Name: 导管内可视化通过NF-κB记者的转基因小鼠模型的乳腺炎:信号注射LPS (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 了解利用NF-κB报告基因转基因小鼠模型通过导管内注射LPS诱导乳腺炎的研究方法。该技术结合生物发光成像可视化炎症反应，为乳腺炎症机制研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为CA113734，授予F Yull，以及退伍军人事务部（TS Blackwell）。

所有动物实验均经范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 转基因小鼠的制备
<ol>
 <li>使用携带 NGL（NF-κB-GFP-L荧光素酶）报告转基因（此前已有描述1）的雌性小鼠进行本实验。当雌鼠至少达到6周龄时，将其与FVB野生型雄鼠交配。可采用后宫式繁殖（每笼最多4只雌鼠与1只雄鼠共同饲养）。（请注意：本研究使用的是FVB品系小鼠。其他毛色较深的品系小鼠如C57Bl6也可使用，但成像前必须剃毛）。</li>
 <li>从交配后第15天开始，定期检查雌鼠是否出现妊娠迹象（腹部明显膨大）。一旦发现雌鼠怀孕，应立即将其单独饲养，并在最后一只雌鼠确认怀孕后，将雄鼠从繁殖笼中移除。</li>
 <li>密切观察单独饲养的雌鼠，并记录产仔日期。每窝至少需要6只仔鼠才能保证充分泌乳。在产仔后第8天，开始执行本实验方案（实验时间线示意图见图1）。</li>
</ol>
2. 注射前准备
<ol>
 <li>将大肠杆菌（E. coli）脂多糖（LPS）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成终浓度为 0.1 μg/μl 的溶液。每只乳腺将注射 50 μl 该溶液，即总共 5 μg。另准备一管仅含 PBS 的溶液，用于对照注射。</li>
 <li>设置体视显微镜和异氟烷麻醉设备。应将鼻罩装置固定在体视显微镜的载物台上，用于放置小鼠。同时应准备好良好的光源，可来自显微镜本身或额外的聚光灯。</li>
 <li>设备准备就绪后，启动异氟烷麻醉机并开启气流。</li>
</ol>
3. 脂多糖导管内注射
<ol>
 <li>用短针注射器吸取 50 μl LPS 溶液，置于一旁备用。</li>
 <li>通过将雌鼠放入充满异氟烷的麻醉箱中开始麻醉；待其呼吸变慢后，将其转移至操作台，并将鼻部置于鼻罩内。使用脚趾夹捏法确认小鼠已完全麻醉。在整个操作过程中持续监测小鼠呼吸，并根据需要调整异氟烷浓度。将该雌鼠原本所在的、带有整窝幼崽的鼠笼小心放置一旁，待操作结束后再将母鼠放回。</li>
 <li>使用一滴 70% 乙醇使小鼠腹部毛发贴服，以便观察位于下腹部右侧第4对腹股沟乳腺的乳头。</li>
 <li>调节解剖显微镜以获得乳头的最佳视野。用精细镊子轻轻将乳头从皮肤拉出，但切勿刺破或损伤乳头。操作组织时，镊子切勿用力夹紧，应轻握操作，使乳头所受应力最小化。</li>
 <li>用左手持镊子轻轻固定乳头位置，右手缓慢将预装注射器移入视野。持注射器时应确保无需重新调整位置即可完成注射。</li>
 <li>当注射器进入视野后，仔细对准乳头中央的小导管开口，插入针头。</li>
 <li>保持手部位置不变，注射注射器内全部内容物，随后将针头从乳头中退出。</li>
 <li>另取一支注射器，吸取 50 μl PBS 用于对照注射。重新调整小鼠在操作台上的位置，以获得小鼠下腹部另一侧左侧第4对腹股沟乳腺乳头的最佳视野。使用装载 PBS 的注射器重复步骤 3.4 至 3.7。</li>
 <li>完成两次注射后，停止麻醉，将小鼠转移至恢复笼中。监测母鼠，确保其在 5 分钟内恢复活动能力。让小鼠在恢复笼中静置 1 小时。恢复 1 小时后，将母鼠放回其幼崽所在的鼠笼。注射后应定期监测小鼠 6 小时，之后再进行成像操作。根据我们的经验，在注射至成像期间，母鼠及其幼崽均未出现不良反应。然而，若观察到母鼠出现痛苦迹象（e.g. 弓背姿势、咬伤或保护注射部位、普遍性嗜睡）或幼崽出现异常（无活动、皮肤呈青紫色），应立即终止实验。</li>
</ol>
4. 利用生物发光成像技术可视化 NF-κB 活性
<ol>
 <li>将小鼠转运至成像实验室后，打开软件并启动仪器，开始成像操作。打开异氟烷麻醉机和气流，确保麻醉气体同时通入麻醉箱和成像室。</li>
 <li>将小鼠放入透明的麻醉箱中进行异氟烷麻醉。待其呼吸减慢后，通过脚趾夹捏测试确认小鼠已完全麻醉。随后，使用无菌注射器经眶后静脉注射 100 μl 荧光素酶底物5。</li>
