Name: 高通量的亲和标签的重组蛋白的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学习利用液体处理机器人技术高通量纯化His标签重组蛋白的方法。该技术通过自动化流程提高实验可重复性，减少人为误差，适用于大肠杆菌表达系统的蛋白质纯化与功能分析。

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本工作获得了惠康基金会项目资助（078043/Z/05/Z）的支持，授予 R.O.J.W.。

A 部分：细菌培养物的高通量培养。
1. 使用24孔板，在2 ml自动诱导培养基中过夜培养细菌
<ol>
 <li>通过微波炉对24孔板进行灭菌。</li>
 <li>在1.5 ml自诱导培养基（Overnight Express Medium）中接种新鲜培养的细菌菌落或冻存的甘油菌种。我们通常每个突变体接种三个独立的克隆菌落，共三孔。预留六孔用于阳性对照和阴性对照。阳性对照中培养三个野生型克隆，阴性对照中培养两个转化了非表达质粒的克隆。通过留出一孔仅加培养基作为空白对照，以检测培养板灭菌是否充分。</li>
 <li>在37 °C、250 rpm振荡条件下培养细胞18小时。我们使用lac诱导型BL21 (DE3) Rosetta 2细胞。自诱导培养基含有葡萄糖和乳糖的混合物。细菌首先利用葡萄糖生长，随后开始利用乳糖，后者同时诱导重组蛋白的表达。</li>
 <li>取下盖子，将培养板放置于机器人平台上。</li>
</ol>
第二部分：重组蛋白的机器人纯化。
2. 准备机器人平台
<ol>
 <li>
配制洗涤缓冲液，包含 20 mM 咪唑、0.1% Triton X-100、0.5 M NaCl、20 mM Tris-乙酸盐（pH 7.9）、10 mM MgOAc2、0.7 mM ZnOAc2、10% 甘油；以及洗脱缓冲液，包含 0.5 M 咪唑、0.1% Triton X-100、0.5 M NaCl、20 mM Tris-乙酸盐（pH 7.9）、10 mM MgOAc2、0.7 mM ZnOAc2、10% 甘油。这些缓冲液将分别用于在目的蛋白结合磁珠后洗涤磁珠，或从磁珠上洗脱蛋白。</li>
 <li>
配制细菌稀释液（100 ml 蒸馏水中加入 15 μl 消泡剂）。该溶液用于对细菌过夜培养物进行稀释，以进行光密度（A600）测定。稀释液中的消泡剂可防止产生气泡，避免干扰酶标仪的测量结果。</li>
 <li>
配制裂解液，包含 10x FastBreak 裂解试剂、每样品 2 μl Lysonase 及 15 mM MgOAc2。FastBreak 含有可破坏细菌细胞壁并促进胞内蛋白释放的去垢剂与盐类混合物。Lysonase 是一种专有的溶菌酶与核酸酶混合物。溶菌酶有助于破坏细胞壁，而核酸酶可降解释放出的细菌核酸。</li>
 <li>
可选：配制 6 M 盐酸胍溶液。某些重组蛋白容易黏附在特氟龙涂层的移液针上。盐酸胍溶液可使蛋白变性，从而比常规用于清洗机器人移液针头的水更有效地去除残留蛋白。</li>
