Name: BLT人性化的鼠标使用一个基于干细胞的基因治疗肿瘤模型的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 了解利用造血干细胞基因疗法建立人源化小鼠肿瘤模型的方法。通过将人胸腺组织与转导细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，重建人类免疫系统以研究抗肿瘤免疫反应。

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我们感谢 Alvin Welch 和 Larry Pang 提供的技术支持。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 P50 CA086306、加州再生医学研究所（CIRM）资助项目 RC1-00149-1 和 RS1-00203-1、CIRM 新教员奖 RN2-00902-1、加州理工学院-加州大学洛杉矶分校转化医学联合中心、加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心（CFAR）NIH/NIAID AI028697、加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所、CIRM 工具与技术奖 RT1-01126，以及加州抗病毒药物发现中心多校区研究计划与倡议（编号 MRPI-143226）资助。

A. BLT 小鼠的制备
BLT小鼠的制备分为三个部分：（1）胎儿组织处理及人CD34+造血干细胞的制备，（2）人组织移植，（3）二次移植。对于所有实验方案，我们提供了包含试剂信息的表1。
1. 组织处理与人CD34造血干细胞的分离
可使用新鲜的胎儿组织，或从各器官获取机构通过冰上连夜运输送达的组织。胎儿组织通常并非无菌，这一点可通过每毫升周围培养基在血琼脂上产生1000个细菌菌落得到证实。我们常规使用40 ml无菌PBS对组织进行两次洗涤。尽管该步骤无法完全去除所有细菌，但可决定移植实验系列的成功与否，避免大多数受体小鼠因细菌感染而死亡。作为额外步骤，为进一步消毒组织，我们将细胞悬液在含有抗生素的培养基中进行培养。
1.1 胎儿胸腺组织的处理
<ol>
	<li>用手术刀防止组织滑入漂白液中，将培养基倒入盛有漂白液的烧杯中以清洗胸腺。用 PBS 注满离心管，盖紧后反复倒置数次以洗涤胸腺组织。将上清液倾倒至漂白液中，重复此步骤。</li>
	<li>将胸腺组织置于60 mm培养皿中，加入8 ml RPMI + 10% 胎牛血清，用两把手术刀将其剪切成1.5至2 mm大小的组织块。使用手术刀剪切可最大程度减少组织碎片的撕裂和损伤。受损组织容易肿胀、发黏，难以吸入移植针头中。所获得的组织块数量是可移植小鼠数量的第一个上限。</li>
	<li>用25 ml移液管（以尽量减少组织损伤）将悬浮的组织块转移至T25培养瓶中。向培养瓶中加入70 μl哌拉西林他唑巴坦（Zosyn），并在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。此步骤可显著减少细菌污染。如需进行组织分型或其他表型分析，可取出1 ml细胞样本。</li>
</ol>
1.2 胎肝组织的处理
<ol>
	<li>按照步骤 1.1.1 洗涤肝脏。</li>
	<li>加入 10 ml Iscove 培养基，将内容物倾倒至一个 100 mm 培养皿中。</li>
	<li>使用两把手术刀将肝脏切成小块（约 3 mm）。若遇到白色结缔组织，将肝脏组织从其中刮下，并将结缔组织丢弃至含漂白剂的容器中。</li>
	<li>用装有 16 号钝头针头的 12 ml 注射器反复抽吸组织 3 至 4 次，以实现组织匀浆化，然后转移至 50 ml 离心管中。</li>
	<li>按如下方法配制组织消化用酶：在 50 ml 离心管中加入 10 ml Iscove 培养基，再分别加入 200 μl 的 IV 型胶原酶（1 mg/ml）、透明质酸酶（1 mg/ml）和 DNase I（2 U/ml）。</li>
	<li>将酶液吸入 12 ml 注射器，并安装 0.22 μm 滤器。将酶液/培养基直接过滤至细胞悬液中。</li>
	<li>盖紧管盖，并用 Parafilm 封口。在 37 °C 条件下旋转孵育 90 分钟。</li>
	<li>在 50 ml 离心管上安装 100 μm 细胞滤筛。用移液器将消化后的细胞悬液通过滤筛过滤。</li>
	<li>加入 PBS 至细胞悬液中，使总体积达到 50 ml。将悬液均分为两个 25 ml 的离心管。</li>
	<li>在每管细胞悬液下层铺加 10 ml Ficoll。以 2,400 rpm 离心 20 分钟，不启用刹车。</li>
