESC培养基，反复吹打以获得单细胞悬液。通过光学显微镜观察细胞，确保形成单细胞悬液，细胞团或细胞聚集体将堵塞注射移液管。一旦获得单细胞悬液，向孔中加入1毫升ESC培养基，并将培养板放回37摄氏度培养箱中继续孵育。孵育约15分钟，或直至大部分饲养细胞开始贴壁，轻轻移除含有诱导性前体细胞（IPCs）的培养基，注意不要扰动每周贴壁的饲养细胞。将IPCs放入含有5毫升ESC培养基的15毫升锥形管中，在200 ×g下离心5分钟。用移液器吸除上清液，并用微量移液器彻底移除残留的 ESC 培养基。轻敲离心管使沉淀松动，然后在 0.2 至 0.5 毫升预冷的 FHM 培养基中轻柔重悬细胞。将细胞置于冰上保存，直至并持续在向四倍体囊胚注射期间保持低温。有关囊胚注射的实验方案，请参阅本文所附的手稿以及此前发表的一篇 strove 文章，其节选内容正在屏幕上显示。这些图像展示了在重编程实验过程中，成纤维细胞向诱导性多能干细胞（IPSC）集落形态演变的示例。在加入多西环素和VPA后四到五天开始，应观察到形态上的异质性以及部分重编程的IPSC集落形成，如图B至EESC所示。类似IPSC的集落应在七到十天内出现，如图F所示。通过二倍体二细胞胚胎的电融合来制备单细胞四倍体胚胎具有很高的效率。通常可观察到高达95%的经处理的二细胞胚胎成功融合，形成四倍体单细胞胚胎。本实验中将iPSC注射入四倍体囊胚所采用的方案，与将ES细胞注射入二倍体囊胚以制备嵌合小鼠的方案类似。为便于排除二倍体嵌合体的产生，尽可能仔细选择用于生成iPSC和四倍体胚胎的小鼠品系的毛色特征。在本例中，四倍体胚胎来源于白化品系，而iPSC则来源于有色品系。因此，新生的iPSC小鼠表现出有色素的眼睛，并在成年后具有均匀的毛色，而二倍体克隆小鼠则会表现出白化与有色毛发相混合的表型。出生的活仔数量取决于细胞系，如本表所示。对于一条平均质量较好的iPSC细胞系，实验人员可预期每注射的囊胚中有1%至10%能够产生活的新生仔鼠。观看本视频后，您应能充分理解如何获得完全多能性的诱导多能干细胞（iPSC），以及如何验证其发育潜能。通过掌握四倍体补偿实验技术，从胚胎干细胞（MES）的获得到成功培育出iPSC小鼠，整个过程可在两到三个月内完成。诱导多能干细胞（iPSC）的建立与维持需要高水平的细胞培养技术。具备ESL文化方面的先前经验至关重要。切勿忘记，操作慢病毒时需格外小心，尤其是浓缩的慢病毒可能具有极高危险性。操作时应始终穿戴所在机构要求的个人防护装备，并确保所有接触过病毒的物品均用10%漂白剂处理至少20分钟，具体操作请遵循本规程。所有iPSC小鼠及其组织均可用于分析生理、病理和行为表型。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

诱导多能干细胞来源于小鼠的生成

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

Stemgent Dox 诱导型小鼠转录因子慢病毒套装可将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。本文演示了使用 DOX 诱导表达小鼠重编程转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的实验方案，以生成表达常见小鼠胚胎干细胞多能性标志物的 iPS...

利用四转录因子、多西环素诱导型慢病毒转导系统重编程小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导性多能干细胞

以下方案提供了将人诱导性多能干细胞（iPS细胞）适应于无饲养层培养的详细说明，使用完全 KnockOut...

无饲养层人诱导多能干细胞的适应、培养与传代——使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基

本方案详细描述了使用KnockOut SR冻存液对人iPS细胞进行低温冻存，并在完全KnockOut SR无饲养层（KSR-FF）培养基或含饲养层的KnockOut...

使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基冻存与复苏人iPS细胞

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

本方案描述了如何在无饲养层条件下，利用含重编程因子的基质胶和仙台病毒载体，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

本研究中，我们利用非病毒型转座子系统，从小鼠羊水细胞生成诱导性多能干细胞。...

利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。...

从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

本方案描述了一种从人和非人灵长类动物尿液来源细胞中分离、扩增并重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法，以及新生成的iPSCs在无饲养层条件下的维持培养操作指南。...

尿源性灵长类诱导多能干细胞的建立与维持

了解通过四倍体胚胎互补技术从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞并培育成年小鼠的完整实验流程。该方法可验证iPSC的全能性，为干细胞生物学研究提供可靠的技术方案。

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

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