 <li>
通过混合双辛可宁酸溶液（试剂 A）与硫酸铜溶液（试剂 B）配制 BCA（双辛可宁酸）蛋白定量试剂：肽键将BCA试剂中的CuSO4组分所含的Cu2+还原为Cu1+，生成的Cu1+量与溶液中肽键的数量成正比。在第二步反应中，两个双辛可宁酸分子螯合一个Cu1+，导致吸光度转移至562 nm，产生紫色。该显色反应具有时间依赖性，通常需要数小时才能完全显色，之后颜色可在数小时内保持稳定。</li>
 <li>
将适当尺寸的储液槽或板放入机器人平台预设的位置。</li>
 <li>
在平台指定位置放置一个24孔板用于盛放盐酸胍废液，两个透明96孔板用于OD600和吸光度测定，一个蓝色96孔板用于存放纯化后的蛋白。将一个96深孔板置于磁力架上。</li>
 <li>
将可与蛋白His标签形成螯合物的MagneHis Ni-磁珠用蒸馏水稀释5倍后，加入磁珠搅拌装置中。开启搅拌器以保持磁珠处于悬浮状态。</li>
 <li>
开启机器人平台，并对移液针进行数分钟的冲洗，以去除可能影响移液准确性的气泡。在每次移液操作之间均需对可重复使用的移液针进行冲洗。也可选择使用一次性移液头。所有后续步骤均由机器人自动完成。机器人操作程序可根据要求提供。</li>
</ol>
3. 通过测量OD600检测细胞生长
<ol>
 <li>将10 μl过夜培养物用90 μl稀释液进行稀释。</li>
 <li>测定OD600，以确保细菌已生长至相近的密度（图1）。</li>
</ol>
4. 裂解细胞以释放蛋白质并允许磁珠结合
<ol>
 <li>将100 μl磁性Ni-珠悬浮液分配至另一个24孔板的每个孔中。</li>
 <li>将每种小规模细菌培养物900 μl转移至含有珠子的24孔板中。加入100 μl的10倍FastBreak/lysonase混合液。</li>
 <li>将24孔板转移至摇床上，室温下快速振荡（800 rpm）30分钟。细菌细胞壁通过机械力与化学作用共同被破坏，重组表达的蛋白质释放到溶液中。这些蛋白质凭借其亲和标签立即结合到顺磁性镍螯合珠上。</li>
</ol>
5. 磁珠的洗涤
<ol>
 <li>将含有重悬磁珠的细胞裂解液转移至置于带有磁棒支架上的96深孔板中，磁棒可在各孔之间滑动。96孔板具有方形锥形底部，便于去除上清液。各孔最大容纳体积为2.1 ml，但实际加入的液体体积要小得多，从而可在剧烈振荡时防止液体飞溅导致的样品交叉污染。</li>
 <li>在每次移液操作之间，用6 M盐酸胍清洗移液吸头。此步骤对于TFIIB及其他“黏性”蛋白的纯化至关重要，可避免交叉污染。而对于其他蛋白，移液步骤之间可能只需用大量水充分冲洗针头即可。</li>
 <li>磁力架的磁棒吸引顺磁性磁珠，使其移至孔的边缘，从而让移液针可自由接触上清液。随后弃去上清液。</li>
 <li>首先将500 μl洗涤缓冲液加入24孔板，再转移至96孔板，以确保磁珠完全转移。随后将24孔板从振荡器上取下。</li>
 <li>直接向96孔板中加入另外500 μl洗涤缓冲液，将该板转移至振荡器上，剧烈振荡1分钟。然后将板移回磁力架，并弃去洗涤缓冲液。</li>
