Name: 制作生物功能纳米纤维的过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习利用阴离子聚合与静电纺丝技术制备生物功能纳米纤维，通过合成嵌段共聚物并结合单壁碳纳米管，实现与特定蛋白质IgE的特异性结合。该方法在生物传感和药物递送领域具有重要应用价值。

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本工作由美国国家科学基金会（NSF）HRD-0630456项目、NSF CREST计划以及NSF DMR-0934142项目资助。

1. α,ω-二羟基聚合物[HO-PEO-P2MS-PEO-OH]的合成
<ol>
 <li>按照图1所示组装聚合反应器。本实验所用反应器包括一个100 ml圆底双颈烧瓶（带标准磨口外接头，Chemglass）、两个带活塞的流量控制接头（Chemglass）以及一根聚四氟乙烯（Teflon）搅拌棒。接头A（图1）用于通入超纯氮气（UHP Nitrogen），以防止空气和水分进入惰性体系；接头B（图1）用于向反应烧瓶中注入溶剂、单体和引发剂。</li>
 <li>使用钠金属干燥200 ml四氢呋喃（THF），以二苯甲酮作为指示剂，在干燥氮气氛围下至少干燥6小时。</li>
 <li>将10 ml 2-甲氧基苯乙烯在氢化钙中干燥24小时。</li>
 <li>使用异丙醇与液氮混合物配制浆状冷却浴，并维持在-78 °C。</li>
 <li>在氮气氛围下向聚合反应烧瓶中加入25 ml THF，并在整个聚合过程中始终保持反应器处于氮气氛围中（见图1）。</li>
 <li>将100 ml圆底烧瓶浸入上述浆状冷却浴中。</li>
 <li>向反应烧瓶中加入2 ml引发剂溶液（0.27 mmol/ml）。</li>
 <li>注入第一种单体——2-甲氧基苯乙烯（4 ml）至反应烧瓶中。</li>
 <li>让反应持续进行40分钟。</li>
 <li>加入1 ml第二种单体——环氧乙烷。</li>
 <li>使聚合反应在室温下继续进行两天。</li>
 <li>使用盐酸（6 M）/甲醇（1/20，体积比）终止聚合反应。</li>
 <li>通过将聚合物沉淀至正己烷中进行纯化，并在真空烘箱中干燥聚合物。</li>
 <li>采用核磁共振（NMR）对聚合物进行表征。</li>
</ol>
2. 利用N-2,4-二硝基苯基-ε-氨基己酸对α,ω-二羟基聚合物进行功能化修饰以获得功能化聚合物CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP
<ol>
 <li>在三口烧瓶中，加入α,ω-二羟基聚合物（0.05 mmol）、N-2,4-二硝基苯基-ε-氨基己酸（N-2,4-DNP-E-amino caproic acid，0.25 mmol）、DCC（0.15 mmol）和 DMAP（0.005 mmol），连接真空线干燥 4 小时。</li>
 <li>将干燥的二氯甲烷（10 ml）蒸馏入烧瓶中。</li>
 <li>在氮气氛围下解除真空，于室温下搅拌反应12小时。</li>
 <li>过滤反应混合物，并通过在己烷和甲醇中分别沉淀两次来回收聚合物。</li>
 <li>在真空烘箱中干燥沉淀的聚合物 40 °C.</li>
 <li>通过FT-IR测定聚合物结构和官能团 1H NMR</li>
</ol>