	<li>界面层应较厚。用 5 ml 移液器小心吸取界面层，并转移至另一离心管中。此时应得到两管界面层细胞。每管加入 50 ml PBS，以 1,200 rpm 离心 10 分钟。</li>
	<li>将沉淀合并至同一离心管中，并用含 2% FCS 的 PBS 再洗涤三次。</li>
	<li>最后将细胞重悬于 50 ml RPMI + 10% FCS 中，用台盼蓝计数细胞。根据组织大小不同，可获得 108 至 109 个总肝细胞。</li>
	<li>将细胞转移至 T150 培养瓶中，加入 30 ml RPMI + 10% FCS 和 0.8 ml piptazo。</li>
	<li>在 37 °C 条件下孵育 1 至 1.5 小时，以去除贴壁细胞。</li>
</ol>
1.3 CD34 造血干细胞的分选与转导
<ol>
	<li>在步骤 1.2.15 细胞贴壁后，轻轻前后摇晃培养瓶约一分钟，以去除未贴壁的松散细胞。此时会有大量成纤维细胞等附着在表面。</li>
	<li>使用 1 比 20 的稀释比例再次计数，并记录细胞总数。保留零点几毫升用于后续染色。此时细胞数量应比初始细胞计数（步骤 1.2.13）减少约 30%。</li>
	<li>用 40 ml MACS 缓冲液离心并洗涤两次。</li>
	<li>CD34 细胞使用 Miltenyi Biotech 的 CD34 Direct Kit 进行分选。我们严格按照该公司提供的 LS 柱说明书操作。</li>
	<li>回收的细胞体积为 5 ml。进行计数并计算总细胞数。CD34+ 细胞的得率应为总细胞数的 3–5%。该得率随胎肝组织来源的胎龄而变化，较年轻的胎肝通常可获得更高的 CD34+ 细胞得率。</li>
	<li>将细胞总数除以 1×106。此数值即为可移植小鼠数量的第二个上限值。</li>
	<li>对 CD34- 组分（流穿液及洗涤液）进行计数，并为每只待移植小鼠保留 6×106 个细胞。将这些细胞在 50 至 80 ml RPMI + 10% 胎牛血清 + 1% piptazo 培养基中过夜培养。</li>
	<li>使用慢病毒载体对 CD34+ 细胞进行过夜转导。我们采用 Takara 公司的 retronectin，并严格按照其说明书操作。</li>
	<li>次日，收集 CD34- 细胞和转导后的 CD34+ 细胞，并进行计数。</li>
	<li>将 CD34+ 细胞均分为两部分：A 部分和 B 部分。</li>
	<li>离心沉淀 A 部分转导后的 CD34+ 细胞，重悬于 4 至 6 ml 冻存液（RPMI + 10% FCS + 10% DMSO，经 0.22 μm 滤器无菌过滤）中。每 1 ml 分装至冻存管，标记为“huFetalCD34”、管内细胞数量、日期及您的姓名首字母。</li>
	<li>每只小鼠所需细胞混合液：将 0.5×106 个 B 部分转导后的 CD34+ 细胞与 4.5×106 个 CD34- 细胞加入无菌螺口微量离心管中，离心成团后置于冰上。同时将一管 Matrigel（BD Biosciences）置于冰上解冻。所有管材在使用前必须始终保持在冰上（进入步骤 2.10）。</li>
</ol>
2. 组织移植
该步骤的目的是将人胎儿胸腺/肝脏类器官移植到NSG小鼠的肾包膜下。此类器官能够更好地模拟人类T细胞的选择和成熟过程，因为人造血干细胞将利用人胸腺而非小鼠胸腺作为其分化为不同T细胞及其他淋巴细胞谱系的场所。在移植过程中使用CD34-细胞的目的是重建胎儿肝脏间质，从而促进移植物更有效地移植和生长。所用NSG小鼠的年龄为6-8周龄。
<ol>
	<li>手术用药的准备：
	<ol class="lalpha">
		<li>异氟烷：将一块2英寸的纱布卷起，塞入一个15 ml带螺帽的离心管中。直接从瓶中倒入约1 ml异氟烷。</li>
		<li>氯胺酮/赛拉嗪：取0.52 ml氯胺酮（Ketaset，100 mg/ml）和0.52 ml赛拉嗪（Anased，100 mg/ml），加入20 ml注射用生理盐水中。根据最早过期的成分标注有效期，并在-20 °C冷冻保存，直至使用时取出。</li>
		<li>卡洛芬（Rimadyl）：在手术前现用现稀释。用1 ml注射器配25G针头，从原瓶中抽取0.1或0.2 ml，按1:100比例稀释于10或20 ml注射用生理盐水中。标记并注明日期，仅可在冰箱中保存一天。用3 ml注射器配25G针头分装备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备手术台。铺上无菌蓝色垫巾，并为每位外科医生准备一块无菌毛巾。每位外科医生从其灭菌器械盒中取出以下器械：4英寸剪刀、弯头钝头镊、尖嘴镊、止血钳、16G钝头套管针和伤口夹施加器。此外，还需准备带弯针的Vicryl缝线、一叠异丙醇擦拭包、一个盛有PBS的35 mm培养皿，以及一支装有PBS的1 ml注射器。</li>
