Name: 小鼠离体心肌线粒体通透性转换孔开放中的多参数测量。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 学习使用光谱荧光法同时测量小鼠离体心肌线粒体的钙离子处理、膜电位和体积变化，以评估线粒体通透性转换孔开放。该方法为研究线粒体功能与疾病机制提供了可靠的技术手段。

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本工作由 HL094536（B.J.H.）资助。

1. 小鼠心脏线粒体的分离
<ol>
 <li>为分离心脏线粒体，根据当地机构动物护理与使用委员会批准的程序，对小鼠进行麻醉并实施安乐死。</li>
</ol>
注意：线粒体分离方案的所有步骤都必须在冰上进行。使用预冷的缓冲液以及预冷的培养皿、Falcon 管和 Eppendorf 管。本方案中提供的体积适用于含有 2 个小鼠心脏的样本。
<ol start="2">
 <li>取出心脏，置于冰冷的线粒体分离缓冲液（300 mM 蔗糖，10 mM Na-HEPES，200 μM EDTA，pH 7.4）中，冲洗去除血液。</li>
</ol>
注意：为获得最佳结果，应使用 KOH 和乙酸调节线粒体缓冲液的 pH。
<ol start="3">
 <li>将心脏置于冰冷的培养皿上，去除脂肪和心房，用刀片充分剪碎，直至获得均匀的组织样品。</li>
 <li>将剪碎的心脏组织转移至50 ml Falcon离心管中，加入10 ml含有0.1 mg/ml胰蛋白酶的线粒体分离缓冲液，冰上孵育消化10分钟。</li>
</ol>
注意：在分离过程中使用胰蛋白酶可提高线粒体的分离得率，因此在不同线粒体制备过程中应保持胰蛋白酶的用量一致。我们建议在不含胰蛋白酶的条件下分离线粒体并检测其功能，以确保该酶不会干扰线粒体的正常功能。
<ol start="5">
 <li>加入 10 ml 线粒体分离缓冲液（含 0.1% 无脂肪酸 BSA 和 5 mg 胰蛋白酶抑制剂（大豆）），通过反复倒置试管数次以中和胰蛋白酶。</li>
</ol>
注意：线粒体分离缓冲液可预先配制，并于 -20 °C 保存。解冻后需检查 pH 值。胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂或 BSA 必须在实验当天加入线粒体分离缓冲液中。
<ol start="6">
 <li>在 4 °C 条件下，以低至中等速度离心 1 分钟，回收消化后的组织。</li>
 <li>将组织重悬于 8 ml 线粒体分离缓冲液（含 0.1% 无脂肪酸 BSA）中，使用配备特氟龙研杵的电动 Dounce 匀浆器进行匀浆（1,200–14,000 rpm，4–6 次）。匀浆过程中保持样品置于冰上。</li>
 <li>将匀浆液转移至 15 ml Falcon 管中，在 4 °C 条件下以 800×g 离心 10 分钟，沉淀细胞核和组织碎片。</li>
 <li>收集含有线粒体的上清液至 Eppendorf 管中，在 4 °C 条件下以 8,000×g 离心 15 分钟。</li>
 <li>小心移除顶部白色层，并用 1 ml 线粒体分离缓冲液洗涤剩余的较深色沉淀（含线粒体）。</li>
 <li>在 4 °C 条件下以 8,000×g 离心 15 分钟。弃去上清液，将线粒体沉淀重悬于 150 μl 线粒体分离缓冲液中。将线粒体置于冰上，用于后续实验。</li>
</ol>
注意：为获得功能测定的最佳结果，建议在线粒体分离后4小时内使用。
<ol start="12">
 <li>使用 Bradford 法测定线粒体蛋白含量。</li>
</ol>
2. 分离线粒体的质量控制
2.1. 呼吸控制率（RCR）的测定
<ol>
 <li>使用空气饱和的水校准Oxytherm氧电极，以建立最大氧信号线。当获得稳定的氧水平后，加入100 μl新配制的10 mM连二亚硫酸钠溶液，以建立零氧信号线。所有测量在30 °C下进行。</li>
 <li>向Oxytherm反应室中加入2 ml线粒体呼吸缓冲液（125 mM KCl，20 mM HEPES，3 mM MgCl2，400 μM EGTA，300 μM DTT，5 mM KH2PO4，pH 7.2），并加入1 μM鱼藤酮，密封反应室后开始记录。</li>
 <li>当氧信号稳定后，加入250 μg线粒体，记录1分钟的基础呼吸。此时呼吸速率应非常低，因为线粒体仅利用内源性底物进行呼吸（State 1呼吸）。</li>
 <li>加入5 mM琥珀酸，记录信号1分钟。在State 2呼吸期间，耗氧量应有所增加。</li>
 <li>加入150 μM ADP以诱导State 3呼吸。此时由于通过氧化磷酸化合成ATP，耗氧量应显著增加。持续记录信号直至呼吸速率减慢，表明ADP已消耗完毕并转入State 4呼吸。记录State 4呼吸至少1分钟。</li>
