Name: 异型三维卵巢癌的发生和发展过程中的间质 - 上皮细胞相互作用模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学习构建三维异型卵巢癌模型，通过共培养卵巢成纤维细胞与上皮细胞研究肿瘤微环境中基质-上皮相互作用。该方法有助于揭示卵巢癌早期发生机制并探索潜在治疗策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究在美国加利福尼亚大学凯克医学院和英国伦敦大学学院进行。KL 获得美国国立卫生研究院资助项目 5 U19 CA148112-02 的支持。BG 获得英国伊芙基金会（Eve Appeal）妇科肿瘤慈善项目资助。在伦敦大学学院医院/伦敦大学学院（UCLH/UCL）开展的部分工作获得了英国卫生部国家健康研究所（NIHR）生物医学研究中心资助计划的部分资助。

图1 展示了下文所述工作流程的概览。
1. 正常卵巢成纤维细胞的分离与扩增 体外 通过过表达催化亚基延长寿命 hTERT 全酶
<ol>
 <li>卵巢组织可在获得患者知情同意并经机构审查委员会批准（针对美国机构）后采集。正常卵巢组织可在全腹腔子宫切除术或腹腔镜全子宫切除术联合双侧输卵管卵巢切除术后获取。本研究中，组织经病理学家检查，并取部分卵巢间质进行活检以用于细胞培养。组织样本大小约为2-5 mm2 从卵巢中心区域采集样本，以尽量减少同时采集到卵巢上皮组织的可能性。</li>
 <li>将新鲜的卵巢组织置于添加了额外抗生素和抗真菌剂的永生化正常卵巢成纤维细胞（INOF）生长培养基中，运送至细胞培养实验室。INOF生长培养基（INOF-GM）的成分为：Medium 199与MCDB105按1:1比例混合，添加15%胎牛血清和2 mM L-谷氨酰胺， 50 μg/ml 庆大霉素和250 ng/ml 两性霉素B。</li>
 <li>在生物安全柜内操作：用 5 ml PBS 清洗样本，去除仍松散附着在组织上的上皮细胞。吸除液体，重复此步骤两次。</li>
 <li>将样本连同 PBS 转移至一个洁净的 10 cm 直径（P100）培养皿中。使用无菌镊子操作组织，将其放入第二个洁净的无菌 P100 培养皿（干燥）中。使用无菌手术刀将组织切成 0.5 cm 大小2 组织块。将每块组织放入一个独立的 P100 培养皿中，并进一步切割成小块 &lt;1 mm2 大小。加入20 ml INOF-GM（含抗生素和抗真菌剂），并在 37 °C，5% CO₂2使用相差显微镜监测细胞生长。细胞可在24小时内贴附于培养皿上。</li>
 <li>一周后换液，通过吸除去除任何非贴壁组织。此后，每周换液两次。细胞将形成克隆，通常在1–3周内出现。当这些克隆生长至足够大可进行传代时（即达到约 500 μm)，使用胰蛋白酶包被的克隆环分离克隆。 
 通过将细胞系样品接种于玻璃盖玻片上，并对成纤维细胞标志物（FSP）、上皮细胞标志物（pan-cytokeratin）和内皮细胞标志物（von Willenbrand Factor VIII）进行免疫荧光染色，确认细胞为100%成纤维细胞且无其他细胞污染。</li>
 <li>将原代正常卵巢成纤维细胞（NOF）从一个P100培养皿传代至3个P100培养皿，于逆转录病毒转导前一天进行 hTERT预制成的病毒上清液可直接购买，或通过标准共转染HEK293T细胞的方法在实验室自行制备（参见 <a href="http://www.stanford.edu/group/nolan/" target="_blank">www.stanford.edu/group/nolan/</a>). 
