小鼠离体心肌线粒体通透性转换孔开放中的多参数测量。
2012年9月7日
这里介绍一个荧光光谱的测量小鼠离体心脏线粒体中的线粒体通透性转换孔开放的协议。该法涉及同时测定线粒体钙 2 +
本视频的目的是描述表征线粒体通透性转变的程序。线粒体开口不良，与小鼠心脏分离。首先，线粒体是从小鼠心脏中分离出来的。
使用差速离心法，然后使用连接到计算机的氧热氧电极评估分离的线粒体的质量，以测量呼吸控制比率并评估线粒体膜的完整性。然后使用光谱荧光测量仪器，同时测量钙处理、线粒体膜电位和线粒体体积来确定通透性转换。开场差。
所得数据显示钙保留能力和线粒体通透性转变的差异。离体线粒体的敏感性差，线粒体通透性转变的开放。孔隙是一种复杂的现象，涉及线粒体生理学和解剖学的多个层次的变化。
与现有方法相比，该技术的主要优点是，与单独测量单个参数（例如钙、动员或肿胀）相比，同时测量多个参数可以更全面地了解现象。在开始程序之前，解冻线粒体分离缓冲液并检查 pH 值，应为 7.4。然后将所有将在冰上使用的缓冲液、培养皿和试管放入冰上。请注意，线粒体分离方案的所有步骤都必须在 ice 上进行。
将安乐死小鼠的心脏放在培养皿上，用冷线粒体冲洗掉任何血液。隔离缓冲液。接下来，使用刀片将心转移到新的培养皿中，去除脂肪和心房，然后将心切碎，直到获得均匀的产品。
将切碎的心形转移到 50 毫升锥形管中。加入 10 mL 线粒体分离缓冲液，每毫升 tripsin 含 0.1 mg，让样品在冰上消化 10 分钟。请注意，胰蛋白酶的使用会增加分离的线粒体的产量，并且应在线粒体制备之间保持恒定。
但是，我们建议在不含胰蛋白酶的情况下获得的制剂上测试分离的线粒体的功能，以确保酶不会干扰其离子。孵育后，加入 10 毫升含有 0.1% 不含脂肪酸、BS、a 和 5 毫克胰蛋白酶抑制剂的线粒体分离缓冲液，并通过倒置试管数次混合 为了中和胰蛋白酶，以中低速回收消化的组织。离心 4 摄氏度 1 分钟。
离心 Resus 后，将组织悬浮在 8 毫升含 0.1% 不含脂肪酸的 BSA 的线粒体分离缓冲液中，将样品保持在冰上。使用带有特氟龙杵的电动舞蹈匀浆器，以 1， 200 至 1， 400 RPM 的速度通过四到六次传次对样品进行均质化。将匀浆转移到 15 毫升锥形管中，在 4 摄氏度下以 800 倍 G 离心 10 分钟。
沉淀细胞核和组织碎片。旋转后，将含有线粒体的螺旋体回收到微量离心管中，并以 8， 000 倍 G 的速度在 4 摄氏度下离心 15 分钟。旋转后，颗粒顶部会有一层白色。
使用真空系统小心吸出并去除线粒体沉淀顶部的白色层。然后重新悬浮剩余的深色沉淀，其中含有一毫升线粒体中的线粒体。隔离缓冲液。
接下来将线粒体以 8， 000 倍 G 离心 4 摄氏度 10 分钟。丢弃脊髓突起并重悬线粒体沉淀。在 150 微升线粒体分离缓冲液中，将线粒体保持在冰上。
分离的线粒体的呼吸是通过连接到计算机并由氧控制的氧热氧电极测量的。plus 软件，氧电极应在实验当天校准。向氧室中加入两毫升含有终浓度为 1 微摩尔鱼藤酮的线粒体呼吸缓冲液，密封腔室并开始记录氧信号。
系统记录并显示在计算机屏幕上的信号与氧气热室中的氧气浓度成正比。氧信号稳定后，加入 250 μg 线粒体并记录 1 分钟的基础呼吸。此时的呼吸应该非常低，因为线粒体正在内源性底物上生长。
这是 State 1 呼吸。添加琥珀酸盐至终浓度为 5 毫摩尔，以在复合物 2 处启动线粒体呼吸，并记录信号 1 分钟。在第二状态呼吸期间，耗氧量应增加。
为了诱导状态呼吸，添加 DP 至终浓度为 150 微摩尔。此时，由于通过氧化磷酸化合成 TP，耗氧量应增加。记录信号，直到呼吸减慢，表明 DP 消耗并过渡到状态 4 呼吸记录。
状态 4，呼吸至少 1 分钟。加入 CCCP 至终浓度为 1 微摩尔，并记录信号 1 分钟。此时，解耦呼吸应该是最大的。
通过除以状态 3 期间的耗氧率来计算呼吸控制率。呼吸时按状态 4 期间的耗氧率计算，呼吸目标 RCR 应大于 4。接下来，为了评估线粒体膜的完整性，通过将 DP 添加至终浓度为 1 毫摩尔，在线粒体的新样品中诱导状态 3 呼吸。
然后记录耗氧量 1 分钟，加入 10 微摩尔细胞色素 C，并记录耗氧量 2 至 3 分钟。由于细胞色素 C 在良好的线粒体制备中无法渗透完整的线粒体膜，因此呼吸不会增加或非常小的增加。呼吸增加表明线粒体膜破裂或受损。
用于线粒体通透性转换端口开口多参数测量的仪器由由 Felix GX 程序控制的量子主双发射光谱荧光计计算机组成。使用 Felix GX 程序，创建多 di 采集方案并输入用于测量比率公制染料的钙线粒体膜电位和溶胀的参数，Forer 和 JC one 在一次性四面甲基 ACRL vete 混合物中生成比率和 JC one 比率的衍生轨迹，最终浓度为 1 微摩尔鱼藤酮， 5 毫摩尔琥珀酸盐和 800 纳摩尔。对于 FF，加入 250 微克线粒体，并将样品放入光谱荧光计的样品室中。
一分钟后开始记录荧光信号，暂停采集，添加 500 纳摩尔 JC 一，然后重新开始采集。JC 单比信号应增加，表明活性线粒体的死亡摄取。继续录制，直到 JC 1 信号达到平台期。
通常在 5 分钟内，加入氯化钙至终浓度为 20 微摩尔。应看到 Fluor FF 比率信号的瞬时增加，表示测定缓冲液中钙的存在增加，然后由于线粒体钙摄取而逐渐降低。JC 单比信号应表现出短暂的瞬时降低，表明轻微的线粒体膜去极化。
当 ER FF 比值信号恢复到基础水平时，通常在 1 到 1.5 分钟内，在另外 20 微摩尔的氯化钙下，继续以固定的时间间隔脉冲，直到线粒体无法积累钙并开始将钙释放到检测缓冲液中。线粒体通透性转换端口的打开是通过钙释放引起的 URA FF 比率信号同时增加来可视化的。从 C 56 black six J 小鼠中分离时，由于膜电位塌陷导致 JC 单信号比降低，线粒体由于线粒体肿胀导致光散射减少。
如本视频所示，然后在琥珀酸和 DP 存在的情况下测量状态 3 呼吸期间的耗氧量，在 DP 消耗后的状态 4 呼吸期间测量耗氧量，如图所示，DP 添加由于氧化磷酸化而增加耗氧量，耗氧量减慢。一旦消耗了所有 DP，通过在 CCCP 存在下添加 CCCP 来测量分离的线粒体对解偶联的反应。耗氧率高于第三状态呼吸期间，以评估分离线粒体的膜完整性。
