细胞迁移的的Phagokinetic轨道运动MLCK的定量评价

该程序的总体目标是能够使用基于金纳米颗粒的细胞运动测定法定量测量细胞运动随时间的变化。这是通过首先为金纳米颗粒涂层准备玻璃盖玻片来实现的。具体来说，无内毒素的盖玻片涂有明胶，然后烘烤。

第二步是还原氯尿酸，氯尿酸会产生金纳米颗粒，并将溶液均匀地涂在明胶涂层的盖玻片上。接下来，将细胞放置在金纳米颗粒涂层盖玻片上，以达到实验细胞的所需时间范围。继续前进，明胶将取代金纳米颗粒，形成足迹。

最后一步是使用显微镜监测和定量细胞运动，以对移动细胞产生的轨迹进行成像。最终，使用免费提供的软件对轨道进行面积测量。与现有方法（例如延时成像）相比，该技术的主要优点之一是该测定只需要标准光学显微镜、标准相机，并使用免费提供的成像软件。

此外，该分析还允许使用能够进行高通量筛选的 Methodist 轻松分析和比较多个样品。虽然这种方法可以深入了解不同生理因素和细胞运动的影响，但它也可以应用于其他系统，例如研究病原体对受感染细胞运动的影响。一般来说，刚接触这种方法的人可能会很困难，因为这些方法要求人们严格遵循方案中指示的体积和温度。

在该协议中，重点是评估沉淀的金纳米颗粒的最终溶液的颜色以确保成功。这种方法的视觉演示至关重要。由于 FGO 动力学轨迹运动测定步骤很难学习。

它们包含细胞和分子生物学实验室中不常用的几种程序。为了制备明胶涂层的盖玻片，首先 Resus 悬浮明胶和去离子水，制成最终浓度为每 300 毫升 0.5 克的溶液，然后将混合物高压灭菌 15 至 30 分钟。在组织培养罩中加入明胶后两小时内完成此作非常重要。

首先将 8 到 9 个酸洗的盖玻片转移到 100 毫米的塑料皿中，准备盖玻片进行涂层。确保盖玻片没有相互接触或没有接触培养皿的侧面。小心地将两到三滴明胶移液到每个盖玻片上，避免溢出到板上。

然后将装有明胶涂层盖玻片的盘子放入烤箱中，在 90 摄氏度下烘烤 10 分钟。10 分钟后，将培养皿从烤箱中取出，放回纸巾中。文化罩。

轻轻吸出多余的明胶。将盘子放回烤箱，将盖玻片在 70 摄氏度下干燥 45 分钟。盖玻片干燥后，从烤箱中取出培养皿并将其放回组织培养罩中。

小心地使用无菌针头，提起盖玻片的一侧。然后使用无菌镊子从培养皿中取出涂有明胶的盖玻片，并将它们放入 24 孔板的单独孔中。下一步是准备胶体镀金盖玻片。

首先在组织培养罩中制备 10 毫升 0.5% 柠檬酸钠溶液，将 1.5 毫升 14.5 毫摩尔氯 ORIC 酸溶液和 13.5 毫升高压灭菌去离子水混合在无菌无内毒素锥形瓶中对于每 8 到 9 个盖玻片，结果应产生淡黄色溶液。氯 ORIC 酸有毒，应小心处理。它对光也很敏感，因此煮沸步骤应在弱光设置下进行。

当溶液达到沸点时，从热板中取出烧瓶并将其转移到搅拌板上。为了在溶液中形成胶体金颗粒，在搅拌的同时，每 15 毫升氯 ORIC 酸溶液中加入 0.7 毫升 0.5% 柠檬酸钠溶液，继续搅拌约两分钟。在此期间，溶液将从淡黄色变为透明到灰色变为紫色变为深紫色。

在最终变成红葡萄酒或最好是铁锈色之前，在 10 毫升移液器中吸取胶体金溶液，让溶液在移液器中冷却一到两分钟，直到达到室温。然后在 24 孔板中涂有明胶的盖玻片上加入 0.5 至 1 毫升：将含有胶体金盖玻片的 24 孔板放入 37 摄氏度的培养箱中，孵育 30 分钟。在颗粒有时间沉淀到涂有明胶的盖玻片上后，在光学显微镜下检查它们的密度。

金纳米颗粒的适当分布有助于轻松有效地区分太阳能卡车的边缘。最佳密度随细胞大小而变化。金颗粒浓度过高会阻碍细胞移动的能力，而金、金颗粒浓度过低会限制描绘准确运动轨迹的能力。

因此，在单个实验中，只能使用同一批次制备的或具有相同密度的盖玻片。如果金颗粒的浓度不足，则向涂有明胶的盖玻片中额外加入 0.5 至 1 毫升的胶体金溶液。但是，如果金颗粒的浓度过高，例如此处显示的情况，则唯一有效的选择是重新制备胶体金溶液并涂覆新的盖玻片。

如果颗粒密度正确，将板放回 37 摄氏度的培养箱中，孵育 1 小时，将盖玻片浸入无菌磷酸盐缓冲盐水中 3 次，冲洗掉未结合的金颗粒。然后将胶体镀金盖玻片储存在干净的 12 孔板的 PBS 填充孔中，在 4 摄氏度下，直到它们准备好使用。盖玻片不应晾干，并应在制作之日起两到三个月内使用。

下一步是准备用于细胞培养的胶体镀金盖玻片。首先将它们放入 24 孔板的各个孔中，在添加盖玻片之前，该孔板已添加约 0.3 毫升培养基，将大约 5， 000 至 50， 000 个细胞转移到每个胶体镀金盖玻片上。像元数量因像元类型而异，但像元密度必须足够低，以防止同一区域中多个像元的像元轨迹重叠。

盖上板，将其放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中 6 至 24 小时根据细胞类型的运动性，应在孵育后通过实验确定每种细胞类型的最佳时间框架，首先在 PBS 中浸入两次，然后在室温下在 3% 对甲醛中孵育 15 分钟，使用由单个移动单元在未固定或固定的盖玻片上创建的轨迹的光捕获图像。用于拍摄蜂窝轨迹照片的放大倍率因细胞类型而异。但是，每项研究必须使用相同的放大倍数，以便能够比较结果。

对于单核细胞，使用免费提供的软件（如图像、JNIH 图像或图像工具）进行 40 倍放大效果很好，确定每个样品的胶体金平均面积被 10 到 20 个或更多细胞清除，从捕获的图像中显示的是胶体金颗粒的清除路径，由单个未刺激的单核细胞用 40 倍物镜拍摄。非运动细胞在自身周围形成特征性的小椭圆形或圆形轨迹，这表明附印管的运动水平较低。相比之下，高度运动的细胞的特征是方向运动，如细长的束和更大的整体区域，因为它们的形状不规则。

最好使用 Image J 软件中的手绘工具来概述其体积，从而对细胞轨迹进行分析。然后可以使用 Image J 分析菜单中的测量工具进行定量面积测量，在尝试此过程时，重要的是要记住严格遵循协议中指示的体积和温度，因为偏差会强烈影响最终结果。观看此视频后，您应该对如何创建明胶涂层盖玻片、如何制备金纳米颗粒和金纳米颗粒涂层盖玻片以及如何使用光学显微镜监测和定量评估细胞运动有很好的了解。

不要忘记，在热板上处理沸腾溶液，尤其是来自氟、AIC 酸和柠檬酸钠沸腾溶液的蒸气可能是危险的预防措施，例如在通风橱中工作，并在执行此程序时应始终遵循常识。