用于构建携带多个基因敲除的酵母菌株的Green Monster流程

本实验的总体目标是构建携带多个基因缺失并以绿色荧光蛋白报告基因标记的酵母菌株。该目标的实现分为两个步骤：首先，构建称为“前体突变体”（pro monsters）的单倍体单基因突变株，每个突变体中目标基因被一个 GFP 基因缺失盒所取代；第二步，利用两套二倍体和单倍体筛选标记（分别称为 GM 工具箱 A 和 GM 工具箱 alpha），通过酵母菌株的交配与减数分裂重组，对这些基因缺失进行组合与分离。

接下来，利用流式细胞术从减数分裂后的细胞群体中筛选出高荧光强度的细胞，以富集携带两个基因缺失的菌株。最后一步是确认分选后菌株的基因型。最终，以获得的菌株为起点，通过多轮重复的交配操作和流式细胞术富集，可构建出含有更多基因缺失的多重缺失菌株。

与现有的标记物重复利用和连续基因删除方法（如G方法）相比，该技术的主要优势在于每个循环可获得多个基因删除，从而更快地构建多重突变体。在按照本视频配套书面方案生成pro monster后，通过在1.6毫升eend orph管中培养已建立的pro monster GFP基因删除株系来启动有性循环。将交配型A的删除株接种于100微升缺乏组氨酸的合成完全培养基（称为–his培养基）中；同时将交配型α的删除株接种于另一支1.6毫升eend orph管中，加入100微升缺乏亮氨酸的合成完全培养基（即–lu培养基），以利于气体交换。

使用经70%乙醇处理的图钉在试管盖上打孔。将试管在30摄氏度下水平旋转过夜。旋转轴必须与试管的长轴平行。

根据光密度估算，将约250,000个GFP缺失型单倍体a细胞和250,000个GFP缺失型单倍体α细胞混合于1.6毫升离心管中。该细胞数量通常对应每种过夜培养物涡旋混匀后的七微升。将细胞进行处理时，首先以800 ×g离心两分钟。

去除上清液后，使用经70%乙醇处理的图钉在盖子上打孔。为允许气体交换，加入50 µL YPDA培养基，短暂涡旋混匀后，在800 ×g离心5分钟收集菌体。然后将离心管置于由空枪头盒、小型枪头架和湿润的纸巾制成的湿盒中。

在30摄氏度下将盒子孵育过夜。取10微升交配混合物，转移至含有500微升无琼脂的GNA培养基中，该培养基中添加有G418和那他霉素两种抗生素，置于5毫升培养管中，管盖松开，起始光密度（600纳米处）约为0.1。在30摄氏度下旋转培养24小时。

这使得能够筛选出二倍体，因为只有同时含有GM工具包A中的MX四和nat MX四的二倍体才能在G四18和Nat存在下生长。将一天培养物转移20微升至500微升含有G四18和Nat的新鲜GN培养基中。起始光密度在600纳米处约为0.2。

将试管在 30 摄氏度下旋转培养五小时，使细胞进入对数生长期。随后，关联二倍体并分离孢子。请遵循书面实验方案中所述的步骤进行操作。

将SPO相关细胞的悬液均分为两份，每份300微升，分别加入两个1.5毫升的eend或ph管中。以800 ×g离心5分钟。弃去上清液S后，在每个管盖上打一个孔。

使用推针，向一个离心管的沉淀中加入 100 微升不含组氨酸的培养基。为筛选另一个离心管中的 a 型单倍体，加入 100 微升不含亮氨酸的培养基。以筛选 α 型单倍体。

将试管在30摄氏度下旋转过夜。600纳米处的最终光密度应低于0.5。如果600纳米处的光密度在室温下倾向于过高，则进行三元处理。

为诱导GFP表达，向不同菌株中加入100微升含有20微克/毫升多西环素的新鲜缺组氨酸培养基或缺亮氨酸培养基。多西环素的终浓度为10微克/毫升。涡旋混匀后，在30°C下旋转培养两天。

开始流式细胞术时，将900微升预过滤的TE缓冲液加入一个5毫升聚丙烯管中，管盖替换为5毫升聚苯乙烯管的细胞滤网帽。聚丙烯管适用于流式细胞术。使用滤网帽旨在去除大颗粒物质。