 <li>加入1 μM CCCP，记录信号1分钟。此时解偶联呼吸应达到最大值。</li>
</ol>
注意： CCCP 对线粒体呼吸的作用具有剂量依赖性：高浓度的 CCCP 可能抑制氧气消耗，因此应谨慎进行滴定。
<ol start="7">
 <li>通过将 State 3 呼吸期间的耗氧速率除以 State 4 呼吸期间的耗氧速率，计算呼吸控制比（RCR）。目标 RCR 应 ≥ 4。</li>
</ol>
2.2. 线粒体膜完整性的评估（细胞色素 c 检测）
<ol>
 <li>用70%乙醇和水彻底清洗Oxytherm反应室，并重复步骤2.1.2–2.1.4。</li>
 <li>加入1 mM ADP，记录1分钟内的氧气消耗量。</li>
 <li>加入10 μM细胞色素c。由于细胞色素c不能透过完整的线粒体膜，若呼吸作用增加，表明线粒体膜已破损或受损。</li>
</ol>
3. 线粒体通透性转换孔开放的检测
<ol>
 <li>设置荧光分光光度计以进行线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放的多参数测量。使用FelixGx程序创建一个新的硬件配置（Quanta master稳态模式），包括光源、激发单色器、样品室以及分别位于激发单色器90°和270°位置的两个检测器（图4）。为实现最大时间分辨率，在硬件配置菜单中必须禁用两个发射单色器（90°和270°），并启用样品室中90°和270°位置的发射滤光片。此步骤将移除发射波长的电机控制功能，并将每个单色器固定在特定波长。如果未禁用发射单色器，每个检测器将在两个波长之间循环，导致重复测量数据的记录。</li>
 <li>创建一个新的采集协议，选择“Multi Dye”类型，并输入以下染料参数：
 <ul>
 <li>Fura（高Ca++）：激发波长340 nm，发射波长525 nm（检测器1）</li>
 <li>Fura（低Ca++）：激发波长380 nm，发射波长525 nm（检测器1）</li>
 <li>JC1（聚集体）：激发波长543 nm，发射波长595 nm（检测器2）</li>
 <li>JC1（单体）：激发波长498 nm，发射波长525 nm（检测器1）</li>
 <li>肿胀：激发波长525 nm，发射波长525 nm（检测器1）</li>
 </ul>
 </li>
 <li>将激发和发射狭缝设置为1 nm，温度设置为37 °C。</li>
 <li>为获得Fura和JC-1的比率信号，生成两条衍生曲线：Fura（高Ca++）/Fura（低Ca++）和JC1（聚集体）/JC1（单体）。</li>
 <li>手动调节检测器1和检测器2的发射波长分别为525 nm和595 nm。</li>
 <li>在一次性四面透明甲基丙烯酸酯比色皿中，混合1 ml线粒体测定缓冲液（120 mM KCl，10 mM NaCl，1 mM KH2PO4，20 mM HEPES-Tris，pH 7.2）、1 μM鱼藤酮、5 mM琥珀酸和800 nM Fura FF。加入250 μg线粒体，并将样品放入样品室中。确保磁力搅拌器已开启。</li>
 <li>开始记录。1分钟后暂停采集，加入500 nM JC-1，然后重新开始采集。JC-1比率信号应上升，表明活性线粒体摄取了染料。持续记录直至JC-1信号达到平台期（通常在5分钟内）。</li>
 <li>加入20 μM CaCl2。应立即观察到Fura FF比率信号的瞬时升高，这是由于测定缓冲液中Ca2+浓度增加所致，随后因线粒体摄取Ca2+而逐渐下降。JC-1比率信号应出现短暂的瞬时降低，提示线粒体膜电位轻微去极化。</li>
 <li>等待Fura FF比率信号恢复至基础水平后，再进行下一次CaCl2脉冲（间隔约1-1.5分钟）。以固定间隔重复脉冲，直至线粒体无法继续积累Ca2+并开始向测定缓冲液中释放Ca2+。mtPTP的开放表现为Fura FF比率信号因Ca2+释放而同步升高，JC-1比率信号因膜电位崩溃而下降，以及光散射因线粒体肿胀而减弱（图5）。</li>
 <li>在mtPTP激活后，分别通过加入1 mM EGTA、1 μM CCCP和5 μg/ml 阿拉丁菌素来验证Fura FF、JC-1和肿胀信号的特异性。</li>
 <li>为验证mtPTP开放的特异性，可在存在1 μM环孢素A（环亲素D抑制剂）的情况下重复步骤3.6–3.9（环亲素D是mtPTP的组成部分）。在环孢素A存在时，mtPTP的开放所需CaCl2脉冲次数显著多于对照样品（图6）。</li>
</ol>
4. 代表性结果