 <li>此步骤重复两次，最后通过去除板中残留的缓冲液完成洗涤程序。</li>
</ol>
6. 用洗脱缓冲液洗脱蛋白质
<ol>
 <li>向珠子中加入 100 μl 洗脱缓冲液，将板放入摇床，在室温下剧烈振荡 30 分钟。</li>
 <li>将板重新放回摇床，收集含有纯化重组蛋白的洗脱液，并转移至新板中。</li>
</ol>
7. 测定纯化蛋白质的浓度
<ol>
 <li>将190 μl BCA试剂混合液转移至透明的96孔板中，再加入10 μl蛋白质溶液。</li>
 <li>孵育数小时（通常为5-6小时或过夜）后，测定吸光度，并与BSA标准品比较，以确定各纯化蛋白质样品的浓度(图2)。</li>
 <li>纯化后的蛋白质现在可在适当浓度下用于后续实验应用(图3)。</li>
</ol>
8. 典型结果
纯化方案包含两个质量控制阶段，文中展示了相应的示例。我们能够在细菌生长阶段（图1）识别并记录潜在问题，随后在评估纯化蛋白产量时进一步确认（图2）。我们通常对蛋白进行三份平行纯化并进行检测。结合上述两个质量控制步骤，可确保在功能实验中观察到的任何差异均源于突变体表型（图3），而非实验误差或纯化失败所致。通常获得的蛋白产量范围为50–200 μg，足以满足多种功能实验的需求。
<img alt="Substitution effect of mjTFIIB residues A81-C91; bar chart; OD600 measurement; eukaryotic sequences." src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 24孔板中过夜培养物OD测量值的直方图。 培养了六种TFIIB突变体变体以及野生型TFIIB的三个克隆。两个携带非表达质粒的克隆以及一个仅含培养基的孔作为阴性对照。OD测量结果显示，不同培养物之间的生长速率存在较小差异。
<img alt="蛋白质浓度；柱状图；SDS-PAGE凝胶；电泳；蛋白质分析；研究数据。" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过BCA法测定并经SDS-PAGE验证的各培养物中获得的蛋白质产量。其中一种变异体的表达水平较低。结合图 1，我们可以得出结论：这种现象并非由细胞生长差异所致，而是由于蛋白质表达未能被有效诱导。
<img alt="氨基酸替换对蛋白质活性的影响；下方为条形图和凝胶电泳结果。" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 转录实验的代表性结果。我们测定了TFIIB变体对RNA聚合酶（RNAP）产生短截转录产物的刺激活性。此处展示了TFIIB第87位赖氨酸（K87）所有单氨基酸替换突变体的刺激效应。较小的误差范围表明实验具有高度可重复性。下方显示了一块凝胶图像，比较了三种突变体与野生型（wt）、阴性对照（NC）以及仅洗脱缓冲液对照的实验结果。

