肠道运动功能及肠壁炎症在啮齿类动物中的功能评估：标准化肠道操作模型中的分析

以下实验的总体目标是通过肠道操作，在啮齿类动物模型中研究术后肠梗阻的发生与消退过程。该操作通过使用两个湿润的棉签对小肠进行标准化机械刺激来实现。随后，通过分析胃肠道及结肠传输功能，评估术后的肠道蠕动情况。最后，对小肠肌层、外肌层或肠壁进行组织化学分析及器官培养，以检测炎症水平。

结果显示，中性粒细胞大量浸润至肠壁黏膜层（me），且 me 培养物中一氧化氮（nitric oxide）过度生成，导致胃肠道和结肠传输时间延长。该方法有助于解答有关术后麻痹性肠梗阻（postoperative ilios）的发生机制及解决方案的关键问题，并可用于探索潜在的预防或治疗方法。本实验操作将由本实验室技术员 Mario Lewison 演示。对雄性小鼠通过氧气吸入 0.8% 至 1% 异氟烷（isoflurane）进行麻醉后，将动物置于仰卧位，并使用胶带固定其四肢。

使用轻微疼痛刺激来检测深度镇静状态。然后进行长度为两厘米的正中剖腹切口。接着插入两个无菌牵开器以保持腹腔开放，并小心地将小肠向左翻出，放置于湿润的棉纱布上。

使用两根湿润的棉签，通过同时从近端向盲肠方向滚动棉签，清除整个小肠肠腔内的内容物。将肠管放回腹腔时避免扭转，以防缺血或机械性梗阻，并使用两层连续的5.0聚酰胺不可吸收缝线缝合。关闭腹部切口。

将动物置于加热灯下，并监测其状态直至从麻醉中恢复。然后将小鼠放回笼中，给予食物和水。第二天。

在完全麻醉小鼠后，小心地将其头部向后过度伸展，并用钝头镊子拉出舌头，用至少100微升荧光素标记的葡聚糖填充1毫升注射器。将其连接至动脉导管，并小心地将导管作为胃管插入胃中。迅速注射100微升FITC葡聚糖，然后移除导管。

让动物恢复意识并等待90分钟。90分钟后，处死小鼠，并完整取出从胃到直肠的整个胃肠道。将肠段置于聚苯乙烯板上，避免拉伸。

接下来，测量小肠和结肠的全长。使用套管将肠管固定在聚苯乙烯板上。将小肠分为10个等长的节段，结肠分为3个等长的节段。

在标记位置横切肠道后，用一毫升克雷布斯-赫利碳酸氢盐缓冲液（KHB）冲洗各肠段一次。将肠段转移至依次标记的二毫升离心管中，剧烈涡旋并离心样品，然后将上清液转移至洁净、编号的 1.5 毫升离心管中。

将样品避光保存于 4°C，直至分析。接下来用移液器将每份上清液各 100 µL 重复取样至黑色 96 孔板中，使用荧光读板仪读取数据，以检测每周麻醉动物后的结肠转运时间。

通过插入造瘘管仔细检查结肠通畅性。使用探针经肛门插入结肠，将一颗直径两毫米的玻璃珠送入结肠内三厘米深处，然后撤出探针。

立即启动计时器。将小鼠放入透明笼中，并监测其直至粪球排出所需的时间。用于中段粪便样本的组织化学分析。

从肠道切取组织片段后，将其浸入盛有冷KHB的硅胶培养皿中，用昆虫针将肠系膜固定在培养皿上。沿肠系膜缘将组织片段剪开，并将组织拉伸至其原始长度和宽度的120%。从肠系膜开始，用针固定组织。机械地。

分离外肌层（me）与黏膜层。根据本方案的书面部分对样品进行固定和染色，以进行培养。外肌层（me）。

肠操作术后24小时，切除整个小肠并置于含青霉素、G和链霉素的冷KHB溶液中。用精细剪刀将肠道切成3厘米长的片段，并将其固定在硅胶涂层玻璃皿上。去除肠系膜，并用尖头镊子将肠道移至点头针上。

用湿润的棉签轻轻切开黏膜，并将其从黏膜下层剥离，放入冰冷的含Ps的KHB溶液中。接着，将黏膜条切成2至4毫米长的小段，在冰冻的含PS的KHB溶液中孵育30分钟，并多次冲洗标本。

然后将约50至60毫克的组织转移至含有500 µL DMEM的无菌24孔板中。在37°C和5% CO₂条件下孵育组织24小时。收集上清液，并在1000 ×g下离心5分钟。

然后迅速将组织在液氮中冷冻，用于细胞因子或一氧化氮的检测。最后，使用干净的纸巾轻轻吸干肌肉组织30秒，随后称重。评估术后肠梗阻严重程度最重要的参数是在体内检测胃肠道转运或胃肠道通过功能（GIT）。

该图展示了手术后24小时，未经处理的对照组和肠道操作小鼠胃肠道中FITC葡聚糖的典型分布情况。如图所示，假手术小鼠的胃肠道（GIT）功能正常，其计算出的几何中心位于盲肠。而肠道操作（Im）导致近端空肠的胃肠道传输显著延迟；在利用玻璃珠进行的结肠蠕动分析中，假手术小鼠在48至200秒内排出玻璃珠，而肠道操作组将排出时间延长至470至775秒，以此评估炎症程度。

在ME中，白细胞水平通过组织化学或免疫组织化学进行分析，如图所示。在对照组小鼠中仅观察到少量多形核中性粒细胞，然而，小肠的炎症导致这些细胞显著浸润。许多由细胞释放的炎症介质在组织中难以检测。

裂解物器官培养可用于检测培养物中的炎症标志物。上清液中，代表性的POI介质是一氧化氮（nitric oxide，NO），它是胃肠道中的主要抑制性神经递质。该图显示，在ME中无法检测到NO。

在对照组、假手术小鼠的器官培养及上清液中，观察到基础水平的nno。然而，经过肠道操作的小鼠其肠组织培养在24小时孵育后产生的nno显著增多。一旦掌握该技术，正确的操作可在15分钟内完成。

观看本视频后，您应能充分了解如何在小鼠中诱导术后肠梗阻，以及如何评估其严重程度。