 使用 pBABE-hygro-hTERT 载体（Addgene）可制备逆转录病毒上清液。将正常成纤维细胞（NOFs）从培养箱中取出，吸除细胞培养基。每皿加入 3 ml 病毒上清液：一皿加入 hTERT 逆转录病毒，另一皿加入对照病毒nd 第一皿加入GFP逆转录病毒，第三皿不加病毒。用含有polybrene的INOF-GM覆盖病毒上清，使其终浓度为 8 μg/ml次日用新鲜培养基更换培养液。感染后两天，开始使用低剂量（10 U/ml）潮霉素B进行筛选。七天后可将剂量增至20 U/ml；筛选应在10至14天内完成。</li>
 <li>表达 hTERT 或 GFP 的克隆可通过环状克隆法在细胞生长至约 500 μm细胞系需要进一步的鉴定以确认目的基因或蛋白的成功表达 hTERT 以及原代细胞系特征的维持。包括：(a) 通过PCR-ELISA检测端粒酶活性，并通过Southern印迹法或PCR检测端粒长度 6,7；（b）验证关键标志物的表达例如 使用抗全角蛋白抗体对上皮细胞进行免疫染色，以及使用抗成纤维细胞表面蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫染色）在原代和 hTERT-永生化细胞；(c) 确认细胞不表现出肿瘤性转化特性（例如使用锚定非依赖性生长实验）；(d) 确认延长的 体外 表达该基因的细胞中观察到的寿命 hTERT 但不包括GFP。 hTERT表达永生化正常卵巢成纤维细胞（INOFs）应绕过复制性衰老，但不发生新生物性转化；此外，INOF细胞应维持成纤维细胞表面蛋白的表达，而不表达上皮标志物如细胞角蛋白（cytokeratin）图2).</li>
</ol>
2. 使用聚HEMA包被组织培养皿以进行非贴壁细胞培养
<ol>
 <li>配制聚羟基甲基丙烯酸酯（polyHEMA）溶液时，称取 1.5 g polyHEMA，放入无菌瓶中。加入 95 ml 分子生物学级无水乙醇和 5 ml 细胞培养级蒸馏水。polyHEMA 水凝胶将溶解于溶液中的水相成分，而乙醇可对制剂起到灭菌作用。</li>
 <li>将 polyHEMA 溶液置于 65 °C 水浴中，直至完全溶解，可能需要长达 8 小时。请注意，polyHEMA 溶液不能长期保存，应现用现配。 
 故障排除：polyHEMA 溶液在 65 °C 下需要长时间孵育。应定期倒置混匀溶液。若在玻璃瓶底部观察到黏稠物，表明 polyHEMA 尚未完全溶解，需继续在 65 °C 下孵育。</li>
 <li>在超净工作台内，用 polyHEMA 溶液包被组织培养皿。任何规格的组织培养皿、培养瓶或多孔板均可进行 polyHEMA 包被。每种容器所需的推荐 polyHEMA 溶液体积见表 2。</li>
 <li>将细胞培养皿置于超净工作台内自然干燥，可能需要 2–3 天。对于较大尺寸的培养皿或培养瓶，可在摇床上轻轻摇动，以确保包被均匀。若 polyHEMA 溶液干燥过快，表面可能不平整。为避免此问题，干燥过程中应始终保持培养皿或培养瓶的盖子盖紧。</li>
 <li>进行第二次 polyHEMA 包被，并按上述方法干燥。 
 故障排除：polyHEMA 包被层中可能出现孔洞，尤其在板过快干燥时。对板进行双层包被有助于在使用前覆盖包被层中的缝隙或裂纹。每层 polyHEMA 包被通常需要 2–3 天干燥，因此应在细胞培养使用前至少一周开始制备。</li>
 <li>polyHEMA 包被的培养板可在室温下保存，直至使用。</li>
</ol>
注意：1% 琼脂糖溶液用 1X PBS 溶解后经高压灭菌，也可用于包被细胞培养皿，以制备短期三维培养（少于一周）所需的非黏附表面。多孔板经琼脂糖包被后可形成凹形表面，有助于多种细胞系在每孔中形成单个球状体。然而，对于较长时间的三维培养，建议使用聚HEMA包被，因为琼脂糖包被在长期培养后常发生解体。
3. 生成三维（3D）异质类球体及3D培养物的换液
<ol>
 <li>复苏并扩增内皮细胞和上皮细胞培养物 体外 以准备足够数量的细胞用于建立三维异质类球体。对于“大规模培养”，我们通常接种 2-4x106 每 P100 培养皿的 INOFs 数量为 0.5–1×106 上皮细胞，以获得4:1的间质:上皮比例。INOF细胞在不含庆大霉素和两性霉素B的INOF生长培养基（INOF-GM）中培养。如需要，成纤维细胞在进行三维培养前可进行预处理（例如 为诱导细胞衰老，可用亚致死剂量的过氧化氢处理细胞。</li>
