离体小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放的多参数测量

本视频的目的是介绍一种用于表征线粒体通透性转换的方法，重点研究从小鼠心脏分离的线粒体中通透性转换孔的开放程度较低的现象。首先，从小鼠心脏中分离线粒体。

采用差速离心法分离线粒体后，通过连接计算机的氧热氧电极测定呼吸控制比，以评估分离线粒体的质量并评价线粒体膜的完整性。随后利用荧光分光光度仪器，同时测量钙处理能力、线粒体膜电位和线粒体体积，以确定通透性转换。孔道开放不良。

结果显示，钙保留能力与线粒体通透性转换存在差异。分离线粒体的敏感性较差，线粒体通透性转换孔的开放是一个复杂的现象，涉及线粒体生理学和解剖学多个层面的变化。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于，同时测量多个参数能够比单独测量单个参数（如钙离子、转位或肿胀）提供对现象更全面的描述。在开始实验前，解冻线粒体分离缓冲液并检测其pH值，应为7.4。然后将所有将要使用的缓冲液、培养皿和离心管置于冰上。注意线粒体分离方案的所有步骤都必须在冰上进行。

将安乐死小鼠的心脏置于培养皿中，用冰冷的线粒体分离缓冲液冲洗掉血液。接着，用刀片将心脏转移至新的培养皿，去除脂肪组织和心房，然后将心脏组织切碎，直至获得均一的组织匀浆。

将切碎的心脏组织转移至一个50毫升的锥形管中。加入10毫升线粒体分离缓冲液（含0.1毫克/毫升胰蛋白酶），将样品置于冰上消化10分钟。注意：使用胰蛋白酶可提高线粒体的分离得率，因此在线粒体制备过程中应保持一致。

然而，我们建议在未使用胰蛋白酶的条件下获得线粒体样本，并检测其功能，以确保该酶不会干扰线粒体的离子状态。孵育结束后，加入10毫升含有0.1%无脂肪酸BSA和5毫克胰蛋白酶抑制剂的线粒体分离缓冲液，通过反复倒置离心管数次进行混匀，以中和胰蛋白酶。随后在4°C条件下以低至中等速度离心1分钟，回收消化后的组织。

离心结束后，将组织重悬于8毫升含0.1%无脂肪酸BSA的线粒体分离缓冲液中，样品置于冰上保存。使用配备特氟龙研杵的电动匀浆器，在1,200至1,400 rpm条件下匀浆4到6次。将匀浆液转移至15毫升锥形管中，在4°C条件下以800 × g离心10分钟。

为了沉淀细胞核和组织碎片。离心后，收集含有线粒体的上清液至微量离心管中，在4°C条件下以8,000 × g离心15分钟。离心后，沉淀物表面将出现一层白色物质。

使用真空系统小心吸除并去除线粒体沉淀上方的白色层。然后将剩余的较深色沉淀重新悬浮于 1 毫升线粒体分离缓冲液中，该沉淀含有线粒体。

接下来在4摄氏度下以8,000 × g离心10分钟，沉淀线粒体。弃去上清液，将线粒体沉淀重新悬浮。在150 µL线粒体分离缓冲液中重悬线粒体，并将线粒体置于冰上保存。

使用连接计算机并由Oxy控制的氧热敏氧电极测量分离线粒体的呼吸。Plus软件应在实验当天对氧电极进行校准。向氧电极 chamber 中加入2毫升线粒体呼吸缓冲液，使其含有终浓度为1微摩尔的鱼藤酮，密封 chamber 并开始记录氧信号。

系统记录并在计算机屏幕上显示的信号与氧热室中的氧气浓度成正比。当氧信号稳定后，加入250微克线粒体，并记录一分钟的基础呼吸。此时呼吸水平应非常低，因为线粒体正在利用内源性底物进行呼吸。

这是状态一呼吸。加入琥珀酸至终浓度为5毫摩尔，以启动线粒体在复合体II处的呼吸，并记录一分钟信号。在状态二呼吸期间，氧气消耗应增加。

为了诱导状态呼吸，加入DP至终浓度为150微摩尔。此时，由于通过氧化磷酸化合成TP，耗氧量应增加。持续记录信号，直至呼吸减缓，表明DP已消耗完毕，并过渡到状态四呼吸记录。

第四阶段：至少维持呼吸状态一分钟。加入CCCP，使其终浓度为1微摩尔，并记录一分钟内的信号。此时，非耦合呼吸应达到最大值。

通过将状态三期间的耗氧速率除以状态四期间的耗氧速率，计算呼吸控制比。目标呼吸控制比应大于4。接下来，为评估线粒体膜完整性，在一份新的线粒体样品中加入ADP至终浓度为1毫摩尔/升，以诱导状态三呼吸。

