Name: 绿色怪物承载多基因缺失的酵母菌株的产生过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学习使用绿色怪物方法在酿酒酵母中构建多基因缺失菌株。该方法通过GFP荧光标记和流式细胞术富集，实现高效的基因工程操作，适用于酵母遗传学研究。

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本研究工作得到了美国国防高级研究计划局合同 N66001-12-C-4039（授予 Y.S.）、阿尔弗雷德·P·斯隆基金会资助、美国国立卫生研究院资助项目 R01 HG003224 和 R21 CA130266（授予 F.P.R.）的支持。F.P.R. 还获得了加拿大先进研究院博士后奖学金以及加拿大卓越研究讲席计划的支持。

1. ProMonsters 的构建
<ol>
	<li>通过使用引物扩增质粒 pYOGM012（氨苄青霉素抗性）中的 tetO2-GFP 标记和 URA3 标记，制备通用的 GFP 替换盒，引物序列为： 
	GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCCCAAGCTCCTCGAGTAATTCG 和 GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCACGTACCGGGTAATAACTGATATAAT（加粗区域提供与 KanMX4 盒侧翼区域的同源性，以实现靶向替换）。PCR 反应应使用 Phusion 聚合酶、HF 缓冲液和 3% 二甲基亚砜（New England BioLabs）进行，模板 DNA 浓度起始为 0.5 ng/μl。PCR 程序为 98 °C 预变性 30 秒，随后进行 35 个循环：98 °C 变性 10 秒，49 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1.5 分钟。反应体积应 &gt; 50 μl，以确保每次转化实验有足够的 DNA。我们使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen）纯化产物，每根柱子处理约 50 μl PCR 反应液，但跳过纯化步骤可能提高转化子的产量。 
	或者，可通过使用限制性内切酶 EcoRI（New England BioLabs）消化质粒 pYOGM057（氨苄青霉素抗性），释放包含 tetO2-GFP 和 URA3 标记以及用于 KanMX4 靶向的同源区域的片段。该反应中 DNA 浓度应约为 30 ng/μl。反应体积应 &gt; 34 μl。 
	若需将 GFP 盒整合至 KanMX4 以外的区域，请调整上述 PCR 引物的同源区域，使其对应适当的同源序列。</li>
	<li>使用通用 GFP 缺失盒转化来自 KanMX4 酵母基因敲除文库12 的 a 型单倍体菌株。按照 Woods 和 Gietz13 的方案，每次转化实验应使用 34 μl DNA 样品（纯化的 PCR 产物或未经纯化的限制性酶切产物）。将转化混合物的五分之一涂布于 CAA-Ura 平板（0.67% 酵母氮源基础培养基，2% 葡萄糖，0.6% 酪蛋白氨基酸，0.0025% 半硫酸腺嘌呤，0.005% 色氨酸，2% 琼脂）上。</li>
	<li>将转化子划线接种至新鲜的 CAA-Ura 平板上，以获得单菌落。</li>
	<li>将单菌落的细胞转移至含 200 μg/ml G418 的 YPDA 平板上，确认其无法生长，以验证基因缺失。为确认 GFP 成功整合，请按步骤 (1.5)–(1.9) 进行菌落 PCR。</li>
	<li>取单菌落的细胞加入 2 μl 裂解缓冲液（0.1 M 磷酸钠，pH 7.4，含 ZymoResearch 提供的 1 单位蜗牛酶）中，置于 0.2 ml PCR 管或 96 孔板的孔中。通过移液枪头反复吸打混合溶液。</li>
	<li>使用 P200 Pipetman（Gilson）加入一滴（约 20 μl）矿物油覆盖液面。</li>
	<li>将混合物在 37 °C 孵育 20 分钟，随后在 95 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 50 μl 水稀释裂解液。通过移液枪头反复吸打十次混合。</li>