图2展示了分离的小鼠心脏线粒体典型的呼吸控制。通过向以琥珀酸为底物进行呼吸的线粒体中添加ADP，可达到状态3呼吸，其特征是与仅含底物的情况相比，耗氧量显著增加。当添加的ADP消耗完毕后，进入状态4呼吸，此时耗氧速率减慢，与添加ADP前的速率相当。呼吸控制比（RCR）通过将状态3呼吸的耗氧速率除以状态4呼吸的耗氧速率获得。细胞色素c测试用于评估线粒体外膜的完整性：当向以琥珀酸和ADP为底物呼吸的线粒体中加入细胞色素c时，若呼吸速率未进一步增加，则表明线粒体外膜完整（图3）。
分离的心脏线粒体中mtPTP开放的代表性图像如图所示 图4在此情况下，通过添加 4 CaCl 诱发 mtPTP 开放2 脉冲（20 μM 每次间隔1.5分钟。通过线粒体Ca几乎同时释放可明显观察到mtPTP的开放2+ （Fura FF 比值信号升高）、线粒体膜电位崩溃（JC-1 比值信号降低）以及线粒体体积增大（肿胀信号降低）。当加入环孢素 A 时，其与线粒体通透性转换孔（mtPTP）中的亲环素 D 组分结合，mtPTP 的开放需要 7 次 CaCl₂ 脉冲刺激2 而不是4（图5).
<img alt="线粒体分离流程图；包括差速离心和极谱法。" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 分离心脏线粒体中多参数线粒体通透性转换孔开放实验方案的流程图。从小鼠中取出心脏并利用差速离心法分离线粒体。通过极谱法测定呼吸控制比以及在细胞色素 c 存在下线粒体膜的完整性，对线粒体样品进行定性评估。通过连续添加 CaCl2 诱导分离线粒体中线粒体通透性转换孔的开放，并使用荧光分光光度计监测线粒体内的 Ca2+ 释放、膜电位崩溃以及线粒体基质肿胀来测定孔的开放情况。
<img alt="Mitochondrial respiration graph; O2 consumption vs. time; ADP, succinate, CCCP effect on flux." src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 测量 分离心脏线粒体的呼吸控制比（RCR）。在琥珀酸和ADP存在下测定分离心脏线粒体在状态3下的耗氧量，以及在ADP消耗后状态4下的耗氧量。通过添加CCCP检测分离线粒体对解偶联剂的反应。图中数值表示分离线粒体的耗氧速率，单位为nmol/min/mg蛋白。
<img alt="耗氧量曲线；线粒体功能；时间与氧气浓度（nmol/ml）关系；代谢分析结果。" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 分离心脏线粒体膜完整性的测定。通过在存在琥珀酸和ADP的条件下测定分离线粒体的耗氧量，并在添加细胞色素 c 后进行比较，以评估线粒体膜的完整性。图中数值表示分离线粒体的耗氧速率，单位为 nmol/min/mg 蛋白质。
<img alt="“使用Fura和JC-1探针分析Ca²⁺水平的荧光光谱装置示意图”" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 用于多参数检测线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放的荧光分光光度计硬件配置。荧光分光光度计的硬件配置包括光源、激发单色器、样品室，以及两个固定发射波长分别为525 nm和595 nm的检测器。检测器1用于Fura FF高/低Ca2+、JC-1单体及肿胀信号的信号检测；检测器2用于检测JC-1聚集体信号。
<img alt="随时间变化的线粒体肿胀荧光比率图，显示 Ca²⁺ 效应及 JC-1 染料分析。" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图 5. 分离心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放的多参数测量。通过依次加入 20 μM CaCl2 诱导 mtPTP 开放，表现为线粒体释放 Ca2+、线粒体膜电位崩溃以及线粒体基质体积增大（肿胀）。胞外线粒体 Ca2+ 和膜电位采用比率型荧光探针 Fura FF（绿色曲线）和 JC-1（红色曲线）进行检测。线粒体肿胀通过在 525 nm 处记录光散射（黑色曲线）来测定。使用 1 μM CCCP 和 5 μg/ml 阿拉梅西汀（一种微生物毒素）验证 JC-1 信号和肿胀信号的特异性。
<img alt="钙离子诱导的线粒体变化图；荧光比值、肿胀、JC-1、Fura FF。" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 在环孢素A存在下，对分离的心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放的多参数测量。环孢素A（1 μM）增加了打开分离心脏线粒体中mtPTP所需的CaCl2脉冲次数。