3. 用于静电纺丝的CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT溶液的制备
<ol>
 <li>将20 w %的CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP溶解于氯苯中。</li>
 <li>将20 w %和40 w %的聚苯乙烯（分子量800,000）分别溶解于氯苯中，制备两种溶液。使用较高分子量的聚苯乙烯可增加聚合物链间的缠结，从而获得静电纺丝所需的最优黏度。</li>
 <li>将步骤3.1和3.2中制备的聚合物溶液按1:1和1:2的比例混合，并向混合物中加入1 w %的单壁碳纳米管（SWCNT），搅拌过夜以确保碳纳米管均匀分散。</li>
</ol>
4. 聚合物-碳纳米管复合材料的静电纺丝
<ol>
 <li>按照图2所示组装静电纺丝装置。图的右侧为Glassman高压电源。其旁边是一个铁架台，硅片固定在该铁架台上。左侧是另一个铁架台，用于安装注射器，其后方设有照明灯，以便在实验进行过程中观察操作过程。</li>
 <li>使用皮下注射器吸取少量CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/聚苯乙烯/SWCNT混合物（约1 ml），并将该注射器安装在铁架台上。</li>
 <li>将硅片牢固地固定在距离注射器对面10 cm处，并将高压电源的接地夹连接至硅片上。</li>
 <li>将施加高压的夹子连接至注射器针头，轻轻推动活塞（使针尖悬挂一滴液滴），此时静电纺丝准备就绪。</li>
 <li>开启高压电源，并将电压调节至10 kV。根据复合材料中聚合物的性质，可能需要更高的电压，特别是当需要制备直径小于一百纳米的纳米纤维时。</li>
 <li>取下硅片，放入干燥器中过夜，使其完全干燥。</li>
</ol>
5. 纳米纤维的表征
<ol>
 <li>使用光学显微镜对纳米纤维进行初步成像，以观察纤维的整体形貌。</li>
 <li>利用扫描电子显微镜观察更精细的结构特征，如形貌、直径、平均孔径等。</li>
 <li>进一步采用原子力显微镜进行成像，以观察纤维的三维表面形貌等。</li>
</ol>
6. 纳米纤维与抗DNP IgE蛋白结合特异性的研究
<ol>
 <li>在 PBS-BSA（磷酸盐缓冲液-牛血清白蛋白）溶液中配制浓度为 4 µg/L 的荧光标记 FITC-IgE（异硫氰酸荧光素-免疫球蛋白 E）溶液。</li>
 <li>将带有纳米纤维的一小片硅片放置于 MatTek 培养皿的盖玻片上。将纳米纤维在上述溶液中孵育 1 小时。孵育时，用移液器轻柔地将 10 µL IgE 溶液加至硅片表面。</li>
 <li>孵育后，用 PBS-BSA 缓冲液洗涤样品三次，以去除未结合的 IgE。加缓冲液时应将其轻轻加至 MatTek 培养皿的皿壁，避免直接冲击纳米纤维。用手轻轻晃动培养皿，使缓冲液均匀覆盖纳米纤维。随后用移液器小心吸除缓冲液，并重复该洗涤步骤两次。</li>
 <li>作为对照，在相同条件下，将纳米纤维与荧光标记的 IgG（对 DNP 非特异性）进行孵育。</li>
 <li>使用共聚焦显微镜观察 IgE 与纳米纤维的结合情况。在本研究中，使用的显微镜为 Leica TCS SP2 共聚焦显微镜，配备 63× 物镜。</li>
</ol>
7. 纳米纤维的电流-电压特性
 