然后记录一分钟的耗氧量，加入10 µM细胞色素C，再记录两到三分钟的耗氧量。由于在质量良好的线粒体制备物中，细胞色素C无法透过完整的线粒体膜，因此呼吸作用不会增加或仅有极轻微的增加。若呼吸作用增加，则表明线粒体膜已破损或受损。

用于线粒体通透性转换孔开放的多参数测量的仪器，包括一台由Felix GX程序控制的Quantum Master双发射光谱荧光仪。使用Felix GX程序建立一个多通道采集方案，输入用于测量钙离子、线粒体膜电位以及肿胀的参数，针对比例型染料Fura和JC-1，生成相应的比例曲线以及JC-1比例曲线。在一次性四面光程的甲基丙烯酸甲酯比色皿中，混合1毫升线粒体测定缓冲液，其中含终浓度为1 μM的鱼藤酮、5 mM的琥珀酸和800 nM的Fura FF，加入250微克线粒体，并将样品置于光谱荧光仪的样品室中。

一分钟后开始记录荧光信号，暂停采集，加入500纳米浓度的JC-1，然后重新启动采集。JC-1的比值信号应上升，表明活性线粒体摄取了染料。持续记录，直至JC-1信号达到平台期。

通常在五分钟内，加入氯化钙至终浓度为 20 微摩尔。应立即观察到 Fluor FF 比值信号的瞬时升高，表明检测缓冲液中钙离子浓度增加，随后因线粒体摄取钙离子而逐渐下降。JC-1 比值信号应出现短暂的瞬时降低，提示线粒体膜电位轻微去极化。

当内质网FF比值信号恢复至基础水平时，通常在再次加入20微摩尔氯化钙后1至1.5分钟内，继续以固定时间间隔进行刺激，直至线粒体无法再积累钙离子并开始向检测缓冲液中释放钙离子。由于钙离子释放，线粒体通透性转换孔开放可通过URA FF比值信号同步升高来观察；同时可观察到JC-1信号比值因膜电位崩溃而降低，以及因线粒体肿胀而引起的光散射减弱，线粒体样本来源于C57BL/6J小鼠。

如本视频所示，在存在琥珀酸和ADP的条件下测量三态呼吸期间的耗氧量，以及在ADP消耗完毕后测量四态呼吸期间的耗氧量。如图所示，加入ADP后，由于氧化磷酸化作用，耗氧量增加；随后耗氧速率减慢。当所有ADP被消耗完后，在存在CCCP的条件下通过添加CCCP来测定分离线粒体对解偶联的反应。在CCCP存在时，耗氧速率高于三态呼吸期间的耗氧速率，以此评估分离线粒体膜的完整性。

在存在琥珀酸盐和ADP（二磷酸腺苷）以及添加细胞色素C的情况下，测量了氧气消耗量。如图所示，与仅添加ADP和琥珀酸盐相比，添加细胞色素C并未显著增加氧气消耗，表明线粒体膜完整，细胞色素C无法通透。通过检测分离的心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore）的开放程度，可作为线粒体钙保留能力的指标。线粒体通透性转换。通过连续添加20微摩尔浓度的钙离子诱导通透性转换孔的开放。

使用比率型指示剂检测了氯化钙、线粒体外钙离子浓度和膜电位。URA FF 显示为绿色轨迹，JC-1 显示为红色轨迹，线粒体肿胀通过记录525纳米处的光散射来测定，显示为黑色轨迹。JC-1和肿胀信号的特异性通过加入1微摩尔的CCCP和5微克/毫升的微生物毒素伊辛（ethin）进行验证。如图所示，线粒体摄取钙离子伴随着线粒体膜电位的轻微去极化。

经过四次钙脉冲后，线粒体通透性转换孔的开放表现为URA FF信号的增加，提示钙离子释放。JC-1荧光信号的降低表明线粒体膜电位崩溃，同时线粒体基质体积增大，表现为光散射减少，作为线粒体肿胀的标志，用于验证线粒体通透性转换孔开放的特异性。在存在环孢素A的条件下重复相同的测量，环孢素A可结合线粒体通透性转换孔的组分——亲环素D。如本图所示，1 μmol/L环孢素A的存在增加了诱导线粒体通透性转换孔开放所需的氯化钙脉冲次数，相较于对照样品。

观看本视频后，您应能够充分理解如何评估分离的心脏线粒体中线粒体通透性转换孔的开放情况。该实验流程中最困难的部分是获得高质量的分离线粒体。因此，在将线粒体用于后续实验之前，进行质量控制检测至关重要。