	<li>使用 10 μl PCR 反应体系分析 1 μl 裂解液，包括：(A) 与上游侧翼区域结合的正向引物与序列 CCTGAGAAAGCAACCTGACC 的引物配对（距盒起始位置 285 bp），(B) 与下游区域结合的反向引物与序列 GCATTGGGTCAACAGTATAG 的引物配对（距盒末端 375 bp），(C) 与 KanMX4 结合的两个引物（序列分别为 CGTACTCCTGATGATGCATG 和 GACGAAATACGCGATCGCTG，扩增产物 181 bp），以及 (D) 与目标基因野生型序列结合的两个引物（图 4）。(D) 至关重要，因为已知约 8% 的基因敲除文库菌株存在非整倍体现象14。正确的转化子应对 (A) 和 (B) 呈阳性，对 (C) 和 (D) 呈阴性。</li>
	<li>为将 GMToolkit 引入转化子，取转化菌株约 250,000 个细胞与 RY0146（含 GMToolkit-a）或 RY0148（含 GMToolkit-α）的 250,000 个细胞一同加入 1.6 ml Eppendorf 管中。涡旋混匀。RY0146 和 RY0148 的基因型分别为 MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ::GMToolkit-a [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-Sp-his5] 和 MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ::GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr-LEU2]。pr 表示启动子。细胞数量应根据前培养物的光密度估算。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 2 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>为允许气体交换，使用经 70% 乙醇处理的图钉在管盖上打孔。</li>
	<li>加入 50 μl YPDA 培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，0.003% 半硫酸腺嘌呤）。涡旋混匀。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>将离心管放入湿润盒中。湿润盒可用空的枪头盒、小型枪头架和一张湿润的纸巾制成。</li>
	<li>在 30 °C 条件下过夜孵育。</li>
	<li>首先将细胞划线接种于 CAA-Ura 平板上，筛选交配成功的二倍体。将平板在 30 °C 孵育一天。</li>
	<li>取大量生长区域的细胞，划线接种于含 200 μg/ml G418 的 YPDA 平板（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，0.003% 半硫酸腺嘌呤，2% 琼脂）上，以筛选含 GMToolkit-a 的二倍体；或接种于含 100 μg/ml 诺尔斯硫霉素（Nat）15 的 YPDA 平板上，以筛选含 GMToolkit-α 的二倍体，获得单菌落。</li>
	<li>将平板在 30 °C 孵育 3 天。</li>
	<li>从单菌落开始，将大部分细胞转移至 5 ml 培养管中含 500 μl 无琼脂的 GNA 培养基（1% 酵母提取物，3% Difco 营养肉汤，5% 葡萄糖；将葡萄糖与其他组分分别配制成 2× 溶液后高压灭菌，以避免焦糖化）中，并松开管盖。</li>
	<li>在 30 °C 水平旋转培养 5 小时。旋转轴必须与试管的长轴平行。</li>
	<li>通过将 (1.21) 中使用的菌落划线接种于 CAA-Ura 平板上，确认其为 Ura+。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 2 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>加入 500 μl 最小孢子形成培养基（1% 乙酸钾，0.005% 乙酸锌；过滤除菌）。涡旋混匀。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 2 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 (1.25)–(1.26) 两次。</li>