<ol>
 <li class="jove_content">将两个微位移器连接至极低电流源，例如 Keithley 6430 高灵敏度源表。用于测定电流-电压行为的装置如图3所示。该图展示了用于测定纳米纤维初始I-V特性的探针台。该系统由 Bausch and Lomb MicroZoom 显微镜、真空吸盘载物台以及四个用于探针测量的微位移器组成。右上方为 Agilent 34405A 数字万用表，用于测量电压；其下方为 Keithley 6430 亚飞安远程源表，用于向纤维施加低电流输入。</li>
 <li class="jove_content">将微位移器的探针臂安装在纤维膜相对两侧上方，并使探针尖端接触纤维。</li>
 <li class="jove_content">将另外两个微位移器连接至数字万用表，将探针臂安装在前两个探针之间，并使探针尖端落在纤维膜上。确保四个探针尖端尽可能共线。</li>
 <li class="jove_content">从 Keithley 源表输入不同大小的电流（通常在纳安量级）。</li>
 <li class="jove_content">对每一个输入电流值，测量外侧两个探针之间的电压降。</li>
 <li class="jove_content">绘制这些数值的关系图，可判断纤维膜所表现出的器件类型。</li>
</ol>
 
8. 代表性结果
功能聚合物
α,ω-双[2,4-二硝基苯基己酸][聚(乙二醇)-b-聚(2-甲氧基苯乙烯)-b-聚(乙二醇)]（CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP）的合成方法如图4所示。1 功能聚合物的结构通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）（图5）和500 MHz 1H 核磁共振波谱（图6）进行了确认。FT-IR谱图显示，在约3,500 cm-1处的-OH宽吸收峰完全消失，表明CDNP基团的官能化反应已定量完成。这一结果也由图6所示的核磁共振谱图得到证实。通过核磁共振谱图中各峰面积的积分计算，确定CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP聚合物已实现定量官能化。
纳米纤维
在图7中，展示了通过将CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/聚苯乙烯/SWCNT溶于氯苯后进行静电纺丝所获得的导电纳米纤维膜。共聚焦图像显示，蛋白质IgE与纤维表面的DNP发生结合3。这表明静电纺丝制备的DNP-聚合物对IgE抗体具有特异性结合能力。由于该蛋白质带有荧光标记，因此荧光强度可作为IgE存在于纳米纤维上的指示指标。
图8a 是通过该工艺获得的纳米纤维之一的原子力显微镜（AFM）图像，图8b 显示该特定纳米纤维的直径约为 150 nm。通过此工艺可获得直径在 100–700 nm 之间的纤维。目前尚难以制备具有特定尺寸的纤维，这与其他研究团队所观察到的结果一致4。图9 展示了 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /聚苯乙烯/SWCNT 纳米纤维的扫描电镜（SEM）图像，纳米纤维的直径在 200 nm 至 300 nm 之间。图中展示了三种不同放大倍数下的纳米纤维 SEM 图像。对这三幅图像的研究表明，纤维的形貌呈线性并带有珠状结构。总体目标是制备出以线性为主的纤维。图10 展示了由 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /聚苯乙烯/SWCNT 制备的纳米纤维膜的电流-电压（I-V）曲线图，该曲线表现出电阻器的特性（欧姆行为）。当抗原与纳米纤维结合时，我们预期会观察到纤维膜 I-V 行为的变化，因为这种电阻变化是一种特征性信号，表明功能化纤维有望作为单分子检测传感器中的活性元件使用。
<img alt="用于样品分离的带注射器和旋塞的真空过滤装置示意图。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 用于合成α,ω-二羟基聚合物的聚合反应器。A) 超高纯氮气流动注入点。B) 溶剂、单体和引发剂的注入点。C) 反应容器。
<img alt="用于质量测量的精密天平和电子设备的实验室装置。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用 Glassman 高压电源进行静电纺丝的装置。
<img alt="用于光子学研究的MicroZoom II显微镜装置，配备光学测量设备。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 使用亚飞安远程源表（Keithley）测量I-V曲线的实验装置。
<img alt="显示活性阴离子聚合制备共聚物的聚合物合成示意图，包含反应物。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. A) 制备 OH-PEO-P2MS-PEO-OH 聚合物的合成路线。B) α,ω-二羟基[聚(环氧乙烷)-b-聚(2-甲氧基苯乙烯)-b-聚(环氧乙烷)]的官能化。
<img alt="红外光谱图，OH基团吸收，透射率与波数关系，光谱分析。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH（CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP的前驱体）和(B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP的傅里叶变换红外（FT-IR）光谱。
<img alt="核磁共振谱图，化学结构细节，芳香族化合物分析，质子归属。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP 的 500 MHz 质子核磁共振谱。
<img alt="神经元网络，荧光显微镜；显示神经元连接，光学激发分析。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. A) FITC标记的IgE与从氯苯中电纺出的CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP纤维的结合图像。B) 对照组（含IgG的纳米纤维）的共聚焦显微镜图像。
<img alt="Atomic force microscopy image with nanoscale filament analysis; height profile graph beneath." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
图8. A) 由氯苯电纺制备的CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP纤维的原子力显微镜（AFM）图像，以及B) AFM剖面图 即 单根纤维的尺寸如图所示 图5a.
<img alt="纳米纤维网的扫描电子显微照片；结构分析、材料研究、显微技术。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /聚苯乙烯/SWCNT 纳米纤维的扫描电子显微镜（SEM）图像。
<img alt="线性I-V特性曲线图，显示电压与电流关系，用于说明电导率。" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图10"> 
图10. 由CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/聚苯乙烯/SWCNT制备的纳米纤维膜的I-V曲线图。