 <li>立即将小鼠转移至成像室，并将其鼻部置于成像室内的异氟烷鼻罩下，保持仰卧姿势。用胶带将每只脚固定在成像台上。</li>
 <li>在 IVIS 软件中设置适当的参数，采集白光照片图像以及生物发光图像。曝光时间应设为 10 秒。获取图像。</li>
 <li>图像采集完成后，让小鼠苏醒，然后将其放回笼中与仔鼠一同饲养，并定期进行观察。</li>
 <li>照片图像与发光图像将自动叠加并显示在屏幕上，如图2所示。通过在小鼠下腹部两侧（一侧为 PBS 注射的乳腺组织，另一侧为 LPS 注射的乳腺组织）放置大小相同的感兴趣区域（“ROI”）圆形区域，对采集的图像进行分析。将读数单位设为光子数。每个 ROI 内检测到的发光值将以数字形式显示（见图2B）。将该数值用于统计分析。</li>
 <li>为获得最佳图像显示效果，可进一步调整信号显示的阈值。此操作不会改变总发光读数，但可去除背景信号，从而更清晰地显示对照组与 LPS 处理组乳腺组织之间的差异。逐步降低显示的发光强度，直至 PBS 注射侧的乳腺组织无背景信号。此时，LPS 处理侧乳腺组织中增强的信号仍应在图像中清晰可见，如图2所示。</li>
 <li>可在雌鼠处死后采集乳腺组织，进一步完成包括蛋白质和 RNA 检测在内的其他分析6。</li>
</ol>
5. 代表性结果
为了从这些方法中获得可解释的结果，必须仅将LPS（或PBS）注入乳腺导管内，而保持周围相邻组织不受干扰。若将液体注射到乳头周围的皮下组织，将因机械损伤引发炎症，而非模拟感染。在学习该技术时，使用PBS稀释的台盼蓝染料进行注射有助于操作掌握。图3A显示了一个成功注射的腺体，其中注入了100 μl PBS配制的台盼蓝溶液。如图所示，只有导管树应被注入的溶液充盈，注射部位不应出现液团。“液团”在此指液体在乳头或乳头周围组织积聚，而未进入导管树内。这种情况如图3B所示。请注意，图3中所示的练习注射是在哺乳第21天的雌性小鼠上完成的。在泌乳高峰期（第8-10天，即本方案中注射LPS的阶段），乳汁丰富，难以观察导管结构，也无法准确判断注射是否成功。因此，在泌乳后期进行练习注射更为合适。
成功将LPS注入乳腺导管后，腺体内NF-κB活性会升高。在IVIS成像中，报告基因小鼠应可清晰观察到这一变化，且LPS注射侧腺体的荧光素酶活性（以光子数计量）应显著高于PBS注射侧腺体，如图2所示（平均而言，LPS处理侧信号为PBS对照侧的200%）。通过对4只小鼠的实验，LPS处理侧腺体的发光强度相较于对侧对照组达到了统计学意义上的显著升高4。另一项研究也采用了向NF-κB报告基因转基因小鼠乳腺导管内注射E. coli或LPS的方法。与我们自身的工作类似，这些作者观察到在注射E. coli后6小时，报告基因活性显著升高2。
请注意，由于脑部和其他腹腔器官中存在组成型NF-κB活性，即使在未进行任何处理的基线状态下，对报告基因小鼠成像时，其头部和腹部始终会显示信号。因此，在本实验中应忽略该信号。在调整图像读数以最小化PBS注射乳腺中的背景发光后，LPS注射的乳腺组织中应仍可见明显的信号。图2展示了背景信号降低后的图像。
注射未成功进入腺体很可能导致乳头损伤。这将引起尖锐的、表皮水平的炎症，影像检查中可明显观察到。此类损伤信号会非常强烈，且局限于发生损伤的乳头区域，不会像成功将LPS注入导管后那样扩散至整个腺体。
<img alt="小鼠繁殖与IVIS成像流程、LPS注射、乳腺中NF-kB报告基因示意图。" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 实验流程示意图。
<img alt="小鼠生物发光成像；LPS与PBS处理效果比较；实验设置。" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
 图2. IVIS生物发光成像的代表性结果。 （A）经背景扣除后获得的图像，显示LPS注射腺体中荧光素酶活性增强。（B）图A添加了感兴趣区域定量分析的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="组织染色实验，蓝色染料在生物组织中的扩散，比较结果。" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
 图3. 示踪注射：通过乳管内注射将染料注入乳腺。 为检测经乳头给药的准确性，对一只哺乳第21天的小鼠通过乳头注入100 μl用PBS稀释的台盼蓝染料。处死后暴露乳腺以进行观察。（A）成功注射；（B）染料在乳头处积聚成团。

