Name: 成像神经胶质瘤启动通过抛光和增强的薄膜头骨的颅窗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学习利用抛光增强型薄颅骨颅窗技术对活体小鼠进行胶质瘤起始的双光子显微成像方法。该技术可实现长期纵向追踪胶质母细胞瘤细胞与血管内皮细胞的相互作用，为癌症干细胞研究提供重要的活体成像工具。

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本工作由杰克逊实验室癌症中心试点资助项目和缅因癌症基金会提供支持。

1. 实验方案
<ol>
 <li>以每克体重0.1 mg氯胺酮和0.01 mg赛拉嗪的剂量对小鼠进行麻醉。术前给予卡洛芬（每克体重0.005 mg）用于镇痛。</li>
 <li>所有手术器械，包括牙科钻头，均通过高压灭菌器进行蒸汽灭菌。若需进行批量手术，每次后续手术前必须使用玻璃珠灭菌器（Fine Science Tools FST 250）对手术器械的尖端重新灭菌。</li>
 <li>当小鼠达到手术麻醉深度（通过脚趾夹捏无反应来评估）后，将其置于棉垫上，再将棉垫放置于加热垫上，以维持约37 °C的体温。手术期间需频繁监测麻醉深度。</li>
 <li>在鼻部后方约3 mm并向后延伸至颈椎的背侧头部区域，去除大致呈三角形的毛发。眼部涂抹眼用软膏，以防止脱水和刺激。</li>
 <li>将小鼠置于俯卧位，用外科碘、70%乙醇和无菌棉签对皮肤进行消毒。使用精细剪刀切除覆盖颅骨额骨和顶骨背侧的大约0.8 × 1.0 cm大小的皮肤瓣。</li>
 <li>局部应用0.5%利多卡因作为局部麻醉剂，涂抹于骨膜及伤口边缘暴露的组织。用手术刀片轻轻刮除骨膜，有助于氰基丙烯酸酯胶水与骨面粘附。</li>
 <li>用记号笔在颅骨上标出感兴趣皮层区域的轮廓。该区域不应位于颅缝线上，以避免损伤下方的大血管。</li>
 <li>在伤口边缘涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂，以防止浆液性液体渗出；除感兴趣区域外，其余颅骨表面也需涂覆该粘合剂。</li>
 <li>本实验方案使用光固化牙科水泥封闭颅骨。在涂抹牙科水泥前，除拟减薄区域外，所有暴露的颅骨表面均需先用牙科水泥套装中的引物处理，随后再涂布粘接剂。待粘接剂干燥后，将光固化牙科水泥涂抹于颅骨表面，以覆盖整个区域。为在后续手术和成像过程中稳定小鼠头部，将一个无菌#00-90六角螺母嵌入距离减薄区域一定距离的牙科水泥中。使用光固化牙科水泥可避免操作时间紧迫，完成颅骨上的牙科水泥制备后，用可见光照射使其固化。</li>
 <li>牙科水泥固化后，使用#00-90螺钉将立体定位装置的头件固定器安装至小鼠头部的六角螺母上。</li>
 <li>在待减薄的颅骨区域滴加一滴室温、0.9%无菌生理盐水。在体视显微镜辅助下，使用高速微型钻头在感兴趣区域上方减薄颅骨，形成一个圆形区域（通常直径约为4–5 mm）。在减薄过程中间歇性进行钻孔并滴加生理盐水，以避免对下方脑组织造成热损伤。生理盐水可吸收热量，并有助于软化骨质。</li>
 <li>小鼠颅骨由两层致密骨夹着一层厚的松质骨构成。使用钻头去除外层致密骨及大部分松质骨。</li>
 <li>当大部分松质骨被去除后，在解剖显微镜下可观察到松质骨内残留的空腔，表明钻孔已接近内层致密骨。此时颅骨厚度仍应大于50 μm。应谨慎继续减薄，以获得非常薄（约20 μm）且光滑的制备面。</li>