<ol><li>Sannigrahi, B., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Characterization+of+%CE%B1%2C%CF%89-bi%5B2%2C4-dinitrophenyl+%28DNP%29%5D+poly%282-methoxystyrene%29+Functional+Polymers.+Preliminary+Evaluation+of+the+Interaction+of+the+Functional+Polymers+with+RBL+Mast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Macromolecular+Science%2C+Part+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).</li>
<li>Gordon, K., Sannigrahi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Optically+Active+Helical+Poly%282-methoxystyrene%29.+Enhancement+of+HeLa+and+Osteoblast+Cell+Growth+on+Optically+Active+Helical+Poly%282-methoxystyrene%29+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).</li>
<li>Baird, E. J., Holowka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Effective+Poly%28Ethylene+Glycol%29+Architectures+for+Specific+Inhibition+of+Immune+Receptor+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation.</a> Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).</li>
<li>Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamakrisna%2C+S+%22Introductions+to+Electrospinning+and+Nanofibers%22">Introductions to Electrospinning and Nanofibers</a>. , World Sceintific. (2005).</li>
<li>Kameoka, J., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Oriented+Polymeric+Nanofibers+on+Planar+Surfaces+by+Electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning.</a> Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).</li>
<li>Ramakrishna, S., Lala, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Nanofibers+for+Biosensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Polymer Nanofibers for Biosensor Applications.</a> Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).</li>
<li>Reuven, D., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archetypical+Conductive+Polymer+Structure+for+Specific+Interaction+with+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Macromolecular+Science+Part+A%3A+Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins.</a> Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Ogunro, O., Karunwi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+Asymmetry+of+Helical+Polymer+Nanowire%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本报告中，我们介绍了一种制备生物功能化纳米纤维的强有力方法。该纳米纤维被修饰上可特异性结合模型蛋白的功能基团。本文所报道的实验步骤与方法具有普适性，可用于制备携带任意所需功能基团的纳米纤维。阴离子活性聚合是一种强大的技术，可用于合成结构可控的聚合物，并通过共价键连接任意数量的特定功能基团，这些功能基团可针对特定的生物标志物。对于单体2-甲氧基苯乙烯而言，阴离子活性聚合技术已十分成熟。2 静电纺丝是一种多功能技术，通过改变电压以及调节待纺溶液的浓度，可轻松控制纤维的尺寸。5 纳米纤维表现出电阻型I-V特性，因此有望作为生物传感器中的活性元件发挥作用 即 该报道的方法在开发生物标志物检测装置方面具有前景。6,7 
第一种单体2-甲氧基苯乙烯的聚合在40分钟内完成100% 即 100%的单体已转化为聚合物，第二种单体的聚合反应较慢，需要2天才能完成聚合。也就是说，单体一的聚合速度比单体二快。反应结束时不存在未反应的单体一，但在2天结束时仍残留少量未反应的单体二，但这不会影响聚合物的多分...

<table><tbody><tr><td>钠金属</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>282065</td><td></td></tr><tr><td>二苯甲酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239852</td><td></td></tr><tr><td>2-甲氧基苯乙烯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563064</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>178810</td><td></td></tr><tr><td>氯苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>单壁碳纳米管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>704113</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81416</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>硅 Quest 公司&amp;#8217;l</td><td>720200</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss FESEM</td><td>卡尔·蔡司公司</td><td>Ultra 60</td><td></td></tr><tr><td>Bausch 探测站 &amp;amp; Lomb MicroZoom II 高性能显微镜</td><td>博士伦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>徕卡共聚焦扫描系统</td><td>徕卡显微系统</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td>亚飞安远程源表</td><td>吉时利仪器公司</td><td>6430</td><td></td></tr><tr><td>自动量程数字万用表</td><td>Keithley Instruments</td><td>175A</td><td></td></tr><tr><td>注射泵 </td><td>Chemyx 公司</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>蔡司光学显微镜</td><td>卡尔·蔡司公司</td><td>Zeiss/Axiotech</td><td></td></tr></tbody></table>