<ol><li>Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+and+intensity+of+NF-%CE%BAB+activity+determine+the+severity+of+endotoxin-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury.</a> The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).</li>
<li>Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+NF-%C3%8E%C2%BAB+activity+during+Escherichia+coli-induced+mammary+gland+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of NF-ÎºB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection.</a> Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).</li>
<li>Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+in+endotoxin-induced+murine+mastitis+is+strictly+dependent+on+mammary+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages.</a> Veterinary Research. 41, 10(2010).</li>
<li>Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+nuclear+factor+kappaB+in+mammary+epithelium+promotes+milk+loss+during+mammary+development+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection.</a> J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. (21), e2828(2011).</li>
<li>Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Research. 11, R66(2009).</li>
<li>Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+lipopolysaccharide-induced+mastitis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model.</a> Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).</li>
<li>Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D+%22Intraductal+Injection+into+the+Mouse+Mammary+Gland.+Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research%22">Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).</li>
<li>Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+bovine+soluble+CD14+reduces+severity+of+experimental+Escherichia+coli+mastitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice.</a> Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).</li>
<li>Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+neutrophils+but+not+mammary+alveolar+macrophages+in+a+murine+model+of+acute+Escherichia+coli+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis.</a> Veterinary Research. 41, 53(2010).</li>
<li>Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+LPS-binding+protein+in+bovine+blood+and+milk+following+bacterial+lipopolysaccharide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge.</a> Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).</li>
<li>Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+is+needed+to+restrict+the+invasion+of+Escherichia+coli+P4+into+mammary+gland+epithelial+cells+in+a+murine+model+of+acute+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis.</a> Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).</li>
<li>Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mediators+in+Escherichia+coli-induced+mastitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Immunology%2C+Microbiology%2C+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice.</a> Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).</li>
<li>Osterman, K. L., Rahm, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactation+mastitis%3A+bacterial+cultivation+of+breast+milk+symptoms%2C+treatment%2C+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Lactation%22%5BJournal%5D)">Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome.</a> Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).</li>
<li>Sordillo, L. M., Streicher, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+Gland+Immunity+and+Mastitis+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).</li>
<li>Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetically+altered+mice+to+investigate+the+role+of+nuclear+factor-kappa+B+activation+and+cytokine+gene+expression+in+sepsis-induced+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS.</a> Chest. 116, 73S-74S (1999).</li>
<li>Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+NF-kappaB+activation+promotes+urethane-induced+lung+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).</li>
<li>Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-%CE%BAB+signaling+in+fetal+lung+macrophages+disrupts+airway+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis.</a> The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).</li>
<li>Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+IKKepsilon+regulates+energy+balance+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice.</a> Cell. 138, 961-975 (2009).</li>
<li>Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+kinase+II+triggers+cell+membrane+injury+by+inducing+complement+factor+B+gene+expression+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本研究利用一种转基因NF-κB报告小鼠及优化的注射技术，建立乳腺组织炎症（即乳腺炎）模型，该疾病最常见于细菌感染。该实验操作中最关键的步骤是导管内注射本身。
在实际操作中，通常可以明显判断导管内注射是否成功。注入试剂（LPS 或 PBS）时应感觉顺畅，注射器排空过程中应几乎无阻力。最常见的问题是乳头受损，导致试剂无法顺利进入腺体。可通过解剖显微镜观察乳头来识别此类损伤。通过充分练习、操作乳头时保持轻柔，以及确保仅使用最细的针头（31G 或更细）进行操作，可避免此类损伤。此外，若针头位置不正确或在注射过程中发生滑脱，则 LPS 或 PBS 可能在注射部位积聚，导致液体无法扩散至导管内。若发生此情况，可能在乳头周围皮肤下肉眼可见液体积聚，或注射时感觉不顺畅。尽管此类问题无法完全避免，但通过练习并使用合适的工具，可在很大程度上减少其发生。 
本实验中所采用的注射技术至关重要。一些已发表的乳腺导管内注射方法需要切除乳头和/或切开皮肤7,8。而在本研究中，由于主要终点是确定乳腺内与NF-κB相关的炎症反应，因此任何...