在琥珀酸盐和 DP 存在下测量耗氧量，在添加细胞色素 C.As 后，此处看到，添加细胞色素 C 不会显着增加相对于 DP 和琥珀酸盐的耗氧量，表明完整的线粒体膜不能渗透细胞色素 C 以评估线粒体通透性转换，孤立心脏线粒体的开放不良作为线粒体钙保留能力的指标。线粒体通透性转变。开孔不良是由连续添加 20 微磨牙引发的。
氯化钙、线粒体外钙和膜电位用比率度量指标测量。URA FF 显示为绿色迹线，JC 显示为红色迹线，线粒体的肿胀是通过记录黑色迹线所示的 525 纳米处的光散射来测量的。用 1 微摩尔、CCCP 和每毫升 5 微克微生物毒素乙蛋白测试了 JC one 的特异性和肿胀信号，如图所示，线粒体对钙的摄取伴随着线粒体膜的轻微去极化。
在四次钙脉冲后，线粒体通透性过渡池打开被视为 URA FF 的增加，表明钙的释放。JC 1 的减少表明膜电位塌陷和线粒体基质体积的增加，这被视为光散射的减少，作为肿胀的标志物，以验证线粒体通透性转换端口打开的特异性。在环孢菌素 A 存在下进行相同的测量，环孢菌素 A 与线粒体通透性转换 PO 成分环填充蛋白结合 D.As 如图所示，一个微摩尔循环器钻孔 A 的存在增加了打开线粒体通透性转换 PO 所需的氯化钙脉冲数与对照样品。
看完这个视频，你应该对如何评估离体心脏线粒体线粒体通透性转换端口的开放有一个很好的了解。该程序最困难的方面是获得高质量的分离线粒体。因此，在使用线粒体进行进一步实验之前进行质量控制测量非常重要。
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概述
本文介绍了一种用于测量分离的小鼠心脏线粒体通透性转变孔开放的荧光光谱法。该分析方法允许同时测量线粒体Ca2+处理、线粒体膜电位和线粒体体积。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 线粒体生理学
背景
- 线粒体通透性转变对细胞存活至关重要。
- 了解线粒体功能可以提供对各种疾病的洞察。
- 从小鼠心脏中分离的线粒体作为研究这些过程的模型。
- 评估线粒体完整性对于准确的实验结果至关重要。
研究目的
- 描述分离的小鼠心脏线粒体中的线粒体通透性转变。
- 开发测量线粒体功能的可靠协议。
- 评估钙处理对线粒体健康的影响。
使用的方法
- 使用差速离心法分离线粒体。
- 使用氧热氧电极评估线粒体质量。
- 测量呼吸控制比以评估膜完整性。
- 同时进行荧光光谱测量以测定钙处理、膜电位和体积。
主要结果
- 成功从小鼠心脏中分离出功能性线粒体。
- 建立了评估线粒体通透性转变的可靠方法。
- 展示了钙处理与线粒体功能之间的关系。
- 对线粒体健康和疾病的机制有了新的见解。
结论
- 开发的协议对于研究线粒体通透性转变有效。
- 了解这些机制可以帮助开发治疗策略。
- 这种方法可以应用于线粒体生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) opening provides mechanistic insight into mitochondrial dysfunction linked to neurodegenerative, metabolic, and cardiovascular diseases. Simultaneous multi-parameter measurement of calcium handling, membrane potential, and volume enables predictive de-risking of target engagement in early discovery by clarifying pathophysiological pathways. This assay supports target validation and assay development by delivering quantitative, reproducible readouts that inform go/no-go decisions in preclinical portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking calcium-induced mtPTP opening to mitochondrial depolarization and swelling, clarifying mechanisms of cell death pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through dose-response analysis of modulators like cyclosporine A, which shifts calcium retention capacity thresholds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated mitochondrial systems for compound screening by confirming integrity via respiratory control ratio and cytochrome C impermeability.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs—Ca2+ flux (Fura FF ratio), membrane potential (JC-1 ratio), and volume (light scattering)—enabling reproducible assay performance across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking mtPTP dysregulation to bioenergetic failure and redox signaling in cardiac and neuronal contexts.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from isolated mitochondria to tissue-level functional assessments through conserved permeability transition mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanistic de-risking data after target identification and before lead optimization, particularly for compounds modulating mitochondrial homeostasis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving whether test compounds inhibit or exacerbate calcium-induced mtPTP opening through concurrent parameter tracking.