轻轻将 75 微升缓冲液加入细胞滤筛帽中。在按压移液器吸头紧贴滤网的同时，将 25 微升诱导后的细胞加入帽中的溶液。将全部混合溶液通过滤筛推挤滤出。

压下过滤器盖，涡旋混匀离心管。准备收集管，即含有200 µL无血清或无滋养层培养基的1.6 mL离心管。启动细胞分选仪，并根据制造商手册调整设置。

涡旋收集管，使培养基覆盖管壁。在将细胞上样至细胞分选仪之前，也需涡旋含有细胞的管。采集样品的流式细胞术数据。

不含GFP的菌株可作为阴性对照。绘制分选门控以排除细胞聚集体，因为聚集体可能表现出较高的GFP强度。利用前向散射（FSC）的脉宽与脉高图，或FSC面积与FSC高度图，排除在前向散射中脉宽或面积异常过大的离群值。

由于细胞聚集体的前向散射光（FSC）信号较强，因此仅选取FSC值较低的下层20%的细胞。应避开FSC和侧向散射光（SSC）信号最低的区域，这些区域通常含有细胞碎片。SSC与GFP信号通常呈正相关。

为避免富集高SSC值的细胞，使用GFP强度与SSC的散点图，在细胞群边缘绘制门控区域，从而沿SSC轴整体选取相同比例的最亮细胞。在此步骤之前，使用FSC和SSC门控所选亚群的0.1%至1%应标记为分选目标，将200个细胞分选至收集管中。涡旋混匀收集管，使分选后的细胞完全浸入培养基中。

用于基因分型的 A-Y-P-D-A 平板上的部分细胞。在培养后，将平板于 30 摄氏度下孵育两天。制备约 12 个菌落的裂解液。

按照基因分型书面实验方案中所述步骤进行操作。使用10 µL的PCR反应体系，加入1 µL稀释后的裂解液和一条上游引物进行分析。该上游引物针对每个缺失基因的上游侧翼区域，与一条通用引物配对使用，该通用引物结合于所有缺失位点内的共同区域。

PCR 可在 96 孔或 384 孔板中进行，扩增完成后，通过电泳分析 PCR 产物。

筛选可能具有目标基因型的单倍体菌株。将这些菌株接种至新鲜培养基平板上进行培养。同时，用25%甘油在-80摄氏度条件下进行冷冻保存。

建议进行其他检测，例如验证缺失基因的野生型序列不存在，以及进行脉冲场凝胶电泳。使用有价值的菌株重复有性循环。由两个菌株杂交产生的单倍体后代被诱导表达绿色荧光蛋白（GFP）。

利用流式细胞仪设置门控，针对每个基因敲除的GFP标记筛选出相应的细胞群体，该群体中不太可能含有碎片或细胞聚集体。根据前向散射面积和前向散射高度对细胞进行门控，分选出并保留最亮的1%细胞。

细胞聚集体通常具有异常大的前向散射面积，因此在根据前向散射和侧向散射进行设门时，排除了前向散射信号最低的20%的细胞，同时通过基于侧向散射和GFP信号的设门排除了具有最低前向散射和侧向散射的碎片。在特定侧向散射范围内，选择其中荧光更强的细胞，以便对表达GFP的实验组与不表达GFP的阴性对照样本进行比较。用于选择P3细胞群的设门策略同样适用于图中所示的阴性对照样本。对于在独立单倍体样本中以相同方式筛选出的细胞，在诱导其表达GFP并根据荧光进行分选后，通过PCR进行分析。未经分选的细胞由于随机分离所产生的预期缺失数目为7.5。

在此特定实验中，分选后的细胞平均缺失数为 8.8 ± 0.3，其中包括 5 个含有 10 个缺失的细胞。DO 基因型。使用反向引物对分选菌株的 PCL 进行检测。

该10与下游侧翼区配对的正向引物结合，该10延伸至表达盒的末端。条带的存在表明GFP表达盒的存在。

观看本视频后，您应该能够充分掌握如何使用绿色 Monster Method 在酵母中构建缺失突变。