异型三维卵巢癌的发生和发展过程中的间质 - 上皮细胞相互作用模型

以下实验的总体目标是生成早期卵巢癌发展的三维典型模型。首先，生成源自原代、正常卵巢上皮细胞和成纤维细胞组织的 H turt 永生化细胞系。然后，为了重建卵巢共培养中存在的体内结构和复杂的细胞相互作用，三维 S 球体模型中的上皮细胞和基质细胞系继续固定和染色类器官培养物并分析特异性标记物的表达，以研究基质上皮相互作用的分子特征。

获得的结果显示了 3D 典型模型的基质细胞区室的改变如何影响共培养上皮细胞的表型。三维典型模型可以帮助回答卵巢癌研究领域的关键问题，例如探索这种疾病的起源并阐明基质微环境在肿瘤发生和发展中的作用。与其他 3D 培养方法相比，这些技术的应用扩展到疾病诊断和治疗。

该技术可应用于更广泛的细胞培养体积和下游应用。例如，3D 同型和典型培养物可用于体外药物检测。这种方法也可以应用于其他模型系统，例如其他实体瘤类型或良性疾病的研究。

将新鲜的卵巢组织运输到细胞培养实验室，在永生化的正常卵巢成纤维细胞生长培养基中，补充有额外的抗生素和抗生素。用 5 ml PBS 洗涤样品 3 次，以去除任何仍然松散附着在组织的上皮细胞。接下来，将样品加 PBS 转移到干净的 P 100 培养皿中 使用无菌仪器，将组织转移到第二个干燥的 P 100 清洁培养皿中。

将组织切成 0.5 平方厘米的小块，然后将每块转移到单独的 P 100 培养皿中。继续将组织切成小于 1 平方毫米的块。然后加入 20 毫升 INOF GM 培养基和培养物 Monitor，使用相位显微镜进行细胞生长。

确认细胞在 24 小时内粘附在培养皿上。使用相位显微镜监测细胞生长 细胞通常在一周后 24 小时内粘附在培养皿上。通过抽吸去除任何非粘附组织，补充培养基，然后在细胞集落大小约为 500 微米时，每周两次重新补料培养物，在 1 到 3 周内。

使用三分板和涂层克隆盘分离克隆。为了确认 100% 成纤维细胞。将细胞系样品接种在玻璃盖玻片上，并对成纤维细胞标志物、上皮标志物和内皮细胞标志物进行免疫荧光染色。

在 H Turt 传代逆转录病毒转导前一天，正常卵巢成纤维细胞从单个 P 100 培养皿分离到三个 P 100 培养皿中。预制病毒 sup natan 可以购买或使用 HEC 2 9 3 T 细胞 cot 转染的标准方案在内部生产。要制备 poly Hema 溶液，请称取 1.5 g poly hema，然后放入无菌瓶中。

加入 95 毫升分子生物学级无水乙醇和 5 毫升细胞培养级蒸馏水。将 Poly Hema 溶液放入 65 摄氏度的水浴中，直至完全溶解。用新鲜制备的 poly Hema 溶液涂布组织培养皿。

在层流罩内风干细胞培养皿。在摇床平台上轻轻摇晃，以确保较大尺寸的培养皿或培养瓶的涂层均匀。如果多元溶液干得太快，表面将不光滑。

如果需要，在 3D 培养之前对成纤维细胞进行预处理，例如，为了诱导衰老，用亚致死剂量的过氧化氢预处理细胞。在体外回收和扩增 INOF 和上皮细胞培养物，以制备足够的细胞来建立 3D 异位类固醇。PBS 洗涤 5 分钟后，向聚乙烯 hema 板中加入 15 毫升培养基。

同时，将胰蛋白酶添加到永生化的正常卵巢成纤维细胞中，以将它们从培养皿中分离出来。3 到 5 分钟后，用等体积的培养基中和胰蛋白酶，然后离心收获细胞。将细胞沉淀重悬于 5 mL 培养基中，并通过上下吹打或轻轻涡旋充分混合。