<ol><li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+polymerase+factory%3A+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li>
<li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40(2008).</li>
<li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li>
<li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+Function+of+TFIIB%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li>
<li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li>
<li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li>
<li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li>
<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li>
<li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li>
<li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述的自动化重组蛋白纯化方法可在高度可重复的条件下，以小规模形式大量生产并纯化多种突变蛋白，且所需人工干预极少。图1和图2展示了系统性质量控制的结果以及纯化蛋白的示例。图3显示，在本示例中使用的纯化转录因子在功能检测中表现出高度可重复的性能。
尽管该实验流程最初是为古菌TFIIB的纯化而开发，但它广泛适用于带有亲和标签的蛋白质纯化。采用此类自动化纯化方案将显著促进对重组蛋白的生物化学分析，从而在难以通过人工操作实现的规模上加深我们对蛋白质-蛋白质相互作用的理解。

<table><tbody><tr><td>过夜速效即时TB培养基</td><td>Merck Chemicals Ltd</td><td>71491-4</td><td></td></tr><tr><td>FastBreak</td><td>Promega Ltd.</td><td>V8573</td><td></td></tr><tr><td>Lysonase生物加工试剂/1 ml</td><td>Merck Chemicals Ltd</td><td>71230</td><td></td></tr><tr><td>消泡剂204</td><td>Sigma-Aldrich Company Ltd</td><td>A6426</td><td></td></tr><tr><td>MagneHis Ni-颗粒</td><td>Promega</td><td>V8565</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich Company Ltd</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Trizma碱</td><td>Sigma-Aldrich Company Ltd.</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>双辛可宁酸蛋白测定试剂</td><td>Sigma-Aldrich Company Ltd</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>深孔板 2.2 ml 方孔 聚丙烯 包装10个</td><td>Anachem Ltd</td><td>1810-00</td><td></td></tr><tr><td>微孔板 MicroWell 96孔 平底 聚苯乙烯 未经处理 每包5板 共12包 透明 每孔体积0.4 ml 尺寸128 mm × 86 mm Thermo Scientific Nunc</td><td>Fisher Scientific Ltd.</td><td>DIS-984-090M</td><td></td></tr><tr><td>蓝色微孔板</td><td>VWR</td><td>NUNC367001</td><td></td></tr><tr><td>24孔块 RB (24)</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>VWR</td><td>ALFAA13543.0B</td><td></td></tr><tr><td>TheOnyx可清洗针头</td><td>Aviso GmbH</td><td>8152-317001</td><td></td></tr><tr><td>磁珠用试剂架</td><td>Aviso GmbH</td><td>8152-035003</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪 Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>4200-000043</td><td></td></tr><tr><td>机器人平台 TheOnyx 44OH/150/100</td><td>Aviso GmbH</td><td>8145-050046</td><td></td></tr><tr><td>微孔板振荡器 Variomag Teleshaker</td><td>Inheco</td><td>3800047</td><td></td></tr><tr><td>96孔磁铁 类型A</td><td>Qiagen</td><td>36915</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量纯化亲和标签重组蛋白

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X射线晶体学是获取蛋白质结构详细信息的首选方法。此类研究需要结合进一步的生物化学分析，以深入理解结构与功能之间的关系。随着寡核苷酸和基因合成技术的进步，大规模的定点突变策略变得越来越可行，包括将目标残基逐一替换为其余19种氨基酸。通过观察功能获得或功能丧失的表型，可系统性地得出结论，例如特定残基对催化活性、蛋白质稳定性或蛋白质-蛋白质相互作用特异性所起的作用。
为了将不同的表型归因于突变的性质，而非实验条件的波动，以可控且可重复的方式纯化和分析蛋白质至关重要。高通量策略以及在机器人液体处理平台上对人工操作流程的自动化，使得在极少人为干预和极低错误率的情况下开展此类复杂的分子生物学实验成为可能1-5。
本文介绍了一种高通量纯化带组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白的通用方法。在最近的一项研究中，我们将该方法应用于基础转录机制组分TFIIB的结构与功能的详细分析。TFIIB对于体外启动子导向的转录至关重要，并且在将RNA聚合酶招募至转录起始前复合物的过程中发挥必需作用in vitro6-8。TFIIB含有一个可伸展的连接域，该结构域能够深入RNA聚合酶的活性位点裂隙9-11。该连接域赋予TFIIB两种可被生物化学定量检测的功能活性：（i）在转录起始的“流产性”阶段刺激RNA聚合酶的催化活性；（ii）进一步促进RNA聚合酶特异性地招募至转录起始前复合物4,5,12。我们利用该高通量纯化方法，在TFIIB连接域内构建了单点、双点及三点取代突变和缺失突变，并在功能实验中系统分析了这些突变体对RNA聚合酶催化活性的刺激作用4。总计，我们构建、纯化并分析了381个突变体——若采用手动操作，这项工作将极为耗时且劳动强度巨大。我们对蛋白质进行了多次重复制备与检测，从而能够评估实验中的变异情况，并清晰了解结果的可重复性。
该方法是一种用于纯化His标签蛋白的通用方案，已成功用于纯化其他重组蛋白。目前该方法已优化用于24种蛋白的纯化，但也可调整适用于多达96种蛋白的纯化。