 <li>当颅骨达到所需厚度（约20 μm）后，首先使用定制的硅胶刷蘸取金刚石研磨膏（6–15 μm）对颅骨进行约10分钟的抛光。金刚石研磨膏抛光具有两个作用：第一，可在不施加压力的情况下进一步减薄颅骨，从而避免对下方脑组织造成意外损伤；第二，为后续使用细粒度氧化锡进一步抛光提供初步处理步骤。</li>
 <li>完成金刚石研磨膏抛光后，使用氧化锡对减薄的颅骨继续抛光约10分钟。抛光完成后，用生理盐水冲洗去除氧化锡，直至减薄的颅骨表面清洁透明。</li>
 <li>在此步骤中，若颅窗将用于长期in vivo成像，则需将清洁后的减薄颅骨区域彻底干燥，并滴加少量透明氰基丙烯酸酯胶水以封闭颅窗。氰基丙烯酸酯胶水在减薄颅骨与盖玻片之间的层应尽可能薄。</li>
 <li>若在PoRTS颅窗制备后需进行注射操作，则在此步骤中使用26号注射针头在抛光减薄颅窗的一侧打一个小孔，用于GBM细胞注射。</li>
 <li>使用拉针仪制备尖端开口直径约50 μm的无菌玻璃移液管。该移液管将用于GBM细胞注射，并装载至显微操作器上。移液管以30度角装载，使GBM细胞注射位点远离最终成像区域。在解剖显微镜下剪去移液管尖端，并通过注射泵负压将GBM细胞悬液装入移液管前端。</li>
 <li>当注射移液管装载GBM细胞后，将小鼠重新移至显微镜下。通过显微操作器将注射移液管对准颅窗上的小孔并插入脑组织。将1 μl GBM细胞悬液以0.1 μl/min的速度注入脑内，深度位于脑表面下100–200 μm处（持续10分钟）。</li>
 <li>将颅骨干燥后，在干燥的颅骨表面滴加少量透明氰基丙烯酸酯胶水，并将一片3 mm大小的#1盖玻片粘附于减薄并抛光的颅骨区域。盖玻片与周围牙科水泥之间的间隙用氰基丙烯酸酯胶水密封。</li>
 <li>术后，皮下注射1 ml温热无菌生理盐水，并提供辅助加热以维持小鼠体温，直至其完全从麻醉中恢复。</li>
 <li>成像时，以每克体重0.1 mg氯胺酮和0.01 mg赛拉嗪的剂量对小鼠进行麻醉。使用定制的立体定位框架在显微镜下固定小鼠。若需每日重复进行in vivo成像，异氟烷是更优选择，因为小鼠在反复使用氯胺酮后可能出现依赖现象。</li>
</ol>
2. 典型结果
成功的PoRTS颅窗手术可使颅窗保持清晰数周至数月。 图1 显示了使用背向散射光在PoRTS颅窗下观察到的脑血管结构。这些血管图像被用作解剖标志，以定位同一脑区进行重复成像。为了同时可视化血管内皮细胞和胶质母细胞瘤（GBM）细胞，我们将B6.Cg-Tg(Tek-cre)1Ywa/J小鼠与B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor小鼠杂交，前者可特异性标记血管内皮细胞，tm9(CAG-tdTomato)Hze/J 小鼠，并构建了血管内皮细胞标记有红色荧光蛋白 tdTomato 的转基因小鼠模型。随后，对这些小鼠实施 PoRTS 开颅手术，通过颅窗侧缘的小切口将绿色荧光蛋白（GFP）标记的胶质母细胞瘤（GBM）细胞注入其脑内，接着进行了 体内 在注射后的小鼠上进行纵向双光子成像。激光激发波长设置为910 nm，可同时激发GFP和tdTomato。双光子成像使用自行搭建的双光子激光扫描显微镜完成，该系统配备两个探测器，可同时检测绿色和红色荧光。 图2 显示一个 体内 血管附近注射GBM细胞引发胶质瘤的示例。