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<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方案介绍了评估分离心脏线粒体中通透性转换孔开放所必需的实验步骤（图1 和图4）：小鼠心脏线粒体的分离方法、确保其完整性和功能性的呼吸控制、监测线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放过程中涉及的线粒体参数及其检测所用染料、荧光分光光度计仪器的设置，以及mtPTP开放的表征。本方案所用的荧光分光光度计可同时快速测量这三个参数。然而，基本方案也可使用其他市售仪器完成，尽管时间分辨率会有所降低。也可使用非比率型染料，但无法对Ca2+浓度和线粒体膜电位进行定量测定5。
在检测线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放时，获得高质量的线粒体样品至关重要，因为线粒体积累 Ca2+ 的能力以及维持膜电位的能力密切相关。例如，我们发现呼吸控制比（RCR）较低的线粒体表现出 JC-1 聚集减少以及 Ca2+ 转运能力下降。我们用于分离心脏线粒体的方法是在先前发表的方案6, 7基础上改进而来，经呼吸控制比和细胞色素 c...

<table><tbody><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3030</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂（大豆）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>连二亚硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71699</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>细胞色素 &lt;em&gt;c&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>阿莱霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4665</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>环孢素 A</td><td>Calbiochem</td><td>239835</td><td></td></tr><tr><td>Fura FF</td><td>Invitrogen</td><td>F14180</td><td></td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Invitrogen</td><td>T3168</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 玻璃-聚四氟乙烯匀浆器（Potter-Elvehjem 型）</td><td>Wheaton Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顶置式搅拌器</td><td>Wheaton Industries</td><td>903475</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm（带温度控制的氧电极）</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaMaster 80 双发射光谱荧光仪</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

