测绘细菌功能的网络和途径大肠杆菌
2012年11月12日
系统，大型合成基因（基因或基因上位性）互动屏幕可用于，探索遗传冗余和途径串扰。在这里，我们描述了一种高通量的定量合成基因阵列筛选技术，被称为ESGA我们制定的，阐明互作关系，并探索遗传相互作用网络大肠杆菌。
该程序的目的是研究细菌基因和通路之间的功能关系。这是通过首先制备一系列 ceia coli 来实现的，ceia coli 是将被偶联或交配的单个突变菌株。第二步是在平板上以阵列形式偶联单个突变体。
接下来，选择双突变体。最后一步是对双突变板进行成像并量化双突变菌落以确定菌株适应性。最终，分析菌落大小数据以计算遗传相互作用评分并识别功能相互作用的基因、途径和过程。
与随机诱变等现有方法相比，该技术的主要优点是可以产生许多单独的双突变菌株。此外，无论基因大小、必要性或单基因突变体适应性如何，都可以同时评估许多基因之间的相互作用。这种方法可以帮助回答系统生物学领域的关键问题，例如与基因功能以及通路和过程之间的功能串扰有关的问题。
这项技术的影响延伸到细菌感染的治疗，因为关于大多数功能中心基因和过程的知识，以及了解细菌基因、途径和过程的哪些组合在受到干扰时可以改善或减少细菌适应性，将有助于制定最有效的干预策略开始此协议。两步嵌套。如书面程序中所述，采用 PCR 扩增将来自 PKD 三个质粒的氯霉素抗性标记物替换目标开放阅读框。
确认预期产物并按照制造商的方案对获得的片段进行 PCR 纯化。在 30 μL 无菌蒸馏水中洗脱 PCR 产物后，稀释至约 50 mg/μL 浓度。纯化产物在转化前储存在零下 20 摄氏度。
接下来，准备高频重组或 HFR Caval 感受态细胞，用于供体构建。首先将 1 毫升 HFR Cavalli 菌株的饱和过夜培养物接种到 70 毫升新鲜 LB 培养基中，每毫升 35 微升 50 毫克。氨苄青霉素，装在 250 毫升烧瓶中。
在32 摄氏度下以 220 RPM 轻轻摇动培养物，直至获得约 0.5 至 0.6 的光密度。然后将培养物转移到水浴中，在 42 摄氏度下对 Lambda Red Recombination 系统进行热诱导 15 分钟，并以 160 RPM 振荡以停止诱导。将培养物以 160 RPM 的转速转移到冰浆水浴中 10 至 20 分钟。
确保将细胞保持低温，直到转化后。按照书面方案中的说明通过离心洗涤和收获细胞后，倒出番泻叶并将沉淀重悬于 500 微升冰冷的 10% 甘油 Eloqua 中。将 50 μL 体积的细胞放入单独的预冷 1.5 mL 微量离心管中，并立即进行转化。
将 100 ng 纯化的基因缺失盒添加到感受态细胞中。轻弹试管，让悬浮液在冰上静置 5 分钟。然后将悬浮液转移到预冷的电穿孔 vete electro 中，立即作细胞混合物。
加入 1 mL 室温 SOC 培养基，将培养基中的电穿孔细胞转移到 15 mL 培养管中。将细胞在 32 摄氏度下孵育 1 小时，并以 220 RPM 的转速摇动轨道。孵育后，将 4， 400 倍 G 的细胞离心 5 分钟。
在室温下，去除大约 850 μL 的旋腹液，并将细胞沉淀重新悬浮在剩余的液体中。将细胞铺在含有 17 μg/mL 氯霉素的 LB 平板上，并在 32 摄氏度下孵育过夜。第二天，在 LB 氯霉素平板上划线出两个单独的转化体以进行突变确认，在 LB 罐霉素板上划线相同的转化体，以确认菌株不耐药。
接下来，按照书面方案中的说明，用三组不同的敲除确认引物扩增 DNA。第一个引物组由位于目标区域上游 200 个碱基对的 20 个核苷酸侧翼正向引物和一个反向引物组成，该引物与氯霉素抗性盒互补。这种扩增预计会产生 445 个核苷酸的扩增子。
第二组包括一个正向引物、一个跪在氯霉素抗性盒序列上和一个反向侧翼确认引物，该引物旨在在缺失基因的三个主要末端下游找到 200 个碱基对。该扩增反应预计会产生 309 个核苷酸的扩增子。第 3 次 PCR 包含上游和下游侧翼引物。
需要该反应来确认所选菌株不是骨髓二倍体，其中一个基因位点已被盒替换，另一个重复但其他野生型基因拷贝仍然存在。这种扩增预计会产生 1.4 KB 的产物。大肠杆菌 ke io 单个非必需基因缺失突变体集合被自动复制至 24 384
。嗯，每孔含有 80 微升液体 LB 培养基的微孔板。补充 50 μg/mL 的 Can Mycin 为边界对照菌株腾出空间，该菌株作为阳性对照缺乏，并有助于平板标准化以及自动菌落定量。从每个板的最外层孔中取出接种的培养基，并将其转移到新板中，将最外层的孔留空。
同样，通过从每个板内的不同位置去除任意两个菌株并将菌株转移到新板来产生阴性对照点。接下来，用每毫升含 17 微克氯霉素的 LV 培养基填充空孔，包括边界对照孔和阴性对照孔。预计这些阴性对照点在受体中是空的，因此是双突变板。
它们用于确保在对板进行编号、成像或固定时没有处理或板处理错误。按照书面程序中的说明制备边界阳性菌株后，将阵列菌株和边界阳性菌株在 32 摄氏度下以 190 RPM 轨道振荡过夜，第二天用大约 80 微升的过夜培养物填充边界孔。组装好的板可用于配接，如下一节所述。
或者，对于长期储存，受体板中的每个孔都补充有 15% 甘油，并将培养基和甘油混合。然后将板储存在零下 80 摄氏度。通过培养 HFR 供体菌株开始交配程序，该菌株携带用氯霉素抗性盒标记的查询基因缺失，在 32 摄氏度下在含有每毫升氯霉素针 17 微克的富 LB 液体培养基中过夜。
TH 将 3 84 个菌落密度的受体突变体收集到固体 LB 平板上。补充每毫升 50 微克罐装霉素。平行将 3 84 菌落密度的供体查询突变菌株固定到相同数量的 LB 平板上。
补充每毫升 17 微克氯霉素。将板在 32 摄氏度下孵育过夜以结合菌株。将来自 3 84 个菌落过夜供体板的供体固定在固体 LB 板上。
然后将来自单个 3 84 菌落过夜受体板的菌株固定在新鲜固定的供体上。将固定的偶联板在 32 摄氏度下孵育 16 至 24 小时。接下来，将每个 384 密度偶联板固定到含有氯霉素的单个固体 LB 板上。