然后使用 10 μL 样品通过 trian blue 计数活细胞。现在将 400 万个 INOF 细胞添加到已分配到聚乙烯 hema 包被板中的培养基中。将培养基体积补足至 20 毫升，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育。

通过相位显微镜监测细胞聚集成多细胞类固醇，以每两到三天重新喂养 S 球状体培养物。将板以一定角度放在移液管上。让球体沉淀，然后用 5 毫升移液器小心地去除约 16 毫升的耗尽培养基。

向培养物中加入 16 毫升新鲜培养基，并在第 7 天放回培养箱中。通过将上皮细胞添加到成纤维细胞 phe 中来产生异型培养物。首先，如前所述，在计数细胞后通过胰蛋白酶制备卵巢上皮细胞的悬液。

在 INOF GM 培养基中洗涤一次，以防止任何生长因子从上皮生长培养基中携带。补充成纤维细胞 OID 培养物的培养基后，以 4：1 的比例将上皮细胞添加到上皮细胞培养物中。INOF GM 中的异位 OID 每 2 到 3 天再补料典型培养物，再持续 14 天。

对于免疫组织化学，用中性缓冲福尔马林固定 PHE，沉淀 PHE 并用 70% 乙醇替换福尔马林。继续使用用于人体组织的标准方案加工成石蜡。石蜡包埋的类固醇可以使用免疫化学对特定分子标志物的 h 和 e 进行切片和染色。

或者，在 PBS 中洗涤类固醇并固定在 4% 对位甲醛中。然后将样品包埋在 OCT 培养基中，快速冷冻用于低温恒温器切片和免疫荧光染色，以便通过流式细胞术进行分析。在 PBS 中洗涤类固醇，并在 37 摄氏度下通过胰蛋白酶或 Accutane 消化解离。

通过使用 1 毫升移液器吸头上下移液，可以促进类固醇完全解离成单细胞悬液。注意不要使细胞过大，用等体积的培养基中和反应，并通过将悬浮液通过 40 至 70 微米的细胞过滤器去除细胞团块。然后沉淀细胞并用 PBS 洗涤并计数，根据制造商的说明在 Facts 缓冲液中重悬所需数量的细胞 在我们的实验室中，我们已经部分转化了卵巢上皮细胞，并将这些细胞与正常和衰老的卵巢成纤维细胞共培养，以模拟早期卵巢癌的发展。

在绝经前卵巢中，h hert 永生化正常卵巢成纤维细胞的免疫荧光染色显示，原代正常卵巢成纤维细胞和永生化正常卵巢成纤维细胞均表达成纤维细胞特异性蛋白，但它们不表达细胞角蛋白 7 和表达 menton。以 3D 形式单独培养的正常卵巢成纤维细胞 PHE 显示出纺锤形形态和丰富的细胞外基质。在这里，正常的卵巢成纤维细胞暴露于过氧化氢中以诱导衰老超过 7 天，然后与部分转化的卵巢上皮细胞一起培养 14 天。

为了区分这两种细胞类型，对所得类固醇进行免疫染色，mim 1 作为增殖标志物，泛细胞角蛋白作为上皮标志物。数据的量化表明，衰老的微环境促进了部分转化的上皮细胞的肿瘤特征，而正常的微环境抑制了肿瘤进展，正常和恶性细胞的组织学特征在细胞恢复时无法检测到。例如，当细胞转化为球状体培养物时，可以在透明细胞卵巢癌细胞系的 3D 培养物中检测到透明细胞卵巢癌的组织学特征，但不能在同一细胞的单层培养物中检测到。

观看本视频后，您应该对如何设置三维典型培养物有很好的了解，以研究上皮细胞和基质细胞之间的相互作用。在早期肿瘤发生期间。在设置 3D 培养物时，根据下游应用调整细胞数量非常重要，从而在加工过程中允许一些材料损失。

一旦掌握，就可以按照此程序在 1 小时内构建 3D 培养物。可以执行其他方法，例如流式细胞术与基因表达微射线分析相结合，以分析在 3D 典型培养物中发生但在单层培养条件下未检测到的全局基因表达变化。这将能够解剖在 3D 核心培养物下专门发生的双向信号通路。微。