<table><tbody><tr><td>脂多糖来自 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; &lt;em&gt;（LPS）&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>L 2880</td><td>血清型055:B5 </td></tr><tr><td>PBS</td><td>美迪特公司</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>31 号针头胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>328438</td><td>短针头</td></tr><tr><td>镊子</td><td>世界精密仪器公司</td><td>15908</td><td></td></tr><tr><td>解剖范围</td><td>Leica</td><td>M3Z</td><td></td></tr><tr><td>特雷尔异氟烷，USP</td><td>MINRAD 公司用于 Rx Elite</td><td>NDC 66794-011-25</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 200 成像系统</td><td>Caliper（原 Xenogen）</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>用于荧光素注射的注射器</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>309597</td><td>1毫升；26G5/8 </td></tr><tr><td>D-荧光素萤火虫钠盐一水合物&lt;br/&gt;（荧光素底物）</td><td>Biosynth 化学与生物学</td><td>L-8240</td><td>稀释至 10 mg/ml</td></tr></tbody></table>

通过lps导管内注射建立小鼠乳腺炎模型：利用nf-κb报告基因转基因小鼠可视化信号通路

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

为了严格研究疾病进展的各个阶段及其相关机制，并最终作为临床前模型来测试干预措施，人类疾病的动物模型是必不可少的。在这些方法中，我们描述了一种技术：通过乳头将脂多糖（LPS）注射到哺乳期小鼠的乳腺中，从而有效模拟乳腺炎，即乳腺的炎症。这种模拟感染会导致核因子κB（NF-κB）信号通路的增强，可通过NF-κB荧光素酶报告小鼠的生物发光成像进行观察1。
开发这些方法的最终目标是研究哺乳期乳腺中与乳腺炎相关的炎症反应，这种炎症通常包括红肿和免疫细胞浸润2,3。因此，我们充分认识到，不能在实验方法中采用任何对皮肤、乳头或腺体进行切口或造成损伤的方式来导入LPS，因为此类操作很可能干扰对炎症反应的准确读取。同时，我们希望采用一种简便直接的方法，无需使用手工拉制的移液管或显微操作仪来固定特殊工具。因此，我们决定采用市售的胰岛素注射器，将试剂注入完整乳头的乳腺导管内。该方法取得了成功，使我们能够在排除注射过程本身带来的额外影响的前提下，研究LPS注射所引发的炎症反应。此外，该方法还结合了NF-κB荧光素酶报告基因转基因小鼠及生物发光成像技术，从而以可视化和定量的方式展示LPS注射乳腺中NF-κB信号通路的增强4。
这些方法对希望在哺乳期乳腺中建立疾病模型的多学科研究人员具有重要意义，因为本文所述技术可用于注射多种物质，而不仅限于脂多糖（LPS）。

本文介绍了一种通过乳头将脂多糖注射到哺乳期小鼠乳腺中以模拟乳腺炎的技术，乳腺炎通常由细菌感染引起。通过NF-κB荧光素酶报告小鼠的生物发光成像可观察到，脂多糖注射导致核因子κB（NF-κB）信号通路增强。