mycin 可以重复这个过程直到所有偶联板都被固定吗？将新鲜固定的第一个筛选板在 32 摄氏度下孵育 16 至 36 小时。孵育后，将每个第一选择板重新固定到 1536 SPOT 格式的第二个双药物选择板上，以便每个第一选择菌落由四个菌落表示。
在第二个选择板上，将板孵育 16 至 36 小时。在 32 度 oss 拍摄最终的双突变体选择板，以定量测量突变体的生长适应性并分析基因对之间的相互作用。由于同一通路中的基因显示出密切相关的 GI 模式，因此可以根据其 S 评分概况的总体相似性对功能相关基因进行聚类。
GI 谱相似性代表两个基因突变时表型的一致性，应指示两个基因是否在相同或重叠的通路中起作用。这里显示的是编码物理相互作用蛋白质的基因对与随机绘制的基因对的 GI 谱之间的相关系数分布。两个转运蛋白的相关遗传图谱的散点图示例，这些转运蛋白形成精子排泄所需的异源三聚体复合物，如酵母 ecoline 基因所示。
减轻与高度相关的 GI 谱的相互作用往往会编码物理相关或在共同生化途径中连贯作用的通路。这里显示了一个具有代表性的例子，其中功能冗余的 ISC 和 SUF 铁硫生物合成途径的组成部分共同参与一个基本过程，形成不同的簇，这些簇通过广泛的加重相互作用连接在一起。统计测量可用于查找特定通路组合之间相互作用的任何显着富集、GI 网络与物理相互作用的整合以及其他功能关联数据，例如基因组环境。
关系可以揭示定义细菌核心生物系统的高阶功能模块的组织。聚类分析也可以应用于 GI 网络，以预测注释基因的功能。由于聚类算法各不相同。
然而，通过聚类确定的推定功能分配需要独立的实验验证。在尝试此过程时，重要的是要记住包括所有必要的积极和消极遵循此程序。可以进行其他方法，如蛋白质组学、生化随访实验和化学基因组学，以回答有关特定基因功能以及基因和通路之间功能关系性质的其他问题。
观看本视频后，您应该对如何构建双突变菌株、组装受体阵列和进行 ESGA 筛选以研究大肠杆菌中基因和过程之间的功能关系有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种高通量定量合成基因阵列筛选技术，称为eSGA，旨在阐明大肠杆菌中的上位关系并探索遗传相互作用网络。该方法涉及通过系统的遗传相互作用筛选来研究细菌基因和通路之间的功能关系。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 微生物学
- 系统生物学
背景
- 理解遗传冗余和通路交叉对解读复杂的生物系统至关重要。
- 合成遗传相互作用筛选提供了基因功能和相互作用的洞见。
- 大肠杆菌作为研究遗传相互作用的模式生物。
- 高通量筛选技术增强了同时分析多重遗传相互作用的能力。
研究目的
- 研究细菌基因之间的功能关系。
- 探索大肠杆菌中的遗传相互作用网络。
- 开发一种强大的筛选技术来阐明上位关系。
使用的方法
- 制备大肠杆菌单突变株阵列。
- 在平板上以阵列格式结合单突变体。
- 从结合的阵列中选择双突变体。
- 成像和定量双突变体菌落以确定菌株适应性。
主要结果
- 识别功能相互作用的基因和通路。
- 根据菌落大小数据计算遗传相互作用评分。
- 洞察大肠杆菌的遗传相互作用网络。
- 展示eSGA技术在遗传学研究中的有效性。
结论
- eSGA技术是探索遗传相互作用的强大工具。
- 这种方法增强了我们对细菌基因功能和通路的理解。
- 未来的应用可能扩展到其他生物体和复杂的生物系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
Systematic mapping of genetic interactions in Escherichia coli using high-throughput synthetic genetic arrays (eSGA) enables unbiased discovery of functional gene networks and pathway dependencies. This approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at early discovery inflection points. Comprehensive GI mapping supports portfolio decisions by revealing pathway-level vulnerabilities and synthetic lethality relationships relevant to antibacterial strategy development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic dependencies and pathway crosstalk for functional target validation.
- Supports biological de-risking by identifying synthetic lethal and buffering interactions among gene pairs.
- Facilitates predictive confidence in selecting and triaging antibacterial targets based on network centrality.
Screening & Assay Development
- Prepares validated double mutant arrays for robust, quantitative assessment of gene-gene interactions.