生物功能纳米纤维的制备方法

Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

静电纺丝是一种用于制备负载功能基团纳米纤维的有效加工方法。负载功能基团的纳米纤维可用于研究材料与生物标志物之间的相互作用 即 可作为生物传感器，在单分子检测方面具有潜在应用价值。我们开发了一种制备功能性聚合物的有效方法，其中功能基团具有特异性结合模型蛋白的能力。在本模型系统中，功能基团为2,4-二硝基苯基（DNP），蛋白为抗DNP IgE（免疫球蛋白E）。该功能性聚合物， &alpha;,&omega;通过阴离子活性聚合制备双[2,4-二硝基苯基己酸][聚（环氧乙烷）-b-聚（2-甲氧基苯乙烯）-b-聚（环氧乙烷）]（CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP）。聚合反应中使用的双功能引发剂是通过电子转移反应制备的 &alpha;甲基苯乙烯和钾（镜面）金属。首先将2-甲氧基苯乙烯单体加入引发剂中，随后加入第二种单体环氧乙烷，最后通过甲醇终止活性聚合物的反应。 &alpha;,&omega;二羟基聚合物[HO-PEO-P2MS-PEO-OH]与N-2,4-二硝基苯肼（N-2,4-DNP-）反应&isin;-氨基己酸，通过DCC偶联反应，生成 &alpha;,&omega;-双[2,4-二硝基苯基己酸][聚（环氧乙烷）-b-聚（2-甲氧基苯乙烯）-b-聚（环氧乙烷）]（CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP）。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对聚合物进行了表征， 1氢核磁共振（H NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）。聚合物的分子量分布较窄（1.1–1.2），本研究中所用聚合物的分子量均大于50,000。这些聚合物呈黄色粉末状，可溶于四氢呋喃。一种水溶性CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/DMEG（二甲氧基乙二醇）复合物能够与溶液中的IgE在数秒内结合并达到稳态结合。较高分子量（不溶于水） 即 约50,000条CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP聚合物，含有1%单壁碳纳米管（SWCNT），在硅基底上加工成电活性纳米纤维（直径100 nm至500 nm）。荧光光谱显示，抗DNP IgE通过与纤维表面修饰的DNP功能基团结合而与纳米纤维发生相互作用。这些结果表明，经过适当功能化的纳米纤维在生物标志物检测器件的开发方面具有应用前景。

本文描述了一种制备具有可特异性结合蛋白质功能基团的纳米纤维的高效方法。该方法首先需要制备带有适当功能基团的聚合物。通过静电纺丝技术将该功能化聚合物加工成纳米纤维。采用共聚焦显微镜研究纳米纤维与蛋白质结合的有效性。