PoRTS颅窗同样是进行慢性延时成像的极佳选择 体内 成像 图3 显示了未进行PoRTS手术的小鼠、PoRTS手术后7天的小鼠以及PoRTS手术后7天并接受生理盐水注射的小鼠的皮层切片中GFAP染色结果。图像显示，未手术小鼠与仅接受PoRTS手术的小鼠均未出现胶质增生，而在接受生理盐水注射的小鼠脑组织中可观察到胶质增生，这是由于移液器穿刺及脑内生理盐水注射所致。该结果表明，在PoRTS颅窗下未发生胶质增生，从而独立验证了本文所述的PoRTS颅窗不会引起通常与“开颅”慢性颅窗相关的胶质增生。 图 4 显示同一只小鼠在手术当天（第0天）和PoRTS窗口创建后32天（第32天）树突棘的高分辨率成像，表明PoRTS窗口同样是进行高分辨率成像的理想选择 体内 成像
<img alt="注射后血管发育的时间推移，显微镜图像显示14天内的每日进展。" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 利用背向散射光，在抛光并加固的薄化颅窗下观察血管系统。天数表示术后天数；图像从手术当天完成胶质母细胞瘤（GBM）细胞注射后立即开始采集。比例尺：0.5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="细胞迁移的延时显微镜观察；第1-13天的荧光图像；红色/绿色标记物。" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. 原位可视化注射的胶质母细胞瘤（GBM）细胞与血管结构。in vivo 实验使用同时携带 Tek-Cre 和 ROSA26 CAG-tdTomato 基因的小鼠进行 GBM 细胞注射。血管内皮细胞标记为 tdTomato（红色），GBM 细胞标记为 GFP（绿色）。图像采集始于 GBM 细胞注射后 24 小时。共采集 10–12 个相邻视野，并将这些视野围绕中心位置的注射 GBM 细胞拼接组合，以生成最终图像。图中标注的“天”表示手术后的天数。比例尺：100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="脑切片荧光显微镜；B6小鼠模型；术后生理盐水处理；神经结构分析。" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3"> 
图 3. PoRTS颅窗手术后未出现胶质增生。上排图像：小鼠脑冠状切片在较低放大倍数下的观察结果。左图：未经任何颅窗手术的小鼠，脑组织中未观察到GFAP激活。中图：右侧大脑实施PoRTS颅窗手术的小鼠，脑组织中未观察到GFAP激活。右图：在PoRTS颅窗侧接受生理盐水注射的小鼠，仅在PoRTS颅窗侧观察到GFAP激活，而在完整脑组织侧未观察到激活。比例尺：1 mm。下排图像：对应上图白框区域内脑组织的高倍放大图像。比例尺：100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="显微镜图像显示32天内的结构变化；分析用比例尺为2 µm。" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图4"> 
图4. 来自Thy-1 YFPH小鼠的树突棘高分辨率成像。图像分别在PoRTS手术当天以及PoRTS手术后32天获取。从图像中可以明显看出，第0天存在的大多数树突棘在PoRTS手术后32天仍清晰可见。比例尺：2 μm。