	<li>在手术台中央放置一个玻璃Coplin染色缸，内盛2 cm深的聚维酮碘溶液和2根棉签。将胸腺组织碎块倒入一个60 mm培养皿中。</li>
	<li>麻醉操作在另一张独立的手术台或通风橱内进行，台面覆盖无菌蓝色垫巾。设置两个小型支架，并配备电子天平和烧杯用于盛放小鼠。一个支架用于放置装有氯胺酮/赛拉嗪的0.5 ml × 28G胰岛素注射器，另一个用于放置装有卡洛芬的3 ml注射器。同时将生物危害废物容器移至附近，用于收集剃下的毛发。</li>
	<li>称量所有小鼠（6–8周龄）的体重，计算平均体重，并按15 μl/g剂量配制氯胺酮/赛拉嗪注射液。对笼内所有小鼠进行注射。</li>
	<li>待小鼠行动迟缓后，使用Oster剃毛器配40号刀头，剃除其左侧从肩部至髋部、沿背部中线至腹部之间的毛发。记录每只小鼠体重，并通过耳标打孔编号。</li>
	<li>在肩部皮下注射0.3 ml卡洛芬。</li>
	<li>通过轻捏小鼠足掌检查麻醉深度。若小鼠出现缩足反应，从离心管中给予约12秒异氟烷气体，再重复测试足掌反应。持续给予短时间异氟烷，直至足掌反射消失。将小鼠置于右侧卧位，头朝左。</li>
	<li>使用尖端磨圆的16G癌症植入针插入组织。先将套管针在PBS培养皿中冲洗数次，水平持握，使推杆末端刚好位于针尖内。用尖嘴镊夹取一块胸腺组织，吸入针管内。</li>
	<li>助手使用Eppendorf正向置换移液器，向一份细胞悬液（步骤1.3.12）中加入5 μl冷Matrigel，并轻轻搅动混合。外科医生水平持握套管针，缓慢回拉推杆，助手则将Matrigel混合物移入套管针内。该混合物在室温下会迅速凝胶化。</li>
	<li>用聚维酮碘棉签擦拭裸露皮肤，随后用异丙醇擦拭包擦净，重复一次。</li>
	<li>在皮下定位脾脏，其为颜色最深的区域。小鼠肾脏位于脾脏背侧约5 mm处，透过剃毛后的皮肤可见。</li>
	<li>用钝头镊提起该区域皮肤，沿脾脏方向做一条长约15 mm的平行切口。在下方腹膜肌层做相似切口。雄性小鼠的肾脏应可直接看到，只需轻压腹部即可使其突出。雌性小鼠则需用止血钳夹住卵巢并牵拉，以带出肾脏，有助于保持肾脏体外暴露。对于雄性小鼠，需用左手持续轻压腹部以维持肾脏外露。</li>
	<li>在肾脏被膜后端撕开一个小孔，可能会有少量出血。</li>
	<li>将套管针由此小孔滑入，并沿肾脏推进，直至针口完全被肾脏被膜覆盖。然后用右手小指推动推杆，注入组织。</li>
	<li>用闭合的止血钳轻柔地将肾脏推回原位。在腹膜层缝合一针，并打双结固定。将皮肤提起呈 purse-string 状，施加两个伤口夹。</li>
	<li>在每只小鼠眼睛上滴一滴PBS，将其侧卧于笼内垫料上。确保所有小鼠均恢复至俯卧位后方可离开。</li>
	<li>次日，为每只小鼠再次注射一次卡洛芬。</li>
</ol>
3. 二次移植
在BLT小鼠制备过程中，此步骤的目的是利用人源造血干细胞重建小鼠骨髓。步骤（2）中移植的组织块不足以支持小鼠体内人免疫系统的完全重建。在二次移植过程中，我们对小鼠进行亚致死剂量照射，以清除其骨髓中的小鼠源性骨髓细胞，从而为人源CD34+细胞的植入创造“空间”。
<ol>
	<li>移植后四周至六周，用 2.7 Gy 照射小鼠。同一天向小鼠注射 A 部分 CD34+ 转导细胞。该时间框架基于步骤 2 中移植的 thy/liv 植片的建立与生长情况。通常在此期间，植片已显著生长，允许我们进入下一步操作。</li>
	<li>解冻 A 部分 CD34+ 转导细胞，洗涤后重悬于培养基中，浓度为 5×106/ml。</li>
	<li>用 28G 胰岛素注射器每支装入 0.1 ml 细胞悬液（每只小鼠注射 105 至 5×105 个细胞），每笼小鼠（每笼最多 5 只）准备 0.5 ml，将注射器置于支架上，针头朝外放置。</li>
	<li>使用异氟烷吸入麻醉管对小鼠进行麻醉：抓住小鼠颈背部皮肤，将其鼻部置于麻醉管中约 20 秒，计数以控制时间。</li>
	<li>然后将小鼠头部朝右，用左手拇指和食指拉紧其颈部皮肤，用中指按压其下颌下方，使右眼突出。持注射器与小鼠头部长轴平行，将针头从眼球后方插入，并轻轻推进直至遇到阻力。不要继续施压，约 2 秒内完成注射。</li>
	<li>两至三个月后，使用 EDTA 涂层玻璃毛细管经眶后静脉采血。每只小鼠每月最多采集 200 μl 血液。50–100 μl 血液足以用于流式细胞术（FACS）分析。其他采血方法包括面部静脉采血和尾静脉采血，后者获得的血量极少，可能不足以支持多项检测。</li>
	<li>对血液样本进行染色，检测人淋巴细胞标志物 CD45 的表达，以评估重建情况。将血液样本加入 1 ml 红细胞裂解缓冲液（160 mM NH4Cl，100 mM KHCO3，0.01 mM EDTA）中，室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>用裂解缓冲液洗涤细胞，1,200 rpm 离心 5 分钟，必要时重复一次。</li>