	<li>加入 1 ml 最小孢子形成培养基，并补充 7.5 μg/ml 赖氨酸、7.5 μg/ml 亮氨酸、5 μg/ml 组氨酸、5 μg/ml 蛋氨酸和 1.25 μg/ml 尿嘧啶（以提高营养缺陷型菌株的孢子形成率）。涡旋混匀。</li>
	<li>在室温下旋转培养一天。</li>
	<li>在 30 °C 条件下旋转培养 2 天。</li>
	<li>取 125 μl 上述混合液，于 1.6 ml Eppendorf 管中在 800 x g 条件下离心 2 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>加入 50 μl 蜗牛酶溶液（100 mM 磷酸钠缓冲液，pH 7.4，1 M 山梨醇，含 ZymoResearch 提供的 2 单位蜗牛酶）。通过移液枪头反复吸打混合。</li>
	<li>在 30 °C 孵育 1 小时。</li>
	<li>加入 50 μl 0.02% NP-40。通过移液枪头反复吸打混合。</li>
	<li>将离心管在室温下静置 5 分钟。</li>
	<li>加入 500 μl 水。</li>
	<li>将离心管置于冰上。</li>
	<li>使用 Sonifier 450（Branson）配备 3.2 mm 微型探头，在输出功率 1（最弱档）条件下对该混合液进行两次超声处理，每次 15 秒。两次超声之间将离心管放回冰上，使温度恢复至约 0 °C。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>根据交配组合是用于引入 GMToolkit-a 还是 GMToolkit-α，加入 200 μl SC-Ura-His（a）或 SC-Ura-Leu（α）培养基。培养基配制方法：先配制 SC-Ura-His-Leu 培养基（0.67% 酵母氮源基础培养基，2% 葡萄糖，0.01% 精氨酸，0.01% 天冬氨酸，0.01% 谷氨酸，0.01% 异亮氨酸，0.01% 赖氨酸，0.01% 蛋氨酸，0.01% 苯丙氨酸，0.08% 丝氨酸，0.04% 苏氨酸，0.002% 酪氨酸，0.03% 缬氨酸，0.0025% 腺嘌呤，0.005% 色氨酸，0.003% 腺嘌呤，0.005% 色氨酸），使用前加入无菌的组氨酸或亮氨酸，使其终浓度为 0.01%。</li>
	<li>使用经 70% 乙醇处理的图钉在管盖上打孔。</li>
	<li>在 30 °C 水平旋转培养 2 天。旋转轴必须与试管的长轴平行。</li>
	<li>将细胞划线接种于 SC-Ura-His 或 SC-Ura-Leu 琼脂平板上（成分同上，另加 2% 琼脂；苏氨酸和天冬氨酸需在高压灭菌后加入；组氨酸或亮氨酸需在倒板前加入），以获得 ProMonster 菌株的单菌落。</li>
</ol>
2. 性周期
<ol>
	<li>根据交配型，将已建立的GFP缺失菌株在100 μl SC-His（a）或SC-Leu（α）培养基中，于30 °C过夜旋转培养，使用1.6 ml离心管。为保证气体交换，用经70%乙醇处理的图钉在管盖上打孔。将离心管水平旋转，旋转轴需与离心管的长轴平行。可通过大规模交配（en masse mating）同时进行多个菌株的杂交。若直接使用分选后的样品，则在200 μl培养基于30 °C培养细胞2天。配制培养基时，向SC-Ura-His-Leu培养基中添加尿嘧啶（终浓度：0.0025%）和组氨酸（0.01%）或亮氨酸（0.01%）。</li>
	<li>在1.6 ml离心管中混合250,000个a单倍体细胞和250,000个α单倍体细胞（均为GFP缺失菌株），涡旋混匀。</li>
	<li>按照步骤（1.11）–（1.17）进行细胞交配。</li>
	<li>取10 μl交配混合物转移至含500 μl GNA培养基的5 ml培养管中，培养基中含200 μg/ml G418和100 μg/ml Nat，管盖松开。起始OD600约为0.1。</li>
	<li>于30 °C旋转培养24小时。此步骤用于筛选二倍体，因为只有同时携带GMToolkit-a中的KanMX4和GMToolkit-α中的NatMX4的二倍体才能在G418和Nat存在下生长（图3）。</li>