我们介绍一种利用液体处理机器人进行亲和标签纯化重组蛋白的方法。该方法通常适用于高通量模式下小规模纯化可溶性His标签蛋白。

X射线晶体学是获取蛋白质结构详细信息的首选方法。此类研究需要通过进一步……

本实验的目的是利用机器人平台上的自动化流程，以高通量方式纯化带有组氨酸标签的重组蛋白。首先在大肠杆菌中通过小体积培养过量表达目标蛋白，随后通过化学方法裂解细胞，释放出的蛋白将结合到磁性镍珠上。然后洗涤磁珠以去除污染性蛋白质，从而提高目标蛋白质的纯度。最后，将目标蛋白质从磁珠上洗脱并进行纯化。最终可通过BCA检测、SDS-PAGE以及额外的功能性检测来分析蛋白质的浓度、纯度及活性，获得相应的实验结果。该技术的主要优势在于，我们现在可以在相同条件下纯化大量蛋白质，且人为干预最少。这使得实验具有高度的可重复性，同时最大限度地减少了人为误差。该方法特别适用于研究某种蛋白质的大量点突变体，因为它能确保蛋白质活性的差异确实源于突变本身，而非样品制备过程中的差异。为制备过夜细菌培养物，首先在24孔板中加入水，微波加热两分钟以进行灭菌。随后弃去水，并再次将孔板用微波加热两分钟。使用新培养的乳糖可诱导型BL21 Rosetta2细菌菌落或冻存的甘油菌种，接种于1.5毫升含有葡萄糖和乳糖混合物的自动诱导培养基中。每组设置三个阳性对照孔和三个阴性对照孔，另设一个仅含培养基的对照孔。在37摄氏度、250 RPM条件下培养细胞18小时。取下盖子，将培养板放置于机器人平台上。该平台包含一个用于将物体从一个位置移动到另一个位置的夹持臂、一个移液臂，以及用于培养板和槽的多个位置，包括一个摇动平台、磁珠搅拌器和磁力平台。对于96孔板，根据书面方案，使用100毫升蒸馏水和15微升消泡剂配制纯化步骤所需的洗涤缓冲液和稀释缓冲液。配制用于稀释过夜培养物以进行光密度测定的溶液。配制含有快速裂解试剂裂解酶和乙酸镁的裂解溶液，并准备BCA蛋白测定溶液。由于TF two B容易粘附在移液针上，需准备六摩尔的盐酸胍溶液用于清洗。将适当大小的槽或板装入相应的缓冲液，并放置在机器人平台预设的位置上。放置一个24孔板用于盐酸胍废液，两个透明的96孔板用于OD 600和吸光度测定，以及一个蓝色的96孔板用于盛装纯化的蛋白质。将1个96深孔板置于磁力架上。使用水稀释Magna Hair镍颗粒，并将其加入珠子起始单元。开启搅拌，以保持珠子处于悬浮状态。启动机器人平台，并对移液针冲洗数分钟。为去除气泡，将培养板置于摇床上，检查过夜培养的细胞生长情况。取10微升培养物加入90微升稀释液中进行稀释，每次加样之间需清洗移液器。当培养物达到相似密度时，测定其在 OD 600 处的密度。将 100 微升磁性镍珠悬浮液加入 24 孔板的各孔中，再将每种培养物各 900 微升转移至孔中，每步之间清洗移液器。然后加入 100 微升快速裂解酶混合液。将培养板置于摇床上，以800 RPM的转速在室温下振荡30分钟，使细胞裂解，并使带组氨酸标签的蛋白质结合到磁珠上以洗涤磁珠。将样品转移至含有磁棒的支架上的96孔板中，磁棒将磁珠吸附至各孔边缘，弃去上清液，并使用六摩盐酸iGuide洗涤移液枪头。随后，向24孔板的各孔中加入500微升洗涤缓冲液。将样品转移至96孔板。然后移除上清液。向96孔板中加入500 µL洗涤缓冲液。孔板。将板转移至摇床，剧烈振荡一分钟。然后将板移回磁力架，吸除洗涤缓冲液。最后一次洗涤后，向珠子中加入 100 微升洗脱缓冲液，在室温下剧烈振荡 30 分钟。然后将洗脱液转移至新的板中。为定量蛋白质样品，向透明 96 孔板的各孔中加入 190 微升 BCA 试剂，并向各孔中加入 10 微升蛋白质样品。将样品孵育至少五小时，并使用一组 BSA 标准品测定吸光度。随后将蛋白质在 -80 摄氏度下保存。纯化方案包含两个质量控制步骤。首先在细菌生长阶段，随后在评估蛋白质产量时。通过三份平行样纯化蛋白质，可以确定功能测定中的任何差异均源于突变体表型，而非实验误差或纯化失败所致。产量通常在50至200微克之间，足以满足功能测定的需求。一旦熟练掌握该技术，整个过程仅需约三小时，除了搭建实验平台、接种培养物以及收集纯化后的蛋白质外，无需进行其他操作。完成此步骤后，可进行功能检测。在本例中，将进行一系列转录实验，以研究转录因子Two B的突变如何影响ar聚合酶催化活性。

