Name: 补肾胶囊对糖尿病小鼠的胰岛移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T23:37:26.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习在糖尿病小鼠肾被膜下进行胰岛移植的标准化操作技术。该方法通过精确的手挑和计数胰岛，使用P50导管递送，最大限度减少细胞与受体应激，提高移植成功率，适用于NOD自发糖尿病模型及链脲佐菌素诱导糖尿病模型。

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加州大学旧金山分校糖尿病中心。美国国立卫生研究院加州大学旧金山分校糖尿病研究中心胰岛核心实验室。青少年糖尿病研究基金会（JDRF）。利康公司（LifeScan Inc.）。强生公司（Johnson &amp; Johnson Company）。

移植（Tx）用胰岛的制备
<ol>
<li>在倒置显微镜下，使用P200移液器和直头吸头从100 mm培养皿中培养的胰岛中手工挑选胰岛。</li>
<li>每100个胰岛计数一次，并转移至各微量离心管中（约500个胰岛/管/小鼠）。</li>
<li>让胰岛自然沉降到微量离心管底部。</li>
<li>使用细壁直头吸头，将一个胰岛沉淀吸入P200移液器（设定体积为130 µL）。</li>
<li>在注射器尖端套上硅胶管接头，将一段PE50导管插入硅胶接头中。</li>
<li>将移液器悬挂在生物安全柜侧边，并用胶带将PE50导管固定在柜壁上，使其高于移液器尖端内的胰岛，从而使胰岛仅沉降在移液头尖端部分。</li>
<li>通过缓慢调节移液器旋钮，将胰岛缓慢转移至PE50导管中，&nbsp;注意&nbsp;不要将胰岛从导管末端推出。</li>
<li>将PE50导管的斜面端弯折形成折角。在保持折角状态下，将硅胶接头导管从移液器上取下，并用硅胶接头固定该折角。</li>
<li>将含有胰岛的PE50导管（折角端朝下）放入装有剪去头部的5 mL移液管的15 mL锥形离心管中，并用胶带将PE50导管固定在5 mL移液管侧壁，以防止离心过程中PE50导管卷曲。</li>
<li>将装有PE50导管的15 mL锥形管以1000 rpm离心后关闭离心机。（每次处理的胰岛样本不得超过10份）。</li>
<li>将离心管置于冰上。</li>
</ol>
小鼠移植前准备
<ol>
<li>使用异氟烷或氯胺酮/赛拉嗪麻醉小鼠（参见制备方案）。</li>
<li>麻醉生效后，剃除小鼠左侧 flank 部位的毛发。</li>
<li>用聚维酮碘棉签由中心向外擦拭小鼠皮肤，然后用乙醇棉签擦去残留碘液。</li>
<li>定位左肾（位于脾脏稍右侧），在皮肤上做一个小切口，暴露腹膜。</li>
<li>在腹膜上做一小切口以暴露肾脏。保持切口较小有助于使肾脏隆起并充分暴露。</li>
<li>轻轻按压切口两侧，将肾脏抬起或挤出体外。</li>
<li>用棉签蘸取生理盐水定期润湿肾脏，保持其湿润。</li>
<li>使用23或25号针头的注射器，在肾脏右侧 flank 部位轻轻划一下，造成肾包膜轻微破损；注意划痕不宜过深或过大。</li>
</ol>
胰岛移植
注意：在准备小鼠进行 Tx 的同时，第二位操作人员应准备 Hamilton 螺旋驱动胰岛移植注射器。
<ol>
<li>在保持 PE50 管道弯曲状态的同时，缓慢将硅胶连接管从 PE50 管道上取下。</li>
<li>将 PE50 管道的另一端插入硅胶连接管中，并将硅胶连接管套在连接于“螺旋驱动”玻璃 Hamilton 注射器的移液枪头末端。缓慢松开 PE50 管道的弯曲部分，确保胰岛不会泄漏。</li>
<li>使用“螺旋”装置缓慢推动胰岛向 PE50 管道末端移动，但在胰岛前方的 PE50 管道中保留一个小的气泡。</li>
<li>将 PE50 管道小心地通过肾脏上的切口插入肾包膜下方，形成一个小囊袋。操作时务必小心，避免刮伤肾脏或刺穿包膜。</li>
<li>使用浸有生理盐水-庆大霉素的棉签保持手术区域和包膜湿润；干燥的包膜容易撕裂。</li>
<li>轻柔地向各个方向移动管道，为移植的胰岛创建一个“囊袋”。注意需反复补充生理盐水以保持区域湿润。</li>
<li>在打开小鼠并已将 PE50 管道插入肾包膜下的操作者指导下，另一位准备小鼠和 Hamilton 移植注射器的操作者应缓慢推动胰岛，使其在 PE50 管道输送的小气泡推动下进入包膜下的“囊袋”内，直至所有胰岛完成移植。</li>
<li>缓慢撤出 PE50 管道，用干燥棉签擦干区域，并用低温电灼仔细封闭切口。</li>
<li>使用干燥的棉签确认出血已完全停止。一旦止血完成，用无菌生理盐水重新润湿肾脏，并&nbsp;在缝合线和皮肤钉合关闭小鼠前，轻柔地将肾脏复位至腹腔内。</li>
</ol>
小鼠的安乐死/复苏
<ol>
<li>使用带C-6 19mm针头的5-0丝线连续缝合关闭腹膜。</li>
<li>用镊子将皮肤切口两侧对合。</li>
<li>用 2 到 3 个皮钉将皮肤缝合。</li>
<li>用棉签蘸取生理盐水，清除小鼠皮肤上的血液。</li>
<li>立即对小鼠进行氟尼辛和丁丙诺啡的皮下注射治疗。</li>
<li>将小鼠放入笼中，该笼&nbsp;将小鼠置于加热垫上或加热灯下，直至其完全恢复活动。</li>
<li>2 周后拆除皮肤缝合钉。</li>
</ol>