	<li>取1天培养物20 μl转移至500 μl新鲜GNA培养基（含G418和Nat）中。起始OD600约为0.2。</li>
	<li>于30 °C旋转培养5小时，使细胞进入对数生长期（OD600约1）。</li>
	<li>按照步骤（1.24）–（1.38）进行二倍体的孢子形成及孢子分离。</li>
	<li>将孢子化细胞的悬液均分为两份，每份300 μl，分别放入两个1.5 ml离心管中。</li>
	<li>以800 × g离心5分钟，弃上清液。</li>
	<li>向其中一管的沉淀中加入100 μl SC-His培养基以筛选a单倍体；向另一管的沉淀中加入100 μl SC-Leu培养基以筛选α单倍体。</li>
	<li>于30 °C旋转过夜培养。最终OD600应低于0.5。若OD600过高，可尝试在室温下培养。</li>
	<li>为诱导GFP表达，向各管中加入100 μl含20 μg/ml多西环素的新鲜SC-His（a）或SC-Leu（α）培养基，多西环素终浓度为10 μg/ml。涡旋混匀。</li>
	<li>于30 °C旋转培养2天。</li>
</ol>
3. 流式细胞术
<ol>
	<li>向一个5 ml聚丙烯管（BD Falcon #352063）中加入900 μl预过滤的TE缓冲液（pH 7.5），该缓冲液含有10 μg/ml多西环素，并将原管盖替换为来自5 ml聚苯乙烯管（BD Falcon #352235）的细胞筛网盖。聚丙烯管适用于流式细胞术，使用筛网盖有助于去除大颗粒杂质。</li>
	<li>轻轻将含多西环素的75 μl TE缓冲液加入细胞筛网盖上。</li>
	<li>将25 μl诱导后的细胞加入盖子上的溶液中。</li>
	<li>将Pipetman的吸头紧贴滤网，将全部混合溶液通过滤器推出。</li>
	<li>压下滤器盖，涡旋振荡试管。</li>
	<li>准备装有200 μl SC-His或SC-Leu的收集管（1.6 ml Eppendorf管）。</li>
	<li>启动细胞分选仪，并根据制造商手册调整设置。</li>
	<li>涡旋混匀收集管（使管壁均匀接触培养基）以及含有细胞的管，然后将其上样至细胞分选仪。</li>
	<li>获取样品的流式细胞术数据。不含GFP的菌株可作为阴性对照。</li>
	<li>绘制分选门控。(A) 为避免细胞聚集体（可能表现出较高的GFP强度）的影响，使用MoFlo分选仪时，通过前向散射光（FSC）的脉宽与脉高散点图，排除脉宽相对于脉高异常大的异常值；使用FACSAria分选仪时，通过FSC高度与FSC面积散点图，排除FSC高度异常小的异常值图5，左上方面板）。（B）由于细胞聚集体的FSC（面积）值较大，仅选取FSC下层20%的细胞，同时避开FSC和侧向散射（SSC）值最低的区域，这些区域通常含有细胞碎片（图5，右上面板）。（C）SSC（面积）与GFP信号（面积）通常呈正相关。由于仅根据上述门控选择最亮的细胞也会富集SSC值较高的细胞，因此需利用GFP强度与SSC的散点图，在群体边缘沿SSC轴绘制门控，以从SSC轴的每个区段中选取相同比例的最亮细胞图5（左下图）。在（C）中选中的细胞群体应为在（B）中选中的细胞群体的0.1%-1%。</li>
	<li>根据（3.10）中的标准，将200个细胞分选至收集管中。对于一个 大规模 对于需要更复杂细胞群体的实验流程或其他项目，可根据需要分选更多细胞。</li>
	<li>涡旋混匀收集管，使培养基覆盖分选后的细胞。</li>
	<li>在YPDA平板上接种部分细胞（例如50个细胞）用于基因分型。</li>
	<li>在30 °C下孵育平板2天。</li>
	<li>按照步骤（1.5）–（1.8）制备约12个菌落的裂解液。</li>
	<li>将步骤 (1.5) 中所用枪头上的残留细胞轻轻触碰含 G418 和 Nat 的 YPDA 平板上的指定位置。筛选出的单倍体不应在此平板上生长。二倍体可能含有更多的 GFP 拷贝，因此荧光可能更强。该检测可反映单倍体筛选的效率。</li>
	<li>用于基因分型时，取1 μl裂解液，使用10 μl PCR反应体系进行分析，其中上游引物针对每个缺失基因的上游侧翼区域，下游引物采用序列CCTGAGAAAGCAACCTGACC。 