离体小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放的多参数测量

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

线粒体通透性转换孔（mtPTP）是一种非特异性通道，形成于线粒体内膜，可转运分子量小于1.5 kDa的溶质。尽管该通道的确切分子身份仍有争议，但已有研究表明亲环素D、VDAC和ANT等蛋白质参与了mtPTP的形成。虽然mtPTP开放在细胞死亡中的作用已得到充分证实1，但越来越多的证据表明，mtPTP在线粒体Ca2+稳态2、生物能量学和氧化还原信号传导3过程中也发挥着生理功能。
mtPTP 的开放由基质 Ca2+ 触发，但其活性可受多种其他因素调节，如氧化应激、腺苷酸耗竭、高浓度无机磷酸盐（Pi）、线粒体膜去极化或解偶联以及长链脂肪酸4。体外实验中，可通过外源性添加 Ca2+ 提高线粒体基质内 Ca2+ 浓度（钙保留能力）来诱导 mtPTP 开放。当线粒体内 Ca2+ 水平达到一定阈值时，mtPTP 开放，促进 Ca2+ 释放，导致质子驱动力耗散、膜电位崩溃以及线粒体基质体积增加（肿胀），最终引起线粒体外膜破裂和细胞器功能的不可逆丧失。
本文介绍一种荧光测定法，可用于对分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放进行全面表征。该检测方法可同时测量 mtPTP 开放时发生的三个线粒体参数变化：线粒体 Ca2+ 处理能力（通过测定反应体系中 Ca2+ 浓度反映其摄取与释放）、线粒体膜电位以及线粒体体积。用于测定反应体系中 Ca2+ 和线粒体膜电位的染料分别为 Fura FF 和 JC-1。Fura FF 是一种膜不通透性、比率型指示剂，在 Ca2+ 存在时其激发波长发生偏移；JC-1 是一种阳离子性、比率型指示剂，在膜电位较低时形成绿色单体，在膜电位较高时形成红色聚集体。线粒体体积的变化通过记录线粒体悬液的光散射来测定。由于 mtPTP 开放检测需要高质量且功能完整的线粒体，本文还描述了获得完整、高度偶联且功能正常的分离心脏线粒体所必需的操作步骤。

本文介绍了一种利用光谱荧光法测定分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔开放的实验方案。该检测方法包括同时测量线粒体的Ca2+处理能力、线粒体膜电位以及线粒体体积。同时，还描述了获取高质量且具有功能活性的心脏线粒体的操作步骤。