	<li>参照步骤 3.8 离心细胞，并用含 3% 胎牛血清的 PBS（FACS-PBS）洗涤。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 100 μl FACS-PBS 中。</li>
	<li>加入抗体以评估人淋巴细胞重建情况。我们通常包括以下抗体：CD45（人淋巴细胞标志物）、CD8、CD4、CD14 和 CD16（用于巨噬细胞和单核细胞）、CD19（用于 B 细胞）以及 CD56（用于 NK 细胞）。</li>
	<li>4 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>参照步骤 3.9 洗涤细胞，重悬于 2% 多聚甲醛中，用于流式细胞术分析。</li>
	<li>若小鼠已成功重建，即可进行肿瘤细胞注射。人淋巴细胞重建水平存在差异，占总血细胞比例从低于 1% 至 40% 不等。各淋巴细胞亚群的比例与健康人外周血供体的预期水平相似。但非 T 细胞谱系的数量可能出现波动。若在 12 周内重建水平不理想，可重复步骤 3.1 的二次移植操作。</li>
	<li>肿瘤细胞系按照生产商或实验室推荐条件进行培养。收集细胞，洗涤后以 1:1 比例重悬于 Matrigel 中（50 μl 细胞悬液 + 50 μl Matrigel）。样品全程保持在冰上。</li>
	<li>对小鼠注射部位进行麻醉和剃毛处理，使用异丙醇棉片消毒。助手将细胞悬液装入预冷的 23G 1 ml 注射器中，皮下注射肿瘤细胞。注射部位涂抹抗生素软膏。肿瘤通常在 4 周内建立并开始生长。</li>
</ol>
B. 体内 正电子发射断层扫描（PET）
在我们的研究中，通过检测葡萄糖摄取（[18F]-氟代脱氧葡萄糖（[18F]FDG）来评估肿瘤代谢活性，因此小鼠在成像前需禁食4-6小时。MicroPET/CT扫描使用microPET Inveon扫描仪（Siemens Preclinical Solutions）和MicroCATII CT扫描仪（Siemens Preclinical Solutions）进行。图像分析采用OsiriX（Pixmeo，瑞士）软件完成。本方法的目标是测量肿瘤的代谢活性，并最终利用PET成像替代传统的物理测量方法来评估肿瘤退缩情况。如图2所示，我们发现某些肿瘤根据其外观和大小判断似乎未被靶向作用，但活体PET成像却显示出广泛的组织坏死。该方法可作为评估肿瘤退缩更为敏感且准确的指标。
<ol>
	<li>指定一个腔室用于小鼠麻醉（2% 异氟烷），另一个腔室作为 PET 扫描前 60 分钟氟代脱氧葡萄糖（FDG）摄取的“等待腔室”。在两个腔室内均放置蓝色垫料。</li>
	<li>由于动物需长时间处于麻醉状态，应通过使用在微波炉中加热的注水手套，并将鼠笼置于加热垫上，使小鼠保持 30 °C 的体温。</li>
	<li>打开该腔室的异氟烷气流。在放入小鼠前，让异氟烷充满麻醉腔室约 5–10 分钟。确保腔室盖子锁紧并密闭，以防异氟烷泄漏。</li>
	<li>将第一只小鼠放入麻醉腔室，并紧紧锁上盖子。等待 5–10 分钟，直至小鼠失去意识。</li>
	<li>将小鼠从麻醉腔室中取出，标记其尾部（每笼使用不同颜色），并通过腹腔注射给予 [18F]FDG（80 μCi）。记录注射时间。自该时间点起 50 分钟后，小鼠将再次被麻醉，预留 10 分钟用于 PET 扫描前的准备工作（确保 PET 扫描前 [18F]FDG 摄取总时长为 60 分钟）。</li>
	<li>将注射后的小鼠放入等待腔室，使其在 PET 扫描前进行 1 小时的 [18F]FDG 摄取。不要锁紧盖子，应保持盖子松动以保证空气流通。</li>
	<li>立即将下一只待注射 FDG 的小鼠放入麻醉腔室。后续小鼠的注射间隔应为 10 分钟，因为每次 PET 扫描过程耗时 10 分钟。当前一只小鼠完成扫描后，下一只待扫描小鼠的 60 分钟 FDG 摄取期恰好结束，两者间隔正好为 10 分钟。</li>
	<li>按照步骤 7 至 9 所述，持续对小鼠进行麻醉和注射。</li>
	<li>在第一只小鼠注射后 50 分钟，再次将该小鼠放入麻醉腔室（同时继续对其他小鼠进行麻醉和注射）。</li>
	<li>将小鼠床连接至氧气和异氟烷管路，并打开床体的异氟烷气流。在床面上放置蓝色垫料。</li>
	<li>将准备进行 PET 扫描的小鼠放置于床体上，伸展其四肢并用胶带固定该姿势。在眼睛表面涂抹润滑剂。此步骤最为关键，因动物体位可能直接影响成像质量。</li>
	<li>断开异氟烷和氧气管路，迅速将床体安装至 PET 扫描仪上。重新连接异氟烷和氧气管路。确保 PET 扫描期间异氟烷气流保持开启。连接 PET 扫描电缆并开始扫描。</li>
	<li>PET 扫描完成后，将动物转移至 CT 扫描仪进行扫描。扫描结束后，将动物放回相应的鼠笼中。</li>
</ol>