	如果可能，进行多重 PCR 反应（可使用单个突变体的裂解液确定反应条件）。PCR 可在 96 孔或 384 孔板中进行，后者适用于低至 5 μl 的反应体积。含有不同引物的 PCR 主混合液的排列，以及将细胞裂解液加入这些混合液的操作，可使用多通道移液器或液体处理机器人完成。当将同一种裂解液加入不同的 PCR 混合液时，可选择不更换吸头。</li>
	<li>分析PCR产物。Gel XL Ultra V-2电泳系统（Labnet）支持使用多通道移液器加样。</li>
	<li>根据 (3.16) 和 (3.18) 的信息，鉴定具有目标基因型的潜在单倍体。</li>
	<li>在新鲜平板（YPDA、CAA-Ura 或 SC-Ura-His/Leu）上划线培养以活化菌株，并用 25% 甘油于 -80 °C 冻存。建议进行额外检测，如验证被敲除基因的野生型序列确实缺失，以及脉冲场凝胶电泳分析。</li>
	<li>从 (2.1) 开始，使用有用的菌株重复性循环。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

在开发Green Monster方法的过程中，我们关注到不同GFP替换盒之间可能发生重组，从而导致基因组重排。为了降低这种可能性，我们选择了成功经历多轮交配和减数分裂的细胞。携带重排基因组的细胞在与没有相同重排的细胞交配后，预期其适应性会降低。事实上，我们并未观察到由GFP盒之间重组引起的任何基因组不稳定性11。然而，我们不能完全排除这种可能性，因此建议用户对所获得的菌株进行重排检测。可采用脉冲场凝胶电泳来检测明显的异常，也可使用引物结合于缺失区域内序列的PCR方法来确认野生型序列的缺失。
根据已建立菌株的荧光水平，GFP 强度与缺失数目之间呈近乎线性的关系，表明在测试的一至十六个缺失范围内，饱和并非问题11。然而，即使在后续几轮实验中，针对具有大量非重叠缺失的菌株，每一轮中群体的平均缺失数目仅能增加约两个，而理论上，若能实现完美的GFP筛选严格性，则可一次性组合两个亲本菌株中所有缺失的并集。一个限制因素是同基因型细胞间GFP强度的细胞间差异。在代表性结果的第二个示例中，预计群体中仅有0.8%的细胞会包含此次杂交可能产生的全部11个缺失（...

<table><tbody><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720</td><td>溶于水并过滤除菌（使用0.2-&amp;mu;m滤器）。储备液浓度：200 mg/ml。4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>ClonNAT（nourseothricin）</td><td>WERNER BioAgents</td><td>5001000</td><td>溶于水并过滤除菌（使用0.2-&amp;mu;m滤器）。储备液浓度：100 mg/ml。4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>强力霉素（Doxycycline）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>溶于50%乙醇并过滤除菌（使用0.2-&amp;mu;m滤器）。储备液浓度：10 mg/ml。每四周新鲜配制一次。用铝箔避光，4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>Zymolyase</td><td>ZymoResearch</td><td>E1005</td><td></td></tr><tr><td>Difco 酵母氮源基础培养基（不含氨基酸）</td><td>BD</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Revolver（试管旋转仪）</td><td>Labnet</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Enduro Gel XL 电泳装置</td><td>Labnet</td><td>E0160</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 