静电纺丝是一种用于制备负载功能基团纳米纤维的有效加工方法。负载功能基团的纳米纤维……

本实验的总体目标是制备带有功能基团的纳米纤维。首先，通过离子聚合反应合成由两种甲氧基苯乙烯和环氧乙烷组成的嵌段共聚物，并利用质子核磁共振波谱对其进行表征。随后，将该功能聚合物与单壁纳米管溶液通过静电纺丝技术制备成复合纳米纤维。然后测定纳米纤维在接触蛋白质IgE EU后其当前的电压行为。最终，将ANI与活性聚合结合并进行电纺丝，可制备出表面修饰有功能基团的纳米纤维，这些功能基团能够与特定蛋白质结合。在此制备生物功能纳米纤维的方法中，活性聚合技术可实现对分子量可控的生物功能聚合物的简便合成。此外，电纺丝技术可制备出带有功能基团的纳米纤维，这些功能基团可特异性地与蛋白质相互作用。该方法可为医学诊断提供有价值的见解，也可应用于其他系统，例如通过将功能化纳米纤维整合到服装、汽车等中，实现对环境中任意目标单分子的监测。聚氰胺的制备需要极为严格的条件。本视频将帮助您掌握聚合物合成及其后续加工成纳米纤维所必需的操作步骤。以二苯甲酮为指示剂，在干燥氮气氛围下，使用金属钠对200毫升四氢呋喃进行脱水处理。另将10毫升2-甲氧基苯乙烯在氢化钙中干燥24小时，用于聚合反应器。为进行此反应，准备一个由异丙醇和液氮组成的浆液，维持在-78摄氏度的低温浴中。组装一个带有标准锥形外接口的100毫升单颈圆底烧瓶。反应过程中使用两个带旋塞的流量控制接头和一根聚四氟乙烯搅拌棒。通入超高纯度氮气，使体系保持惰性。向聚合反应瓶中加入 25 µL THF。然后加入 2 mL 引发剂溶液。接着注入 4 mL 第一种单体，并让反应进行 40 分钟。现在加入一毫升第二种单体，在室温下聚合两天，用6摩尔盐酸和甲醇终止聚合反应。然后将聚合物沉淀至正己烷中，经真空烘箱干燥后，使用核磁共振（NMR）对聚合物进行表征。将偶联试剂加入三口烧瓶中，并在真空线上干燥四小时。然后在氮气保护下，向烧瓶中注入10毫升干燥的二氯甲烷。在室温下搅拌反应混合物12小时。将反应混合物过滤，用正己烷和甲醇各洗涤两次以回收聚合物沉淀，将沉淀的聚合物在40摄氏度的真空烘箱中干燥。最后，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振氢谱（HNMR）测定聚合物的结构和官能团。将20%的官能化聚合物溶解于氯苯中。现在配制两种聚苯乙烯的氯苯溶液。使用较高分子量的聚苯乙烯可改善聚合物的缠结行为，获得静电纺丝所需的最优黏度。将上述聚合物溶液按1:1和1:2的比例混合。然后向混合物中加入1%单壁碳纳米管，搅拌过夜。使用Glassman高压电源、硅片、注射器或化学注射泵以及用于观察过程的灯具组装电纺丝装置。随着过程进行，用一支注射器吸取少量聚合物单壁碳纳米管溶液，并将该注射器安装到注射器支架上。现在将带有高压的夹子连接到注射器针头上。启动高压电源以开始静电纺丝，并将电压表调节至10千伏。然后开始推动注射器的活塞。根据复合材料中聚合物的性质，可能需要更高的电压，尤其是当需要制备直径小于一百纳米的纳米纤维时。取下硅片，并在干燥器中彻底干燥过夜。为了观察纳米纤维的整体形貌，首先使用光学显微镜获取图像。然后利用扫描电子显微镜观察更精细的细节，例如形貌、直径和平均孔径。在原子力显微镜下进一步成像，可观察纳米纤维的三维表面形貌。将带有纳米纤维的一小片硅片放置在 Mat Tech 样品台上。将盖玻片置于孔中。加入10微升荧光标记的抗体，孵育1小时，然后用P-B-S-B-S-A溶液洗涤三次：将溶液轻轻加到MatTek培养皿的壁上，用手轻轻旋转培养皿，再用移液器吸除缓冲液，以观察IgE的结合情况。通过共聚焦显微镜观察纤维。用于测定纳米纤维初始电流-电压特性的典型探针台由ABOs和低倍显微镜、用于微位移器的真空卡盘台、用于电压测量的万用表以及用于向纤维输入低电流的源表组成。首先，将两个微位移器连接至极低电流源，并将微位移器的探针臂安装在纤维膜的相对两侧，使探针尖端接触纤维。然后，将另外两个微位移器连接至数字万用表。将探针臂安装在另外两个之间，并将探针尖端放置在纤维垫上。确保四个探针尖端尽可能共线。输入不同大小的电流，通常在纳安培范围内。现在，针对每一个输出电流的大小，测量外侧尖端之间的电压降。接着绘制电流-电压曲线，并确定由该纤维膜所表征的器件类型。在本方法中，DNP 的功能聚合物通过离子型活性聚合反应制备。聚合中所用的 D 型功能引发剂通过电子转移反应制备。该过程中，先将一种甲氧基苯乙烯单体加入引发剂中，随后加入第二种单体环氧乙烷。最后，通过甲醇终止活性聚合物链的反应。通过FTIR和NMR光谱确认了功能聚合物的结构。FTIR显示oh宽吸收峰完全消失，表明CDNP基团实现了定量功能化。NMR谱图中峰的积分结果表明，聚合物已实现定量功能化。然后通过DCC偶联对聚合物进行功能化，以在该导电纳米纤维膜中引入功能性DNP基团，并通过荧光方法验证静电纺丝DNP聚合物对IgE抗体的特异性结合。通常可利用原子力显微镜下的纳米纤维图像测量纳米纤维的尺寸。扫描电镜（SEM）图像表明，这些纤维呈线性且带有珠状结构。总体目标是制备出近乎线性的纤维。当抗原结合到纳米纤维上时，纳米纤维膜的电流-电压曲线表现出类似电阻器的欧姆行为。电阻的变化表明，这些功能化纤维有望作为单分子检测传感器中的活性组分。 使用四氢呋喃、二氯甲烷、氯苯和二甲基亚砜等溶剂可能具有极高危险性，因此务必采取适当的防护措施。该方法可在五天内完成，包括聚合物的合成与表征，以及非纤维材料的制备与表征。在进行该实验操作时，重要的是要记住，丙烯酰胺聚合对产物中的杂质非常敏感。希望您喜欢本视频，并祝您的实验顺利成功。

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