线粒体通透性转换孔（mtPTP）是一种在线粒体内膜中形成的非特异性通道，可转运分子量小于1.5 kDa的溶质，其开放与细胞凋亡及坏死等生理病理过程密切相关。

本视频的目的是介绍一种用于表征线粒体通透性转换的方法，重点研究从小鼠心脏分离的线粒体中通透性转换孔的开放程度较低的现象。首先，从小鼠心脏中分离线粒体。采用差速离心法分离线粒体后，通过连接计算机的氧热氧电极测定呼吸控制比，以评估分离线粒体的质量并评价线粒体膜的完整性。随后利用荧光分光光度仪器，同时测量钙处理能力、线粒体膜电位和线粒体体积，以确定通透性转换。孔道开放不良。结果显示，钙保留能力与线粒体通透性转换存在差异。分离线粒体的敏感性较差，线粒体通透性转换孔的开放是一个复杂的现象，涉及线粒体生理学和解剖学多个层面的变化。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，同时测量多个参数能够比单独测量单个参数（如钙离子、转位或肿胀）提供对现象更全面的描述。在开始实验前，解冻线粒体分离缓冲液并检测其pH值，应为7.4。然后将所有将要使用的缓冲液、培养皿和离心管置于冰上。注意线粒体分离方案的所有步骤都必须在冰上进行。将安乐死小鼠的心脏置于培养皿中，用冰冷的线粒体分离缓冲液冲洗掉血液。接着，用刀片将心脏转移至新的培养皿，去除脂肪组织和心房，然后将心脏组织切碎，直至获得均一的组织匀浆。将切碎的心脏组织转移至一个50毫升的锥形管中。加入10毫升线粒体分离缓冲液（含0.1毫克/毫升胰蛋白酶），将样品置于冰上消化10分钟。注意：使用胰蛋白酶可提高线粒体的分离得率，因此在线粒体制备过程中应保持一致。然而，我们建议在未使用胰蛋白酶的条件下获得线粒体样本，并检测其功能，以确保该酶不会干扰线粒体的离子状态。孵育结束后，加入10毫升含有0.1%无脂肪酸BSA和5毫克胰蛋白酶抑制剂的线粒体分离缓冲液，通过反复倒置离心管数次进行混匀，以中和胰蛋白酶。随后在4°C条件下以低至中等速度离心1分钟，回收消化后的组织。离心结束后，将组织重悬于8毫升含0.1%无脂肪酸BSA的线粒体分离缓冲液中，样品置于冰上保存。使用配备特氟龙研杵的电动匀浆器，在1,200至1,400 rpm条件下匀浆4到6次。将匀浆液转移至15毫升锥形管中，在4°C条件下以800 × g离心10分钟。为了沉淀细胞核和组织碎片。离心后，收集含有线粒体的上清液至微量离心管中，在4°C条件下以8,000 × g离心15分钟。离心后，沉淀物表面将出现一层白色物质。使用真空系统小心吸除并去除线粒体沉淀上方的白色层。然后将剩余的较深色沉淀重新悬浮于 1 毫升线粒体分离缓冲液中，该沉淀含有线粒体。接下来在4摄氏度下以8,000 × g离心10分钟，沉淀线粒体。弃去上清液，将线粒体沉淀重新悬浮。在150 µL线粒体分离缓冲液中重悬线粒体，并将线粒体置于冰上保存。使用连接计算机并由Oxy控制的氧热敏氧电极测量分离线粒体的呼吸。Plus软件应在实验当天对氧电极进行校准。向氧电极 chamber 中加入2毫升线粒体呼吸缓冲液，使其含有终浓度为1微摩尔的鱼藤酮，密封 chamber 并开始记录氧信号。系统记录并在计算机屏幕上显示的信号与氧热室中的氧气浓度成正比。当氧信号稳定后，加入250微克线粒体，并记录一分钟的基础呼吸。此时呼吸水平应非常低，因为线粒体正在利用内源性底物进行呼吸。这是状态一呼吸。加入琥珀酸至终浓度为5毫摩尔，以启动线粒体在复合体II处的呼吸，并记录一分钟信号。在状态二呼吸期间，氧气消耗应增加。为了诱导状态呼吸，加入DP至终浓度为150微摩尔。此时，由于通过氧化磷酸化合成TP，耗氧量应增加。持续记录信号，直至呼吸减缓，表明DP已消耗完毕，并过渡到状态四呼吸记录。第四阶段：至少维持呼吸状态一分钟。加入CCCP，使其终浓度为1微摩尔，并记录一分钟内的信号。此时，非耦合呼吸应达到最大值。通过将状态三期间的耗氧速率除以状态四期间的耗氧速率，计算呼吸控制比。目标呼吸控制比应大于4。