450</td><td>Branson</td><td>101-063-198</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 450 微型探头</td><td>Branson</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria 细胞分选仪</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MoFlo 细胞分选仪</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX 或同类自动化工作站</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>可选，用于构建基因分型PCR反应体系。</td></tr></tbody></table>

用于构建携带多个基因敲除的酵母菌株的green monster流程

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

基因缺失的表型通常只有在特定的遗传背景或环境条件下进行检测时才会显现1,2存在一些实例，需要删除多个基因才能揭示隐藏的基因功能3,4尽管存在重要发现的潜力，涉及三个或更多基因的遗传相互作用在很大程度上仍未被探索。由于基因缺失组合的数量极为庞大，对多突变体相互作用进行穷尽式搜索将不切实际。然而，针对特定基因集合的研究，例如具有更高冗余性的旁系同源基因集合， 先验的 具有共享共同功能的可能性，将具有参考价值。
在酵母Saccharomyces cerevisiae中，基因敲除是通过同源重组将基因替换为可筛选标记来实现的。由于可筛选标记的数量有限，已开发出用于移除并重复使用同一标记的方法5,6,7,8,9,10。然而，使用这些方法依次构建多个突变耗时较长，因为所需时间与待构建的缺失突变数量呈线性关系。
本文介绍了用于在酵母中常规构建多个基因缺失的Green Monster方法11。该方法将绿色荧光蛋白（GFP）报告基因整合至缺失位点，从而根据每个菌株所含缺失的数量对菌株进行定量标记（图1）。通过反复进行酵母交配与减数分裂，对携带GFP标记缺失的菌株进行分离，并结合流式细胞术富集含有更多缺失的菌株，从而实现缺失在菌株中的逐步累积（图2）。通过并行开展多个流程，每个流程每轮引入一个或多个缺失，可显著缩短菌株构建所需的时间。
第一步是制备称为“ProMonsters”的单倍体单突变株，每个菌株在其缺失位点携带一个GFP报告基因，并在can1Δ位点携带“工具包”位点之一——即Green Monster GMToolkit-a或GMToolkit-α（图3）。利用酵母基因敲除文库中的菌株12，可通过将这些菌株中已有的通用KanMX4盒替换为通用的GFP-URA3片段，便捷地构建带有GFP标记的缺失菌株。每种GMToolkit包含：特异于a或α交配型的单倍体筛选标记1，以及两个筛选标记中的一个；当两种GMToolkit同时存在时，这两个标记共同作用，可用于筛选二倍体。
第二步是进行有性循环，通过每次交配和产孢循环中伴随的随机分配和/或减数分裂重组，将缺失位点组合到单个细胞内。

当携带四个GFP标记缺失（ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ）的a型单倍体菌株与携带四个缺失（ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ）的α型单倍体菌株杂交时，两个菌株共享两个缺失（ycl033cΔ yer042wΔ），获得了一个代表性结果。将杂交混合物在含有G418和Nat的YPDA培养基中培养，以筛选双倍体。将获得的双倍体在孢子形成培养基中培养。通过溶壁酶处理和超声处理分散孢子，并在单倍体筛选培养基中使其萌发。随后诱导细胞表达GFP。利用流式细胞仪设置门控，选择出不太可能含有碎片或细胞聚集体的细胞群体（图5）。在此群体中，筛选出荧光最强的1%细胞。筛选后的细胞与未筛选细胞在形成菌落后进行基因分型。当随机挑选的菌落划线接种于含G418和Nat的YPDA平板时，未筛选样本中16个菌落中有2个菌落的细胞能够生长，而筛选样本中26个菌落中有18个菌落的细胞能够生长，表明部分双倍体在此实验的单倍体筛选和GFP诱导阶段获得了表达单倍体筛选标记的能力并得以增殖。...

