可视化和遗传操作在小鼠大脑皮层和使用海马树突和棘在子宫内电穿孔
2012年7月26日
本文详细介绍了协议，在宫内electroporate大脑皮层和海马小鼠E14.5。我们还表明，这是一个有价值的方法来研究在这两个脑区的树突和刺。
该程序的目的是在子宫内使用电穿孔，以可视化和遗传作小鼠大脑皮层和海马体中的树突和棘。这是通过首先将所需的质粒、DNA 溶液注射到子宫内胚胎的侧脑室来实现的。接下来，使用 Palo 电极的不同位置。
根据 DNA 注射，大脑皮层或海马体被电穿孔，然后是所需的出生后或成人阶段。给小鼠灌注并收集大脑。最后，用振动器对大脑进行切片。
最终，可以使用共聚焦显微镜观察树突和棘。与研究非右侧和脊柱的方法相比，单一电穿孔技术具有几个优点。事实上，这种技术允许首先直接在体内研究这方面。
此外，与在电作中产生敲除小鼠相比，这是一种快速的方法，可以研究基因抑制或基因表达以及 don white 和 spine 的影响，不仅在特定的细胞结构中，而且在特定的发育 pon 上。在电间作中使用诱导系统也是识别参与 don write 和脊柱发育的基因之间功能相互作用的有用工具。事实上，例如，与病毒相比，我们很难在同一细胞群中混合多个 HNA 或多吨基因。开始在水中将 DNA 稀释至所需浓度，并添加快速绿色染料至最终浓度为 0.05%使用微型拉拔器拉动玻璃针进行注射。
将怀孕的小鼠置于使用 isof 氟的麻醉诱导室中，并以每分钟 2 升的速度打开氧气。当动物失去书写反射时，将其转移到术前面罩上。在每只眼睛上滴一滴 IGEL，然后用电动剃须刀剃掉腹部的毛发。
用洗必泰清洁剃须区域一次，以收集飞扬的头发。将动物转移到手术区域的第二个面罩上，背靠加热垫。当花瓣反射消失时开始手术。
戴上口罩和无菌手套，并用无菌窗帘盖住动物。用洗必泰清洁剃光区域至少三次。用手术刀沿着中线穿过皮肤做一个垂直切口。
使用剪刀。沿线性肘部在腹部肌肉上做一个类似的切口。选择最容易获得的胚胎。
将环形镊子放在两个胚胎之间，小心地将胚胎链从腹腔中拉出。从这一点开始，用无菌预热 PBS 保持胚胎水分。使用环形镊子。
轻轻纵胚胎在羊膜袋内的位置，并稳定环之间的头部。轻轻挤压，将胚胎向上推至更靠近子宫壁的位置。用另一只手拿起毛细血管支架，小心地将针头插入半球中部，以瞄准侧脑室。
注意尽量减少针头在子宫壁表面的移动，并避免刺穿血管，踩下踏板注入约 0.5 微升绿色 DNA 溶液。将电极放在胚胎头部的两侧，正踏板与注射的心室位于同一侧进行皮层电穿孔，或在注射脑室的另一侧进行海马电穿孔。然后以 1 秒的间隔施加 5 个 30 伏特的电脉冲，持续时间为 50 毫秒。
避免在胎盘上施加电流，因为这会导致胚胎死亡 为了增加存活率，在 PBS（腹腔）完成注射和电作后，在 30 分钟内对所有胚胎进行注射和电作，并使用环形镊子将子宫角更换到其原始位置。使用 vicryl 可吸收缝合线闭合腹部、壁和皮肤。将动物放入回收室中，直到它醒来。
然后在手术后 24 小时和 48 小时将其转移到加热垫上的笼子中。检查小鼠的行为以评估疼痛、痛苦或痛苦，并称量动物以分析大脑。在出生后阶段，使用振动器对先前的灌注进行切片，并将大脑后固定到水绿色聚合物支架中，以对树突和刺进行成像。
该图显示了大脑皮层、海马体的 ca 1 和齿状回中电穿孔细胞的示例，而类型小鼠在 E 14.5 处电穿孔，其中 GFP 构建体和大脑在出生后第 14 天收获。通过注射少量 DNA 溶液，标记一些细胞，从而可以在更高放大倍率下可视化分离的 GFP 阳性细胞及其刺的树突状树枝化。在尝试此程序时，重要的是要记住注射少量 DNA，以便仅针对少数细胞，并能够可视化和量化脊柱或电神经中的不写入。
概述
本文详细介绍了在E14.5时对小鼠大脑皮层和海马体进行体内电穿孔的协议。这种方法对于研究这些脑区的树突和脊突非常有价值。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 基因操纵
背景
- 电穿孔可以实现神经元的可视化和基因操纵。
- 该技术在胚胎发育过程中针对特定的脑区。
- 它比传统的敲除小鼠模型具有优势。
- 体内研究可以揭示影响树突和脊突发育的基因相互作用。
研究目的
- 可视化和操纵小鼠大脑中的树突和脊突。
- 评估基因表达和抑制的影响。
- 开发一种研究神经元结构的快速方法。
使用的方法
- 将质粒DNA注射到胚胎的侧脑室中。
- 使用电极进行电穿孔以输送电脉冲。
- 出生后评估大脑结构和功能。
- 使用共聚焦显微镜可视化树突和脊突。
主要结果
- 成功地对大脑皮层和海马进行了电穿孔。
- 在GFP阳性细胞中可视化树突分支和脊突。
- 展示了该技术在体内研究中的有效性。
- 识别了参与神经元发育的基因相互作用。
结论
- 体内电穿孔是研究神经元结构的强大工具。
- 该方法允许在特定脑区进行靶向的基因操纵。
- 它为传统的基因修改技术提供了一种快速的替代方案。
常见问题
Executive Industry Relevance
In utero electroporation (IUE) enables rapid, in vivo genetic manipulation and visualization of neuronal structures in the developing mouse brain, directly addressing the need for physiologically relevant models in early CNS drug discovery. This approach supports mechanistic de-risking and target validation by allowing precise temporal and spatial gene modulation in the cerebral cortex and hippocampus. IUE's flexibility accelerates hypothesis testing and portfolio triage for neurodevelopmental and synaptic function targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in neuronal development within native tissue environments.
- Supports functional target validation by permitting gain- and loss-of-function studies in specific brain regions and developmental windows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing combinatorial gene manipulation in vivo.
- Accelerates predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares physiologically relevant neuronal systems for downstream phenotypic screening and quantitative imaging.
- Enables reproducible labeling of sparse neuronal populations for high-resolution dendrite and spine analysis.
- Supports assay standardization by providing consistent genetic delivery and expression in targeted brain regions.
- Improves screening readiness for compounds affecting synaptic structure or function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuronal architecture and gene expression patterns.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting inducible gene modulation at defined developmental stages.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of dendritic and synaptic integrity.
- Reduces risk of late-stage attrition by modeling gene function in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
IUE integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging in vitro findings with in vivo validation for CNS targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for genes regulating dendrite and spine development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of genetic or pharmacological interventions.
- Analytics: Enables high-content measurement of dendritic arborization and spine density in genetically defined neuronal populations.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical models with human disease mechanisms by enabling precise temporal gene modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for rapid evaluation of multiple gene targets or combinations in the same experimental system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Offers rapid, scalable, and standardized genetic manipulation compared to traditional knockout models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early in vivo functional assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs based on robust in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, genetic construct design, and confocal imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for microinjection, electroporation, and high-resolution microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of DNA delivery, electroporation parameters, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or developmental stages.
- Limited to accessible brain regions and developmental windows as supported by the protocol.