通过LPS导管内注射建立小鼠乳腺炎模型：利用NF-κB报告基因转基因小鼠可视化信号通路

人类疾病动物模型对于严格研究疾病进展的各个阶段及相关机制至关重要，并且最终对于……

本实验的总体目标是研究乳腺炎或乳腺组织的炎症反应，更具体地说，是可视化并量化炎症状态下泌乳乳腺组织中 NF-κB 的活性。首先将雌性 NF-κB 报告基因转基因小鼠与野生型雄性小鼠交配。在仔鼠出生后第 8 天，通过导管注射技术将脂多糖注入雌鼠的泌乳乳腺组织内，该技术不会损伤导管；注射后 6 小时，对注射部位进行取材分析。通过生物发光成像检测小鼠乳腺内荧光素酶活性。最终，结合导管内注射方法及生物发光成像，结果可显示脂多糖（LPS）处理的乳腺组织中存在显著的NF-κB活性。与其它导管内注射方法相比，本方法的主要优势在于注射部位不会受到任何损伤。如果计划研究与LPS注射相关的炎症反应，则这一点至关重要，因为任何对注射部位或乳头的损伤都会叠加并干扰这些分析。本实验使用携带NGL报告基因转基因的雌性小鼠。一、雌性小鼠至少六周龄。将它们与FVB野生型雄性小鼠进行交配，并在交配后15天开始繁殖。定期检查雌鼠是否怀孕，主要观察其腹部是否明显膨大。一旦发现怀孕雌鼠，立即将其单独隔离至各自的笼子中；当最后一只雌鼠确认怀孕后，将雄鼠从繁殖笼中移除。需要至少六只幼崽才能保证充分泌乳。在该窝幼崽出生八天后，开始进行实验方案。该操作中最困难的部分是注射过程本身。保持手部稳定并进行大量练习会有所帮助，但仍然可能遇到各种问题。为确保成功，应在注射当天准备多只小鼠以备使用。首先将大肠杆菌来源的脂多糖用 PBS 稀释至终浓度为 0.1 微克/微升。将向乳腺内注射 50 微升该 LPS 溶液。另准备一管不含脂多糖的 PBS，用于对照注射。将解剖显微镜的载物台旁放置麻醉鼻罩装置。根据需要使用额外的聚光灯，为载物台提供充足的照明。一旦解剖装置准备就绪，启动异氟烷麻醉机并打开气流。接着用31号胰岛素注射器吸取50微升LPS溶液，并将注射器放置一旁用于练习注射。使用PBS稀释的台盼蓝染料以观察注射效果。接着，在小鼠呼吸减慢后将其麻醉，以准备注射。将其放置于操作台上，并通过鼻罩提供异氟烷。在整个操作过程中，使用夹趾法确认小鼠处于完全麻醉状态。监测小鼠的呼吸模式。持续调节异氟烷浓度以保持呼吸稳定。使用一滴70%乙醇压平动物腹侧腹部的毛发，并定位乳头。用非优势手持精细镊子，在下腹部找到右侧第四腹股沟乳腺的乳头。小心地将乳头从皮肤中轻轻拉出。镊子切勿夹紧。用优势手轻轻握住乳头即可。将预装好的注射器移入视野范围内，并稳稳持握，以便无需重新调整位置即可注入其中的内容物。仔细将针头对准乳头中心的小的导管开口。将针头约四分之一插入导管内，期间不要重新调整位置。在三到五秒内将注射器内的液体缓慢注入。