<ol><li>McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCID-hu+mouse%3A+murine+model+for+the+analysis+of+human+hematolymphoid+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function.</a> Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).</li>
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<li>Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+pre-exposure+prophylaxis+prevents+vaginal+transmission+of+HIV-1+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice.</a> PLoS Med. 5 (1), e16(2008).</li>
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<li>Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
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<li>Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+from+antigen-specific+CD8+T+cells+generated+in+vivo+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

改良的BLT人源化小鼠模型结合体内 PET成像技术，是研究慢性人类疾病的有力工具。该系统在BLT小鼠模型的基础上，将其应用范围从局限于HIV研究扩展至更广泛的领域。此外，该模型为我们提供了一个理想的平台，可在临床应用之前评估多种基因治疗方案及诊断技术。加之使用小鼠相较于灵长类动物具有成本低的优势，使得该模型具有极高的实用价值。
PET成像技术使我们能够评估该方法的有效性。如果我们仅依赖对肿瘤的物理测量，就会低估转基因T细胞所引发的抗肿瘤反应的强度。广泛的瘢痕组织和坏死组织呈现出大肿瘤的外观，而实际上这些是已经死亡的组织。
总之，改良的BLT小鼠模型的应用可拓展至其他疾病模型。尽管该模型仍存在一些缺点，例如小鼠寿命较短，但它仍可成为一种非常有力的工具 体内 评估人类免疫系统的多个方面，测试并开发新型治疗干预手段。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's 培养基</td><td></td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td></td><td>16000085</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td></td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Piptazo (Zosyn)</td><td>Pfizer</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://labeling.pfizer.com/showlabeling.aspx?id=416&quot; target=&quot;_blank">哌拉西林/他唑巴坦组合&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ficoll (Ficoll-Paque Plus)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>MACS 缓冲液</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>见注释</td><td>MACS缓冲液：含0.5%胎牛血清和2 mM 枸橼酸右旋葡萄糖溶液-A的PBS</td></tr><tr><td>CD34 微珠试剂盒</td><td></td><td>130-046-702</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td></td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354263</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html&quot; target=&quot;_blank">http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>卡洛芬 (Rimadyl)</td><td>Pfizer Animal Health</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.rimadyl.com/default.aspx&quot; target=&quot;_blank">https://www.rimadyl.com/default.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用blt人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