接下来，为评估线粒体膜完整性，在一份新的线粒体样品中加入ADP至终浓度为1毫摩尔/升，以诱导状态三呼吸。然后记录一分钟的耗氧量，加入10 µM细胞色素C，再记录两到三分钟的耗氧量。由于在质量良好的线粒体制备物中，细胞色素C无法透过完整的线粒体膜，因此呼吸作用不会增加或仅有极轻微的增加。若呼吸作用增加，则表明线粒体膜已破损或受损。用于线粒体通透性转换孔开放的多参数测量的仪器，包括一台由Felix GX程序控制的Quantum Master双发射光谱荧光仪。使用Felix GX程序建立一个多通道采集方案，输入用于测量钙离子、线粒体膜电位以及肿胀的参数，针对比例型染料Fura和JC-1，生成相应的比例曲线以及JC-1比例曲线。在一次性四面光程的甲基丙烯酸甲酯比色皿中，混合1毫升线粒体测定缓冲液，其中含终浓度为1 μM的鱼藤酮、5 mM的琥珀酸和800 nM的Fura FF，加入250微克线粒体，并将样品置于光谱荧光仪的样品室中。一分钟后开始记录荧光信号，暂停采集，加入500纳米浓度的JC-1，然后重新启动采集。JC-1的比值信号应上升，表明活性线粒体摄取了染料。持续记录，直至JC-1信号达到平台期。通常在五分钟内，加入氯化钙至终浓度为 20 微摩尔。应立即观察到 Fluor FF 比值信号的瞬时升高，表明检测缓冲液中钙离子浓度增加，随后因线粒体摄取钙离子而逐渐下降。JC-1 比值信号应出现短暂的瞬时降低，提示线粒体膜电位轻微去极化。当内质网FF比值信号恢复至基础水平时，通常在再次加入20微摩尔氯化钙后1至1.5分钟内，继续以固定时间间隔进行刺激，直至线粒体无法再积累钙离子并开始向检测缓冲液中释放钙离子。由于钙离子释放，线粒体通透性转换孔开放可通过URA FF比值信号同步升高来观察；同时可观察到JC-1信号比值因膜电位崩溃而降低，以及因线粒体肿胀而引起的光散射减弱，线粒体样本来源于C57BL/6J小鼠。如本视频所示，在存在琥珀酸和ADP的条件下测量三态呼吸期间的耗氧量，以及在ADP消耗完毕后测量四态呼吸期间的耗氧量。如图所示，加入ADP后，由于氧化磷酸化作用，耗氧量增加；随后耗氧速率减慢。当所有ADP被消耗完后，在存在CCCP的条件下通过添加CCCP来测定分离线粒体对解偶联的反应。在CCCP存在时，耗氧速率高于三态呼吸期间的耗氧速率，以此评估分离线粒体膜的完整性。在存在琥珀酸盐和ADP（二磷酸腺苷）以及添加细胞色素C的情况下，测量了氧气消耗量。如图所示，与仅添加ADP和琥珀酸盐相比，添加细胞色素C并未显著增加氧气消耗，表明线粒体膜完整，细胞色素C无法通透。通过检测分离的心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore）的开放程度，可作为线粒体钙保留能力的指标。线粒体通透性转换。通过连续添加20微摩尔浓度的钙离子诱导通透性转换孔的开放。使用比率型指示剂检测了氯化钙、线粒体外钙离子浓度和膜电位。URA FF 显示为绿色轨迹，JC-1 显示为红色轨迹，线粒体肿胀通过记录525纳米处的光散射来测定，显示为黑色轨迹。JC-1和肿胀信号的特异性通过加入1微摩尔的CCCP和5微克/毫升的微生物毒素伊辛（ethin）进行验证。如图所示，线粒体摄取钙离子伴随着线粒体膜电位的轻微去极化。经过四次钙脉冲后，线粒体通透性转换孔的开放表现为URA FF信号的增加，提示钙离子释放。JC-1荧光信号的降低表明线粒体膜电位崩溃，同时线粒体基质体积增大，表现为光散射减少，作为线粒体肿胀的标志，用于验证线粒体通透性转换孔开放的特异性。在存在环孢素A的条件下重复相同的测量，环孢素A可结合线粒体通透性转换孔的组分——亲环素D。如本图所示，1 μmol/L环孢素A的存在增加了诱导线粒体通透性转换孔开放所需的氯化钙脉冲次数，相较于对照样品。 观看本视频后，您应能够充分理解如何评估分离的心脏线粒体中线粒体通透性转换孔的开放情况。该实验流程中最困难的部分是获得高质量的分离线粒体。因此，在将线粒体用于后续实验之前，进行质量控制检测至关重要。