<ol><li>Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inability+to+induce+tolerance+through+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Inability to induce tolerance through direct antigen presentation.</a> Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+transplant+rejection+following+treatment+with+anti-B7-2+and+anti-B7-1+antibodies.+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation.</a> Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+xenogeneic+pancreatic+islet+grafts+induced+by+CTLA4lg%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg.</a> Science. 257, 789-792 (1992).</li>
</ol>

本方案为在糖尿病或正常小鼠的肾包膜下干净、简便地输送胰岛或细胞提供了一种实用且高效的选择。该技术将胰岛或细胞浓缩并离心至最终用于移植的递送导管（PE50）中，从而在减少对细胞或小鼠造成不必要应激的同时，实现简便而有效的细胞移植。

<table><tbody><tr><td>外科手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-95(sz)</td><td></td></tr><tr><td>手术刷洗海绵</td><td>Moore Medical</td><td>42940AK</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Miltex Inc.</td><td>6-114 和 6-26</td><td>2 把带齿，2 把直型</td></tr><tr><td>解剖剪刀 n=2</td><td>Miltex Inc.</td><td>5-290</td><td></td></tr><tr><td>Oster 剃毛刀（40 号刀头）</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-305-10B</td><td></td></tr><tr><td>4×4 无菌纱布垫</td><td>Moore Medical</td><td>08252AK</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒垫</td><td>Moore Medical</td><td>08486AK</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-819-2</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Moore Medical</td><td>42508AK</td><td></td></tr><tr><td>23G 或 25G 针头</td><td></td><td></td><td>1&quot; 长</td></tr><tr><td>Cidex 溶液</td><td>Moore Medical</td><td>07535AK</td><td>用于器械清洁/消毒</td></tr><tr><td>PE50 聚乙烯导管</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td>PE50，外径 0.965 mm × 内径 0.58 mm</td></tr><tr><td>Cidex + 28 天溶液</td><td>Moore Medical</td><td>35625AK</td><td></td></tr><tr><td>硅胶导管</td><td>Spectrum Chromat.</td><td>123732</td><td>5/32&amp;#8221; 外径 × 1/32&amp;#8221; 内径</td></tr><tr><td>器械灭菌容器</td><td>Moore Medical</td><td>39074AK</td><td></td></tr><tr><td>直头移液器吸头</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0810</td><td>无菌</td></tr><tr><td>带螺杆驱动的玻璃注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>电灼器</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS230</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Moore Medical</td><td>41-067</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线</td><td>LOOK Surgical</td><td>754B</td><td>用于缝合（6-C）</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Moore Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 mm 自动缝合器</td><td>BD Biosciences</td><td>7630</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 缝合钉</td><td>BD Biosciences</td><td>7631</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 缝合钉拆除器</td><td>BD Biosciences</td><td>7637</td><td></td></tr></tbody></table>