- Screening: Enables assay readiness by requiring isolated mitochondria with RCR >4 and intact membranes, ensuring reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates ratiometric and light-scattering readouts that allow direct comparison of mitochondrial states under varying calcium loads and pharmacological interventions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling permeability transition mechanisms relevant to ischemia-reperfusion injury and excitotoxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing mitochondrial liability across therapeutic areas, reducing redundant isolation and qualification efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target modulation through multiparametric confirmation of mtPTP inhibition or induction.
- Operational Value: Standardization via isolated mitochondria preparation, dye calibration, and sequential calcium pulse protocol.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by identifying mitochondrial liabilities early, reducing late-stage attrition due to off-target organelle toxicity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their effect on calcium retention capacity and pore sensitization thresholds.
Implementation Considerations
- Expertise in mitochondrial isolation, spectrophotometry, and ratiometric dye handling.
- Spectrofluorimeter with dual-emission capacity and temperature control for simultaneous Ca2+, JC-1, and light scattering measurements.
- Standardization of mitochondrial isolation buffer, trypsin use, and calcium pulse timing across laboratories.
- Adaptation considerations for non-cardiac mitochondria due to tissue-specific differences in pore component expression.
- Practical limitation: assay sensitivity depends on mitochondrial coupling integrity, requiring rigorous QC via respiratory control and membrane impermeability tests.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:31
Isolation of Mitochondria from Mouse Heart
4:40
Quality Control: Measurement of Respiratory Control Ratio (RCR)
6:51
Quality Control: Assessment of Mitochondrial Membrane Integrity (Cytochrome c Test)
7:34
Measurement of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Opening
10:03
Representative Assay Results
13:08
Conclusion
![用超极化[1-13C]丙酮酸和 13C / 31P NMR波谱研究分离灌注小鼠心脏中的心脏代谢](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A46%253A50.867Z&w=384&q=75)