<ol><li>Paulino, A. C., Teh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of brain tumors.</a> N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+therapeutic+implications+of+cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma.</a> Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).</li>
<li>Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+cancer+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for cancer stem cell research.</a> Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).</li>
<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+the+cancer+stem+cell+hypothesis+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large.</a> Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).</li>
<li>Ebben, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+paradigm%3A+a+new+understanding+of+tumor+development+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).</li>
<li>Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+brain+tumors%2C+neural+stem+cell%2C+and+brain+tumor+cancer+cells%3A+where+is+the+link%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link.</a> Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).</li>
<li>Park, D. M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+glioma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of glioma cancer stem cells.</a> Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).</li>
<li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).</li>
<li>Barami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+neural+stem+cells+with+their+vascular+niche%3A+implications+in+the+malignant+progression+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas.</a> J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).</li>
<li>Gilbertson, R. J., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+tumour%27s+bed%3A+glioblastoma+stem+cells+and+the+vascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).</li>
<li>Cho, R. W., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cancer stem cells.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

PoRTS颅窗成功的关键在于颅骨的减薄和抛光。虽然初步减薄可以快速完成，但需注意确保在较大区域内颅骨减薄的均匀性。我们通常在颅骨表面涂抹一层薄盐水，然后逐次进行减薄操作，使盐水在微型钻头经过颅骨一次后很快蒸发。这样可以缓慢而均匀地进一步减薄颅骨。在显微镜下保持手部稳定也至关重要。当颅骨减薄接近预期厚度时，我们通常先使用金刚石抛光膏对减薄区域抛光10至15分钟，随后使用氧化锡进行进一步抛光。我们发现，首先使用金刚石抛光膏对减薄颅骨进行抛光通常能获得更好的抛光效果，同时还能在不施加过大压力的情况下进一步减薄较大面积的颅骨区域。
我们选择PoRTS颅窗而非其他常用的颅窗方法（如“开颅”颅窗和“磨薄颅骨”颅窗），原因如下：采用开颅颅窗时，窗口通常在制作后不久变得浑浊，随后在两周内自行恢复透明，因此需要等待约两周才能进行任何成像实验。这一两周的等待期将无法观察胶质瘤在胶质母细胞瘤（GBM）细胞注射后最初两周内的起始过程。而磨薄颅骨颅窗则要求在每次成像前重复进行颅骨薄化操作，这使其不适用于每日连续观察GBM细胞注射后的胶质瘤起始过程。相比之下，PoRTS颅窗允许我们从窗口侧方注入GBM细胞，从...

<table><tbody><tr><td>含丙酮酸钠的 DMEM/F12(1:1)</td><td>Thermo Sci Hyclone</td><td>SH3026101</td><td> </td></tr><tr><td>B-27 无血清培养添加剂（50 倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td> </td></tr><tr><td>GlutaMax-1 添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td> </td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Thermo Sci Hyclone</td><td>SV30010</td><td> </td></tr><tr><td>Accutase 酶细胞解离液</td><td>eBioscience</td><td>00-4555-56</td><td> </td></tr><tr><td>T25 培养瓶，绿色透气盖</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1810.502</td><td> </td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>JAX LAHS</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>10% 聚维酮碘外用溶液</td><td>JAX LAHS</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>NDC# 11695-0550-1</td><td> </td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn, Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td> </td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>JAX LAHS</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>17033-211-38</td><td> </td></tr><tr><td>0.5% 盐酸利多卡因</td><td>REGENT, Inc.</td><td>NDC 0517-0625-25</td><td> </td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶</td><td>Henkel Corp</td><td>46551</td><td> </td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td> </td></tr><tr><td>金刚石抛光膏</td><td>Widget Supply</td><td>BBE60</td><td> </td></tr><tr><td>氧化锡</td><td>LORTONE, Inc.</td><td>591-038</td><td> </td></tr><tr><td>Liner Bond 2V</td><td>KURARAY Medical Inc.</td><td>1921-KA</td><td> </td></tr><tr><td>Clearfil AP-X</td><td>KURARAY Medical Inc.</td><td>1721-KA</td><td> </td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>JAX LAHS</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720</td><td> </td></tr><tr><td>六角螺母</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0090-C</td><td> </td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Syringepump.com</td><td>NE-1000</td><td> </td></tr><tr><td>双光子成像系统</td><td>定制构建（任何商用系统均可使用）</td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