将胰岛移植到糖尿病小鼠的肾包膜下

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

本方案旨在干净、简便地将胰岛或细胞移植到糖尿病或正常小鼠的肾包膜下。我们发现，在用于将细胞移植至肾包膜下的最终输送导管（PE50）中，将胰岛或细胞浓缩成团粒更为方便。该技术既提高了操作速度，又简化了步骤，同时减少了对细胞或小鼠造成的不必要应激。

加载：使用P200移液器和直型薄壁移液器吸头，小心地从1.5 mL微量离心管底部吸取已沉降、经手工挑选的胰岛或细胞沉淀。用一小段硅胶连接管将一段PE50管连接至移液器吸头。细胞在吸头内沉降后，通过缓慢调节移液器旋钮将细胞转移至PE50管中。当细胞接近PE50管末端时，将其弯折形成一个结，并将硅胶连接管套在结上固定。将PE50管转移至含有截断的5 mL移液管的15 mL锥形管中，并用胶带将PE50管固定在5 mL移液管侧壁，以防止离心过程中管子卷曲。使细胞达到1,000 rpm后停止离心。
移植：将受体小鼠麻醉后剃毛并清洁。在小鼠左侧 flank 部位做一小切口，暴露肾脏。用生理盐水浸湿的棉签保持肾脏、脂肪和组织湿润。将 PE50 管的远端通过硅胶连接管与装有移液枪头的 Hamilton 螺旋驱动注射器相连。在肾脏右侧 flank 部位做一个小切口，切口不宜过大或过深。将 PE50 导管的斜面端（靠近细胞的一端）小心地插入肾包膜下方，同时轻柔移动导管以开辟空间，并持续用生理盐水湿润；干燥的包膜容易撕裂。通过缓慢旋转注射器螺旋驱动装置，将一小段空气气泡注入包膜下。随后，胰岛细胞缓慢随气泡之后注入。胰岛注射完成后，保持肾脏稳定，并用低温电灼封闭切口。将肾脏复位至腹腔内，缝合腹膜并用钉合器关闭皮肤。小鼠立即皮下注射氟尼辛和丁丙诺啡，并置于带有加热垫的笼中恢复。