然后小心地将针头从乳头中取出。用PBS填充第二个注射器，注射50微升，并在左侧重复上述操作。第四步，对腹股沟乳腺乳头使用PBS对照。完成两次注射后，停止麻醉，将小鼠转移至恢复笼中。雌性小鼠应在五分钟内开始活动。一小时后，将其连同其垫料一起放回饲养笼中。应在注射后六小时对小鼠进行成像。在此期间，观察小鼠是否出现痛苦迹象。若发现异常，应立即终止实验，并在成像设施处实施安乐死。准备使用异氟烷对雌鼠进行麻醉。确保麻醉气体同时流向麻醉箱和成像室。将小鼠放入透明的麻醉箱中，使其吸入异氟烷进行麻醉。待呼吸变慢后，使用夹捏法确认小鼠已完全麻醉。随后通过26号针头经眶后静脉注射100 µL的荧光素底物。注射后立即将小鼠转移至成像室，并连接输送异氟烷（Isoflurane）的鼻罩。将小鼠置于仰卧位，并用黑色不透明胶带将其每只脚固定在成像台上。在 IVIS 软件中输入适当的设置，以获取白光摄影图像和生物发光活性的图像。图像采集后的曝光时间应为 10 秒。按照注射后所述的相同恢复方案进行操作。照片图像和发光图像将自动叠加并显示在屏幕上。通过在小鼠下腹部的两侧放置大小相同的感兴趣区域（ROI）圆形，分析所获得的图像：一个置于PBS注射侧的腺体上，另一个置于LPS注射侧的腺体上。将读数设置为光子数。每个感兴趣区域（ROI）内检测到的发光值会显示为一个数值，该数值可用于统计分析以展示最佳图像。进一步调整所显示信号的阈值。这不会改变总的发光信号读数，但可以在PBS注射的腺体无背景信号时去除背景信号。在LPS处理的腺体中，信号增强应在图像中明显可见。注射操作在泌乳第21天进行，此时乳汁产量较少，注射是否成功可通过台盼蓝染色直观判断：在成功注射的记忆腺体中，仅有导管树被溶液充满；而在失败的注射中，乳头或周围组织会出现液体积聚。在第8天成功将LPS注射入乳腺导管后，由于脑部及其他腹部器官中存在组成型NF KB活性，导致腺体内NF KB活性升高。在任何处理之前，已有稳定的本底信号。在四只小鼠组成的实验组中，LPS注射侧腺体的荧光素酶活性显著高于PBS注射侧腺体。在经LPS处理的腺体中检测到发光强度具有统计学意义的增加。该方法可为乳腺炎症研究提供见解，也可应用于癌症研究等其他研究领域。可将癌细胞或致癌物直接注射到乳腺导管中。

intraductal-injection-lps-as-mouse-model-mastitis-signaling

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

导管内可视化通过NF-κB记者的转基因小鼠模型的乳腺炎：信号注射LPS

来源：Radulovic, K., et al. 向小鼠注射脂多糖以模拟肠道屏障受损后微生物来源产物的进入。 J. Vis. Exp.