小动物模型（如小鼠）已被广泛用于研究人类疾病以及开发新的治疗干预手段。尽管这些研究提供了大量信息，但小鼠免疫系统的独特特性以及病毒性疾病（如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染）的物种特异性，促使了人源化小鼠模型的发展。早期的模型包括使用 C. B 17 scid/scid 小鼠，并移植人类胎儿胸腺和胎儿肝脏，称为胸腺/肝脏（thy/liv）模型（SCID-hu）1, 2，或过继转移人类外周血白细胞（SCID-huPBL）3。这两种模型主要用于HIV感染的研究。
这两种模型的主要局限性之一是外周血中人免疫细胞的重建不够稳定，导致其在研究艾滋病疾病时的生理相关性不足。为解决这一问题，开发了BLT人源化小鼠模型。BLT是骨髓/肝脏/胸腺（bone marrow/liver/thymus）的缩写。在该模型中，6至8周龄的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）免疫缺陷小鼠首先接受胸腺/肝脏组织植入（与SCID-hu小鼠模型相同），随后再进行第二次人造血干细胞移植4。该系统的优势在于能够在外周完全重建人类免疫系统。该模型已被用于研究HIV感染及潜伏感染5-8。
我们对该模型进行了改良，使用基因修饰的人类造血干细胞（hHSC）构建胸腺/肝脏植入物，随后注射经转导的自体hHSC7, 9。该方法可产生基因修饰的细胞谱系。更重要的是，我们对该系统进行了改进，以评估生成表达黑色素瘤特异性T细胞受体的功能性细胞毒性T细胞（CTL）的潜力。利用该模型，我们通过活体正电子发射断层扫描（PET）成像技术评估了转基因CTL的功能，以确定肿瘤退缩情况（9）。
本实验方案的目的是描述如何制备这些转基因小鼠，并利用活体PET成像评估其体内功效。需要说明的是，由于我们使用人源组织和慢病毒载体，实验设施符合美国疾病控制与预防中心（CDC）和美国国立卫生研究院（NIH）规定的生物安全二级（BSL2）标准，并采取特殊防护措施（BSL2+）。此外，NSG小鼠免疫系统严重缺陷，因此其饲养和维护必须符合最高健康标准（<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>）。