成像胶质瘤起始过程 在体 内 通过抛光并加固的薄颅骨颅窗

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

胶质瘤是人类癌症中致死性最高的类型之一。迄今为止最有效的胶质瘤治疗方法——手术联合放疗——仅能为患者带来有限的生存获益，因为大多数患者在确诊后无法存活超过五年，主要原因是胶质瘤复发1,2。人类脑肿瘤中癌干细胞的发现，为开发胶质瘤新型治疗策略带来了巨大希望3。癌干细胞具有自我更新和分化的能力，被认为是肿瘤中唯一能够启动新肿瘤形成的细胞4。放疗后胶质瘤的复发被认为源于胶质瘤干细胞（GSCs）对治疗的抵抗性5-10。体内研究表明，GSCs定位于血管周围微环境，该微环境对其干性特征的维持至关重要11-14。在GSC微环境的结构中，血管内皮细胞起着核心作用12。现有证据表明，GSCs及其与血管内皮细胞的相互作用在肿瘤发生过程中具有重要作用，并提示GSCs及其与内皮细胞的相互作用是胶质瘤治疗的重要靶点。GSCs的存在通常通过其在原位移植后启动新肿瘤形成的能力来实验性地验证15。这一过程通常通过将特定数量的人源胶质母细胞瘤（GBM）细胞注射到重度免疫缺陷小鼠脑内，或将小鼠GBM细胞注射到同基因型宿主小鼠脑内来实现。在注射后的GBM细胞中，GSCs需要一定时间（通常为数周至数月）启动新肿瘤的形成，之后方可进行肿瘤生长检测。因此，现有的检测方法无法在体内直接观察从单个GSCs启动肿瘤形成的这一关键病理过程。由此导致人们对GSCs及其与血管内皮细胞在肿瘤起始早期阶段的具体作用仍缺乏深入认识。这些认识对于开发胶质瘤新型治疗策略至关重要，并将对预防患者胶质瘤复发产生重大影响。本文中，我们改进了PoRTS颅窗技术16，并结合体内双光子显微镜，实现了在活体小鼠脑内可视化观察注射的GBM细胞启动肿瘤形成的过程。本技术将为未来阐明GSCs与血管内皮细胞在胶质瘤起始过程中的关键信号机制奠定基础。

通过结合抛光加固的薄颅骨（PoRTS）颅窗和胶质母细胞瘤（GBM）细胞注射，我们能够对活体小鼠脑内注射的GBM细胞所引发的胶质瘤发生及生长过程进行长期纵向观察。

胶质瘤是人类癌症中最致命的类型之一。迄今为止最有效的胶质瘤治疗方法——手术切除后辅以放射治疗——可提供……

本实验的总体目标是通过体内成像技术，观察单个注射的胶质母细胞瘤细胞在体内引发胶质瘤的初始阶段。该目标首先通过将小鼠颅骨的特定区域磨薄至适合活体成像的厚度来实现，随后对磨薄的颅骨区域进行抛光处理。然后将表达GFP标记的胶质母细胞瘤细胞注射到小鼠脑内，并封闭颅窗以进行活体成像。最后，对注射的胶质母细胞瘤细胞进行每日成像，以在活体中可视化观察由注射的胶质母细胞瘤细胞引发的胶质瘤起始过程。最终，可通过双色活体双光子显微镜获得结果显示，单次注射胶质母细胞瘤细胞后在活体内发生的胶质瘤起始及其与血管内皮细胞之间的关系。该方法有助于解答癌症干细胞领域的关键问题，例如胶质瘤干细胞与血管内皮细胞之间的相互作用及其在体内引发胶质瘤过程中的关键作用。手术操作将在JAK外科服务部门的Lapier主管和我实验室的Postal共同监督下进行。在高压灭菌器中准备手术时，需对所有手术器械进行蒸汽灭菌，包括牙科钻头。在使用氯胺酮和赛拉嗪对小鼠实施麻醉并给予镇痛剂后，通过使用小型电动剃须刀进行足趾夹捏测试来检查麻醉深度。去除头部背侧约呈三角形区域的毛发，该区域前端距鼻孔约三毫米，并向颈椎方向延伸。将眼用软膏涂抹于小鼠眼睛。将小鼠置于仰卧位，先用外科碘消毒，再用70%乙醇处理。为消毒皮肤，将动物放置于棉垫上，然后转移至加热垫上。为了维持约37摄氏度的体温，将局部镇痛剂涂抹于骨膜及伤口暴露的组织上。使用手术刀片通过轻柔刮除颅骨表面的方式去除骨膜，这有助于氰基丙烯酸酯胶水黏附于骨组织。接下来，使用记号笔标出目标皮层区域的轮廓，注意避开缝线位置，以防止损伤下方的大型血管。然后在创口边缘涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸盐粘合剂，以防止血清样液体渗出；除目标区域外，在其余颅骨表面涂抹该粘合剂。随后使用光固化牙科水泥封闭颅骨，对所有暴露的颅骨区域（拟减薄区域除外）依次使用底涂剂和粘结剂处理。待粘结剂干燥后，用牙科水泥覆盖颅骨，以固定小鼠头部。进行手术和成像时，将一个#00-90六角螺母嵌入牙科水泥中，位置应距离待减薄区域一定距离。牙科水泥制备完成后，使用可见光将其固化。然后使用#00-90螺丝将立体定位装置的头件固定器连接到六角螺母上。接下来，将小鼠头部置于体视显微镜下，在需要减薄的颅骨区域滴加一滴室温的0.9%无菌生理盐水。使用高速微型钻头在目标区域的颅骨上磨出一个圆形的减薄区域。为避免对下方脑组织造成热损伤，应间歇性暂停钻磨，并滴加生理盐水降温。小鼠颅骨由两层薄的密质骨构成，中间夹有一层较厚的松质骨。使用钻头去除顶部的薄层密质骨以及大部分松质骨。当大部分松质骨被去除后，在解剖显微镜下可观察到松质骨中残留的空腔，表明钻孔已接近内层的密质骨。在此阶段，颅骨厚度仍应超过 50 微米。小心继续减薄颅骨，以获得非常薄且光滑的制备样本。为进一步减薄颅骨，使用自制硅胶鞭和金刚石研磨膏抛光约 10 分钟。继续使用细粒度的氧化锡抛