Green Monster 方法能够快速组装多个缺失片段，并利用编码绿色荧光蛋白的报告基因进行标记。该方法基于使酵母菌株经历多次有性重组循环，并通过基于荧光的富集方式筛选携带更多缺失的细胞。

用于构建携带多个基因敲除的酵母菌株的Green Monster流程

基因缺失的表型通常只有在特定的遗传背景或环境条件下进行检测时才会显现1,2。

本实验的总体目标是构建携带多个基因缺失并以绿色荧光蛋白报告基因标记的酵母菌株。该目标的实现分为两个步骤：首先，构建称为“前体突变体”（pro monsters）的单倍体单基因突变株，每个突变体中目标基因被一个 GFP 基因缺失盒所取代；第二步，利用两套二倍体和单倍体筛选标记（分别称为 GM 工具箱 A 和 GM 工具箱 alpha），通过酵母菌株的交配与减数分裂重组，对这些基因缺失进行组合与分离。接下来，利用流式细胞术从减数分裂后的细胞群体中筛选出高荧光强度的细胞，以富集携带两个基因缺失的菌株。最后一步是确认分选后菌株的基因型。最终，以获得的菌株为起点，通过多轮重复的交配操作和流式细胞术富集，可构建出含有更多基因缺失的多重缺失菌株。与现有的标记物重复利用和连续基因删除方法（如G方法）相比，该技术的主要优势在于每个循环可获得多个基因删除，从而更快地构建多重突变体。在按照本视频配套书面方案生成pro monster后，通过在1.6毫升eend orph管中培养已建立的pro monster GFP基因删除株系来启动有性循环。将交配型A的删除株接种于100微升缺乏组氨酸的合成完全培养基（称为–his培养基）中；同时将交配型α的删除株接种于另一支1.6毫升eend orph管中，加入100微升缺乏亮氨酸的合成完全培养基（即–lu培养基），以利于气体交换。使用经70%乙醇处理的图钉在试管盖上打孔。将试管在30摄氏度下水平旋转过夜。旋转轴必须与试管的长轴平行。根据光密度估算，将约250,000个GFP缺失型单倍体a细胞和250,000个GFP缺失型单倍体α细胞混合于1.6毫升离心管中。该细胞数量通常对应每种过夜培养物涡旋混匀后的七微升。将细胞进行处理时，首先以800 ×g离心两分钟。去除上清液后，使用经70%乙醇处理的图钉在盖子上打孔。为允许气体交换，加入50 µL YPDA培养基，短暂涡旋混匀后，在800 ×g离心5分钟收集菌体。然后将离心管置于由空枪头盒、小型枪头架和湿润的纸巾制成的湿盒中。在30摄氏度下将盒子孵育过夜。取10微升交配混合物，转移至含有500微升无琼脂的GNA培养基中，该培养基中添加有G418和那他霉素两种抗生素，置于5毫升培养管中，管盖松开，起始光密度（600纳米处）约为0.1。在30摄氏度下旋转培养24小时。这使得能够筛选出二倍体，因为只有同时含有GM工具包A中的MX四和nat MX四的二倍体才能在G四18和Nat存在下生长。将一天培养物转移20微升至500微升含有G四18和Nat的新鲜GN培养基中。起始光密度在600纳米处约为0.2。将试管在 30 摄氏度下旋转培养五小时，使细胞进入对数生长期。随后，关联二倍体并分离孢子。请遵循书面实验方案中所述的步骤进行操作。将SPO相关细胞的悬液均分为两份，每份300微升，分别加入两个1.5毫升的eend或ph管中。以800 ×g离心5分钟。弃去上清液S后，在每个管盖上打一个孔。使用推针，向一个离心管的沉淀中加入 100 微升不含组氨酸的培养基。为筛选另一个离心管中的 a 型单倍体，加入 100 微升不含亮氨酸的培养基。以筛选 α 型单倍体。将试管在30摄氏度下旋转过夜。600纳米处的最终光密度应低于0.5。如果600纳米处的光密度在室温下倾向于过高，则进行三元处理。为诱导GFP表达，向不同菌株中加入100微升含有20微克/毫升多西环素的新鲜缺组氨酸培养基或缺亮氨酸培养基。多西环素的终浓度为10微克/毫升。