本方案旨在小鼠肾包膜下清晰、简便地移植胰岛或细胞。细胞在最终用于移植的导管中被浓缩成团。该技术操作简便，可减少对细胞和小鼠造成的应激损伤。

我们的方案旨在以简洁、便捷的方式将胰岛或细胞移植到糖尿病或正常小鼠的肾包膜下。我们发现，采用该方法进行操作更为简便……

您好，我叫 Greg Zod，来自加州大学旧金山分校（UCSF）糖尿病中心的 Bluestone 实验室。今天我将向您展示如何将胰岛移植到糖尿病小鼠的肾包膜下。该操作包括从同基因型或异基因型小鼠中分离纯化胰岛，然后将这些胰岛移植到糖尿病小鼠的肾包膜下。可自然发生糖尿病的小鼠，例如 NOD 小鼠，或通过注射链脲佐菌素（streptozotocin）人工诱导糖尿病的小鼠。现在我们准备手动挑选胰岛。我将手动挑选胰岛，并在用移液枪吸取时进行计数。我将去除组织中任何残留的a，仅通过光线在组织中的折射方式，就能分辨出哪些是孔眼，哪些不是孔眼。然后我会对孔眼进行计数，将其放入微量离心管中，收集起来用于移植。眼状结构看起来更致密，几乎呈微红色，而 R 中的 A 组织颜色较浅且更为蓬松，还带有发白的外观。因此，在采集眼状结构时，会混入一些 R 中的 A 组织，但只要主要获取的是眼状结构，就不会影响结果。你可以看到R组织中有一块较大的组织片段。然后这里有一个不错的环状结构，其上方还有另一个环状结构。不过，在它们之间有一些ACE-R，你可以适当调整位置，分别捕获各个环状结构。需要注意的是，我使用的是非锥形的移液器吸头。这种吸头管壁非常薄，且呈直筒状，有利于小孔更容易地插入和退出吸头。注意不要试图抓取淋巴结。这些是与胰腺相关的淋巴结，会在消化过程中被分解并纯化去除。我只在可能的情况下尝试抓取小孔结构，而将淋巴结留在原处。在手工挑选出眼状结构后，我已在该微型离心管底部收集到约500个游离的眼状结构。现在，我将把这些眼状结构转移至P150移液管中，用于移植。具体操作方法是：取一个移液枪头，缓慢吸取管底的眼状结构。当眼孔进入移液器吸头后，我将连接在B 50导管上的硅胶管取来，并用胶带将其固定在生物安全柜侧壁，使它们稳定在移液器吸头的尖端。一旦颗粒在移液器吸头内沉降完毕，我们便取下移液器，并通过调节移液器的旋钮（而非按压推杆）缓慢将颗粒推进导管中。在旋转移液器旋钮的同时，我同步移动导管。它们允许沉淀物进入P 50管。当沉淀物移动到距离管端约一英寸时，我弯折了管子以将沉淀物固定在其中。随后，我取下硅胶管并转移到弯折处。然后将其放入离心管中，使用已剪断的5毫升移液管。接着将管路折叠并用胶带固定在5毫升移液管上。现在即可进行离心融合。小鼠已被剃毛并麻醉，接下来我们将检查其对脚趾夹捏是否无反应。我将使用丙酮碘棉签清洁小鼠。手术以无菌方式进行，但所有器械的尖端均为无菌状态。在小鼠左侧 flank，脾脏右侧稍偏的位置，我将做一个小切口。切口应尽量小，以便固定住肾脏。分离肾脏时，需在肾脏正上方的腹膜壁处做一小切口，切开腹膜。只需一个动作，我将皮肤向左提起并向上、向下推动肾脏，就这样将其推出。我保持肾脏湿润，使用少量生理盐水和庆大霉素（一种抗生素）。用25号针头，我将在肾脏上划一个小切口，用于放置导管。不要用力过猛损伤肾脏，只需轻轻划开一个小口即可。你会看到一条细小的血线，这就说明你已经切入了肾包膜。取已斜面切割的P 50导管，我将从所做切口的下方边缘处穿入，并缓慢将导管插入囊膜下方。Pavel在操作过程中始终保持肾脏湿润，因为干燥的囊膜容易撕裂。一旦P 50导管进入囊膜下方，Pavo将使用带有螺旋推进装置的Hamilton注射器推进药丸。你可以看到穿刺针缓慢地逐渐进入。根据螺纹驱动来控制穿刺针的递送。一旦穿刺针送达位置，我使用干燥的纱布尖端擦拭该区域，然后利用电凝器封闭切口和肾脏。使用5-0丝线，抓住腹膜并进行缝合。采用连续缝合方式关闭小鼠切口。皮肤则使用皮肤缝钉闭合。在将小鼠唤醒之前，我会为其皮下注射bpro、胺类和氟尼松抗炎药以及镇痛剂。随后将小鼠放回饲养笼中，并置于加热垫上。刚才我已向您演示了如何将眼片移植到小鼠肾包膜下。这是一个用于研究移植耐受或糖尿病治疗方法的优秀模型。在我们实验室中，我们利用该模型来研究调节性T细胞（tregs）对胰岛细胞移植的影响，或通过不同的共刺激阻断分子诱导耐受的效果。

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Biology

生物学

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