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Research

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医学

成像神经胶质瘤启动<em在体内</em&gt;通过抛光和增强的薄膜头骨的颅窗

将GL261细胞颅内植入C57BL/6小鼠可诱导生成恶性胶质瘤，其特征与人类多形性胶质母细胞瘤的多种典型特征相似。我们采用稳定表达荧光素酶的GL261细胞，以便通过体内成像技术监测肿瘤进展过程。本文展示了手术操作及三维体内成像方法。...

颅内植入及后续三维成像 体内 小鼠胶质瘤的生物发光成像

我们介绍一种在小鼠颅骨上制备成像窗口的方法，该窗口可跨越数毫米，并且在数月内保持稳定，且不会引起脑部炎症。该方法非常适合利用双光子显微镜进行血流、细胞动态以及细胞/血管结构的长期研究。...

一种经过抛光和加固的减薄颅窗，用于小鼠大脑的长期成像

本视频介绍了一种在小鼠模型中植入颅窗的手术方法，以实现对大脑不同区域的稳定光学观测。...

小鼠颅窗植入术：一种用于稳定光学接触小鼠脑区的玻璃盖片植入手术方案

关键词：颅窗植入，小鼠模型，光学成像，玻璃盖片，脑部手术，活体成像

我们介绍一种在小鼠模型中制备薄颅骨皮层窗（TSCW）的方法 体内...

减薄颅骨皮层窗技术 体内 光学相干断层成像

一种新型高分辨率 体内 研究颅内结构对肿瘤生长及治疗动态响应的成像技术

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

本文介绍了一种在同一只活体动物体内，对脑肿瘤细胞在侵入性外科手术干预（例如活检）前后进行高分辨率时间序列多光子成像的方法。该方法能够在单细胞水平上研究此类侵入性外科操作对肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖行为的影响。...

对侵入性手术活检后脑肿瘤细胞行为的纵向活体成像

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。...

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

本文介绍了一种用于在清醒且头部固定的活体小鼠中对脑细胞进行长期成像的慢性颅窗植入实验方案。...

植入颅窗以实现重复观察 在体实验 清醒小鼠成像

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。...

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。...

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

学习利用抛光增强型薄颅骨颅窗技术对活体小鼠进行胶质瘤起始的双光子显微成像方法。该技术可实现长期纵向追踪胶质母细胞瘤细胞与血管内皮细胞的相互作用，为癌症干细胞研究提供重要的活体成像工具。

成像胶质瘤起始过程在体内通过抛光并加固的薄颅骨颅窗

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成像胶质瘤起始过程 在体 内 通过抛光并加固的薄颅骨颅窗

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