涡旋混匀后，在30°C下旋转培养两天。开始流式细胞术时，将900微升预过滤的TE缓冲液加入一个5毫升聚丙烯管中，管盖替换为5毫升聚苯乙烯管的细胞滤网帽。聚丙烯管适用于流式细胞术。使用滤网帽旨在去除大颗粒物质。轻轻将 75 微升缓冲液加入细胞滤筛帽中。在按压移液器吸头紧贴滤网的同时，将 25 微升诱导后的细胞加入帽中的溶液。将全部混合溶液通过滤筛推挤滤出。压下过滤器盖，涡旋混匀离心管。准备收集管，即含有200 µL无血清或无滋养层培养基的1.6 mL离心管。启动细胞分选仪，并根据制造商手册调整设置。涡旋收集管，使培养基覆盖管壁。在将细胞上样至细胞分选仪之前，也需涡旋含有细胞的管。采集样品的流式细胞术数据。不含GFP的菌株可作为阴性对照。绘制分选门控以排除细胞聚集体，因为聚集体可能表现出较高的GFP强度。利用前向散射（FSC）的脉宽与脉高图，或FSC面积与FSC高度图，排除在前向散射中脉宽或面积异常过大的离群值。由于细胞聚集体的前向散射光（FSC）信号较强，因此仅选取FSC值较低的下层20%的细胞。应避开FSC和侧向散射光（SSC）信号最低的区域，这些区域通常含有细胞碎片。SSC与GFP信号通常呈正相关。为避免富集高SSC值的细胞，使用GFP强度与SSC的散点图，在细胞群边缘绘制门控区域，从而沿SSC轴整体选取相同比例的最亮细胞。在此步骤之前，使用FSC和SSC门控所选亚群的0.1%至1%应标记为分选目标，将200个细胞分选至收集管中。涡旋混匀收集管，使分选后的细胞完全浸入培养基中。用于基因分型的 A-Y-P-D-A 平板上的部分细胞。在培养后，将平板于 30 摄氏度下孵育两天。制备约 12 个菌落的裂解液。按照基因分型书面实验方案中所述步骤进行操作。使用10 µL的PCR反应体系，加入1 µL稀释后的裂解液和一条上游引物进行分析。该上游引物针对每个缺失基因的上游侧翼区域，与一条通用引物配对使用，该通用引物结合于所有缺失位点内的共同区域。PCR 可在 96 孔或 384 孔板中进行，扩增完成后，通过电泳分析 PCR 产物。筛选可能具有目标基因型的单倍体菌株。将这些菌株接种至新鲜培养基平板上进行培养。同时，用25%甘油在-80摄氏度条件下进行冷冻保存。建议进行其他检测，例如验证缺失基因的野生型序列不存在，以及进行脉冲场凝胶电泳。使用有价值的菌株重复有性循环。由两个菌株杂交产生的单倍体后代被诱导表达绿色荧光蛋白（GFP）。利用流式细胞仪设置门控，针对每个基因敲除的GFP标记筛选出相应的细胞群体，该群体中不太可能含有碎片或细胞聚集体。根据前向散射面积和前向散射高度对细胞进行门控，分选出并保留最亮的1%细胞。细胞聚集体通常具有异常大的前向散射面积，因此在根据前向散射和侧向散射进行设门时，排除了前向散射信号最低的20%的细胞，同时通过基于侧向散射和GFP信号的设门排除了具有最低前向散射和侧向散射的碎片。在特定侧向散射范围内，选择其中荧光更强的细胞，以便对表达GFP的实验组与不表达GFP的阴性对照样本进行比较。用于选择P3细胞群的设门策略同样适用于图中所示的阴性对照样本。对于在独立单倍体样本中以相同方式筛选出的细胞，在诱导其表达GFP并根据荧光进行分选后，通过PCR进行分析。未经分选的细胞由于随机分离所产生的预期缺失数目为7.5。在此特定实验中，分选后的细胞平均缺失数为 8.8 ± 0.3，其中包括 5 个含有 10 个缺失的细胞。DO 基因型。使用反向引物对分选菌株的 PCL 进行检测。该10与下游侧翼区配对的正向引物结合，该10延伸至表达盒的末端。条带的存在表明GFP表达盒的存在。观看本视频后，您应该能够充分掌握如何使用绿色 Monster Method 在酵母中构建缺失突变。

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