移植过程的流程图见图1A。图1B显示了thy/liv移植物的照片。胸腺组织发育正常，并具有人CD4和CD8 T细胞的生理性分布。在重建完成后，动物体内携带人类免疫系统，其中CD4、CD8 T细胞及其他免疫细胞谱系分布正常。
肿瘤大小与活体组织之间的差异如图2所示。尽管CT扫描（灰色区域）显示存在较大的肿瘤生长，体内 PET成像却表明其大部分为坏死组织和瘢痕组织（图2）。这凸显了PET成像在评估肿瘤退缩和清除方面具有更高的敏感性和准确性，是一种更为有效的手段。
<img src="/files/ftp_upload/4181/4181fig1.jpg" alt="胸腺移植过程与重建分析；含NSG小鼠模型和细胞分选的示意图。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/f...

本文描述了利用人源化小鼠产生和表征肿瘤特异性T细胞的方法。将人胸腺组织和基因修饰的人造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，从而重建工程化的人类免疫系统，以实现在体内研究抗肿瘤免疫应答。

利用BLT人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型

小型动物模型（如小鼠）已被广泛用于研究人类疾病以及开发新的治疗干预手段。尽管已有大量……

以下实验的总体目标是生成携带经人工改造的人类免疫系统的小鼠。该目标的实现首先需要准备小鼠以进行手术，第二步是将一段胸腺组织装入套管针中。将Matrigel与CD34阴性及CD34阳性转导细胞混合，然后将该混合物加入套管针中。接下来，将 Matrigel 构建体移植到肾包膜下。最终，可通过活体 PET 成像和实体肿瘤测量来监测经基因工程改造的 CD8 T 细胞对靶向肿瘤的排斥反应。该技术相较于现有方法（如完全免疫缺陷小鼠模型）的主要优势在于，能够研究基因修饰的人干细胞在人胸腺内的发育过程，并对所衍生的细胞谱系进行后续体内功效验证。演示本实验操作的人员为我们实验室的三名技术人员：Gregory Bristol、Bernard Levin 和 Sean Kim。在此示意图中，概述了本研究中用于生成嵌合小鼠的改良BLT模型，这些小鼠携带特定的T细胞。胸腺类器官由来自自体胎儿肝脏分离的经转导与未经转导的CD34细胞重建而成。部分经转导的细胞被冻存，并在四至六周后注射到经照射的小鼠体内。在本视频中，当动物因麻醉而变得迟钝后，将演示第三次活体构建物的植入过程。首先，剃除每只小鼠从背部中线至腹部之间、从髋部到肩部的左侧体表毛发。在记录每只动物体重后，通过耳部打孔编号，并在每只小鼠的肩部皮下注射0.3毫升卡洛芬。然后将小鼠向右侧卧，头朝左。用 PBS 冲洗带有圆锉尖端的 16 号癌症移植针的套管。使用一对尖头镊子，将一块胸腺组织放入 PBS 培养皿中，然后水平持握套管及推杆。在尖端内部吸取组织。将套管针滑入肾包膜下方并注射组织是该操作中最困难的步骤之一。接下来，请一位助手协助。使用带滤芯的正向置换移液器，将5 µL冷的基质胶轻轻混入一管细胞中。保持套管水平，助手缓慢回抽活塞的同时，另一人用移液器加入基质胶。为每只小鼠将试剂混入套管针中。首先，用碘伏擦拭动物的裸露皮肤，然后用异丙醇擦拭巾擦去碘伏。通过两次观察确定皮下颜色最深的位置，以指示脾脏所在部位。使用钝头镊子提起肾脏上方的皮肤，可在脾脏背侧约5毫米处找到肾脏。沿脾脏平行方向在皮肤上做一个长约15毫米的切口。在下方的腹膜肌肉层做类似的切口。在雄性小鼠中，肾脏应可直接可见。只需挤压腹部即可使其突出。在雌性小鼠中，先用左手持续按压腹部以保持肾脏暴露，然后使用止血钳夹住卵巢，再将肾脏拉出，以帮助维持该器官处于体外。在肾被膜的后端轻轻戳一个小孔，然后将套管针插入此孔并沿肾脏推进，直至套管针的开口完全被肾被膜覆盖。接着用右手小指注射组织。随后使用闭合的止血钳轻轻将肾脏推回原位。用双结在腹膜上缝合一针，将皮肤像束口袋一样向上收拢，然后使用两个伤口夹固定。最后，向每只眼睛滴加一滴 PBS，并将小鼠侧卧放置在铺有垫料的笼子中。以相同方式完成所有小鼠的植入后，在离开前确认动物已恢复腹部朝下的体位。此第一张图展示了人源化小鼠中 THI 活体移植的代表性图像。该图显示了胸腺组织的正常发育以及人源 CD4 和 CD8 阳性 T 细胞的生理性组织分布。在完成重建后，动物体内具有人类免疫系统，并呈现出正常的 CD4 和 CD8 阳性 T 细胞分布。此处显示了一只携带黑色素瘤的小鼠的代表性图像。灰色区域表示CT扫描图像，彩色区域表示PET扫描检测到的肿瘤代谢活性。本实验中，仅CT扫描显示白色圆圈所示区域存在一个较大的肿瘤团块。然而，活体PET成像表明该区域主要由坏死组织和瘢痕组织构成，突显了PET成像在评估肿瘤退缩和清除方面具有更高的敏感性和准确性。在完成该操作后，可进一步开展T细胞检测、表型分析及离体激活等其他检测，以回答与T细胞功能相关的问题。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