- Standardizes colony fitness measurements to ensure reproducibility and comparability across screens.
- Enables scalable, high-throughput screening of genetic interactions for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional gene network mapping with identification of essential pathways for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical validation of antibacterial intervention points.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying pathway redundancy and compensatory mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The eSGA platform integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation for antibacterial programs.
- Discovery Biology: Systematically tests genetic hypotheses and clarifies pathway interdependencies through quantitative GI scoring.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative colony fitness data for robust comparison of genetic perturbations.
- Analytics: Provides statistical GI scores and clustering outputs to identify functionally related gene modules.
- Translational Research: Connects genetic network insights to preclinical models for biomarker and target prioritization.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for mapping genetic interactions across bacterial strains and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Delivers standardized, high-throughput, and reproducible genetic interaction data.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early discovery portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibacterial targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, high-throughput screening, and quantitative data analysis.
- Demands automated colony imaging and robust image processing infrastructure for fitness quantification.
- Necessitates cross-team standardization of mutant collections, controls, and data normalization protocols.
- Adaptation to other bacterial species or genetic backgrounds may require protocol optimization.
- Functional assignments from clustering analyses require independent experimental validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
Constructing Non-essential Query Deletion in an Hfr Cavalli Donor Strain
6:42
Arraying E. coli F-Recipient Mutants for E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) Screens
8:45
High-density Strain Mating Procedure to Generate E. coli Double Mutants
11:01
Results: Representative Analyses of Genetic Interaction (GI) Scores for Determining Pathway-level Functional Relationships
13:16
Conclusion