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高通量的亲和标签的重组蛋白的纯化

已开发出一种新颖且高效的两步亲和层析方案，并在此详细描述。该方法基于一种具有两种内在亲和性的微小纯化标签，适用于多种具有不同性质的目标蛋白。...

通过小型双特异性亲和标签实现的正交蛋白质纯化

来源：Becker, B., et al．一种基于荧光报告基因的简易检测方法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素A链（RTA）转运所需的细胞组分．J. Vis. Exp.

一种用于纯化重组细菌蛋白的亲和层析技术

在本视频中，我们演示了利用镍亲和层析技术从艰难梭菌（Clostridium...

基于镍亲和层析的蛋白质纯化：一种从细菌细胞裂解液中纯化聚组氨酸标签重组蛋白的技术

本视频展示了串联亲和纯化技术——一种用于从真核细胞中纯化蛋白质复合物以研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该复合物包含两种带有不同表位标签的蛋白质。通过依次使用两种对不同标签具有亲和力的树脂纯化该复合物后，若在洗脱液中同时检测到这两种蛋白质，则可证实二者之间存在相互作用。...

串联亲和纯化实验用于研究蛋白质-蛋白质相互作用

蛋白质复合物催化细胞内的关键功能。对许多重要复合物进行详细的功能和结构表征需要通过重组表达来实现。MultiBac 是一种杆状病毒/昆虫细胞表达系统，专为表达真核蛋白及其复合物而设计。MultiBac...

欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

在本实验方案中，我们展示了一种高效且经济的小规模蛋白质纯化方法，该方法通过独特地结合可切割的GST标签和小型His标签，实现对重组蛋白的纯化。...

GST-His纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

本文描述并应用了一种从小规模大肠杆菌（Escherichia...

高通量定量表达筛选与纯化技术应用于在大肠杆菌（E. coli）中表达的重组二硫键富集型毒液蛋白

本文介绍了一种从包涵体中复性空肠弯曲菌（Campylobacter...

高效复性和纯化趋化受体配体结合域的方法

多列柱适配器可将层析柱与多孔收集板连接，用于并行亲和或离子交换纯化，提供一种经济高效的高通量蛋白质纯化方法。该方法可在重力或真空条件下使用，通过价格适中的仪器即可获得毫克级蛋白质。...

一种使用多柱板适配器的经济且通用的高通量蛋白质纯化系统

对人源膜转运蛋白进行结构与生化研究需要获得毫克量级的稳定、完整且均一的蛋白质。本文介绍了利用密码子优化基因进行人源溶质载体转运蛋白的筛选、表达和纯化的可扩展方法。...

用于结构与生化研究的人类溶质载体的高通量表达与纯化

本文提供了一种人源重组蛋白 flap 内切酶 1（FEN1）的亲和纯化方法，该蛋白带有...

使用快速蛋白液相色谱系统亲和纯化6X-His标签蛋白

学习利用液体处理机器人技术高通量纯化His标签重组蛋白的方法。该技术通过自动化流程提高实验可重复性，减少人为误差，适用于大肠杆菌表达系统的蛋白质纯化与功能分析。

高通量纯化亲和标签重组蛋白

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