BLT人性化的鼠标使用一个基于干细胞的基因治疗肿瘤模型的建立

本视频演示了构建双人源化骨BLT（骨髓、肝和胸腺）小鼠的方法，该小鼠具有功能性的人类免疫系统以及稳定植入的人类类似肠道微生物组。...

构建双人源化BLT（骨髓、肝、胸腺）小鼠模型

本方案描述了构建人源化骨髓/肝/胸腺小鼠模型的方法，该模型基于干细胞工程技术，可产生针对HIV感染的免疫反应。...

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

本文介绍了一种新型的人源化小鼠肝脏模型，该模型通过将未成熟且具有扩增能力的人类肝干细胞移植到白蛋白-毒素受体介导的细胞敲除（TRECK）/SCID小鼠体内而建立。...

利用人肝干细胞构建人源化小鼠肝脏

由于干细胞具有内在的肿瘤趋向性，它们作为治疗脑肿瘤的载体具有广阔前景。非侵入性的经鼻干细胞递送可绕过血脑屏障，在临床转化方面展现出巨大潜力。本文总结了在胶质瘤小鼠模型中经鼻干细胞递送的基本原理。...

小鼠模型中通过鼻内递送治疗性干细胞至胶质母细胞瘤

本文介绍了一种在携带原位人源性原发性脑肿瘤的免疫缺陷小鼠中，制备并进行立体定向移植同种异体人淋巴细胞的实验方案。本研究为细胞免疫疗法经颅内递送的可行性和抗肿瘤疗效提供了概念验证。...

立体定向过继性移植细胞毒性免疫细胞至原位人源多形性胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型

我们介绍一种用于生成双人源化BLT小鼠的新方法，该小鼠具有功能性的人类免疫系统以及稳定植入的人类类似肠道微生物组。本方案无需无菌小鼠或已知菌群动物设施即可实施。...

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本方案概述了用于免疫肿瘤学研究的人源化免疫系统（HIS）小鼠的构建方法。本文介绍了在此模型中移植人源肿瘤并用于测试人源免疫治疗药物的操作步骤和注意事项，重点在于表征人源免疫系统对肿瘤的应答反应。...

在携带人源肿瘤的人源化小鼠模型中测试癌症免疫治疗药物

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。...

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

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小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。...

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

了解利用造血干细胞基因疗法建立人源化小鼠肿瘤模型的方法。通过将人胸腺组织与转导细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，重建人类免疫系统以研究抗肿瘤免疫反应。

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