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生物学

小鼠离体心肌线粒体通透性转换孔开放中的多参数测量。

比较样品间线粒体膜电位可提供有关细胞状态的重要信息。本文详细描述了分离线粒体以及利用荧光法检测其对抑制剂和解偶联剂反应的实验步骤。通过细胞培养和细胞应激动物模型的应用，展示了该实验方案的方法学特点及其应用价值。...

从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（ΔΨm）来摄取钙离子（Ca2+），从而调控细胞质内的Ca2+信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca2+摄取和ΔΨm的方法。...

活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

本文介绍了两种用于测量分离线粒体和培养细胞中线粒体 Ca2+ 内流的实验方案。针对分离的线粒体，我们详细描述了一种基于酶标仪的 Ca2+ 摄取检测方法，该方法使用对 Ca2+ 敏感的染料钙绿素绿-5N（calcium green-5N）。对于培养细胞，我们描述了一种使用 Ca2+ 染料 Rhod-2/AM...

分离线粒体与培养细胞中线粒体钙离子内流的分析

本文介绍了一种利用JC-1染料检测细胞在缺氧/复氧处理（无论是否添加保护剂）后线粒体膜电位的实验方案。...

一种基于流式细胞术的检测方法，用于测量缺氧/复氧后心肌细胞线粒体膜电位

本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。...

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

在本研究中，我们描述了一种改进的实验方案，通过使用重组的perfringolysin...

测量重组Perfringolysin O透化细胞中的线粒体底物通量

我们描述了一种实验装置，可用于在持续灌注模式下向离体灌注的小鼠心脏输注超极化13C标记的代谢物。采用专门的13C核磁共振（NMR）采集方法，可实时定量测定代谢酶活性；同时通过多参数31P-NMR分析，测定组织中的ATP含量和pH值。...

使用超极化 [1-13C]丙酮酸及 13C/31P 核磁共振波谱法研究离体灌注小鼠心脏的代谢

该方法利用线粒体通透性转换孔对低电导质子漏的贡献，测定新生脆性X综合征小鼠心肌细胞线粒体辅酶Q含量升高情况下孔道开放的电压阈值，并与野生型对照小鼠进行比较。...

辅酶Q过量条件下线粒体通透性转换孔开放概率的评估

本方案描述了一种比较性检测方法，通过检测在有或无 Na+ 存在条件下线粒体复合物 CI+CIII 和 CII+CIII...

线粒体内膜对 Na+ 的敏感性揭示了功能型辅酶Q池的部分区室化

本文介绍了一种用于测定人或小鼠骨骼肌新鲜通透化肌纤维中线粒体氧化磷酸化水平的综合性方法。该方法能够在保持线粒体网络结构和膜完整性的前提下，实时定量检测线粒体呼吸，并评估底物偏好性与代谢灵活性。...

通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

学习使用光谱荧光法同时测量小鼠离体心肌线粒体的钙离子处理、膜电位和体积变化，以评估线粒体通透性转换孔开放。该方法为研究线粒体功能与疾病机制提供了可靠的技术手段。

离体小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放的多参数测量

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