小鼠腹腔注射细菌脂多糖以研究全身免疫反应

本文介绍了一种非侵入性地向小鼠乳腺导管递送水溶性试剂的实验方案。该方法通过将试剂局部注射至乳腺乳头，特异性地靶向乳腺导管。此技术可适用于多种化合物，包括siRNA、化疗药物和小分子化合物。...

乳腺导管内注射实现药物对小鼠乳腺的局部递送

通过腺病毒-Cre激活乳腺导管系统中的潜伏突变，可导致具有临床相关性的转移性乳腺癌。引入YFP启动子可实现对远端转移性肿瘤细胞的追踪。该模型可用于研究潜伏性转移、抗肿瘤免疫反应，以及设计治疗乳腺癌的新型免疫疗法。...

通过腺病毒-Cre靶向导管上皮启动转移性乳腺癌：一种新型的乳腺癌转基因小鼠模型

本实验方案采用荧光报告基因、体内标记和活体成像技术，以实现对活体动物中中性粒细胞预激活动态过程的监测。...

利用IL-1β启动子驱动的DsRed报告小鼠进行中性粒细胞活化的活体成像

本文所述方法可通过非侵入性生物发光成像（BLI）技术，对小鼠肺部由IL-8启动子依赖性炎症激活进行可视化观察。在递送荧光素酶报告载体后，同一动物可在长达两个月的时间内多次接受BLI检测。...

一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于 体内 长期监测炎症反应

本文介绍了一种模拟肠道屏障受损后细菌来源化合物进入机体的实验方案。向小鼠全身注射低剂量的亚致死浓度脂多糖，并在注射后连续监测24小时。在多个时间点检测脾脏、肝脏和结肠中促炎性细胞因子的表达水平。...

向小鼠注射脂多糖以模拟肠道屏障受损后微生物来源产物的进入

本实验方案旨在介绍一种基于将表达Cre的腺病毒通过导管内注射至小鼠乳腺中来建立乳腺癌模型的新方法。该方法能够以时间可控的方式，在特定细胞类型和器官中特异性调控致癌事件。...

通过向小鼠乳腺导管内注射表达Cre的腺病毒建立乳腺癌模型

本文介绍了一种简单的共聚焦成像方法，用于可视化小鼠次级淋巴器官中分泌细胞因子干扰素γ的细胞原位定位。该方案可拓展应用于多种组织中其他细胞因子的可视化研究。...

小鼠脾脏中原位干扰素γ产生的成像 单核细胞增生李斯特菌 感染

我们介绍一种采用针尖弯曲的颅池内注射技术，该针可固定于颅骨上，从而避免对下方实质组织造成损伤。该方法可用于软脑膜细胞的遗传谱系示踪和操作，以及脑脊液流动的追踪研究。...

通过小脑延髓池注射诱导软脑膜细胞修饰

本文描述了一种向小鼠乳腺导管树内注射基于乙醇的消融溶液的方法，用于活体成像及乳腺癌预防。in vivo...

小鼠模型中基于乙醇的消融溶液的导管内递送及X射线可视化用于乳腺癌的预防与局部治疗

本方案描述了病毒载体的导管内注射方法 通过...

体内 通过乳腺导管内注射将基因递送至小鼠乳腺上皮细胞

了解利用NF-κB报告基因转基因小鼠模型通过导管内注射LPS诱导乳腺炎的研究方法。该技术结合生物发光成像可视化炎症反应，为乳腺炎症机制研究提供可靠工具。

通过LPS导管内注射建立小鼠乳腺炎模型：利用NF-κB报告基因转基因小鼠可视化信号通路

探索更多视频