 <li>用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一块干燥的聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（polyHEMA）培养板，持续 5 分钟。吸除 PBS，加入 15 ml INOF-GM。</li>
 <li>同时，用胰蛋白酶消化永生化正常卵巢成纤维细胞，使其从培养皿上脱落，3-5 分钟后加入等体积培养基中和胰蛋白酶，随后在 450 × g 离心 5 分钟以收集细胞。</li>
 <li>弃去上清液。加入5 ml INOF-GM重悬细胞沉淀，通过反复吹打或轻轻涡旋振荡制备单细胞悬液，充分混匀。通过混匀后取样测定细胞浓度 10 μl 细胞悬液和 10 μl 台盼蓝染色并使用血细胞计数板进行计数。台盼蓝排斥法可用于鉴定活细胞。</li>
 <li>加入 4x106 将INOF细胞加入已接种于聚HEMA包被板中的培养基中。使用适量的新鲜INOF-GM补足培养基体积至20 ml，并在 37 °C，5% CO₂2细胞在24小时内开始聚集形成多细胞球体。可通过相差显微镜观察球体的形成过程。 
 在大规模培养条件下，准确计数球状体数量较为困难，但我们估计在接种 4x10⁵ 个细胞时可获得 50–100 个球状体。6 基质细胞被接种。类球体的大小通常在80-250 μm.</li>
 <li>每2-3天更换一次类球体培养液：将培养板置于超净台内放置的移液管上，使其倾斜静置，让类球体充分沉降，此过程可能需要长达20分钟。随后用5 ml移液管小心吸除废液，保留约4 ml培养基，注意避免吸走类球体。加入16 ml新鲜INOF-GM培养基，重新放回培养箱中继续培养。</li>
 <li>第7天，将上皮细胞加入成纤维细胞球体中，以建立异质共培养体系，具体步骤如下。通过胰蛋白酶消化法（如3.4–3.5节所述）制备卵巢上皮细胞（表型正常或已转化）悬液。使用血细胞计数板测定细胞浓度。用INOF-GM洗涤一次，以避免上皮细胞生长培养基中的任何生长因子被带入后续体系。 
 在本实验室中，通过经患者知情同意，收集因全腹式子宫切除术或全腹腔镜下子宫切除术联合双侧输卵管卵巢切除术而切除的卵巢组织，获取正常的卵巢表面上皮细胞（OSEC）系。使用无菌细胞刷刷取卵巢表面以收集上皮细胞。建立原代细胞系后，进行转导处理 hTERT 采用上述方法。有关OSEC在二维、三维条件下的培养以及OSEC永生化的详细步骤可参见文献10和11。</li>
 <li>为形成异质类球体，首先单独对成纤维细胞类球体培养物进行换液培养。随后将1×10⁶个肿瘤细胞接种至成纤维细胞类球体培养物中。6 成纤维细胞与上皮细胞以4:1的比例混合，将异质性球体培养于INOF-GM培养基中。</li>
 <li>每2-3天更换一次培养基，继续共培养异型细胞14天。</li>
</ol>
4. 成像与分子分析的处理
<ol>
 <li>可采用多种不同技术对异质性类球体进行分析。进行成像时，建议使用 25 ml 移液管从培养皿中收获类球体。缓慢移液可最大程度减少剪切力对类球体结构的破坏。随后可用 PBS 清洗类球体，并在 100 × g 条件下轻柔离心 10 分钟进行沉淀；较高的离心力可能损伤类球体。或者，也可将培养物转移至 50 ml 离心管中静置沉降，然后移除生长培养基。
 <ol>
 <li>对于免疫组织化学分析，使用中性缓冲福尔马林在室温下固定类球体 30 分钟。将类球体离心沉淀后，用 70% 乙醇替换福尔马林。采用与人类组织相同的标准流程将其处理并包埋于石蜡中。石蜡包埋的类球体可切片，并使用苏木精-伊红染色或标准免疫组织化学方法对特定分子标志物进行染色（图 3）。</li>
 <li>或者，将 PBS 清洗后的类球体用 4% 多聚甲醛（溶于 PBS 中）固定，包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并迅速冷冻以进行冰冻切片和免疫荧光染色。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>对于分子分析，可收获类球体，离心沉淀并在 PBS 中洗涤两次，随后裂解细胞以提取 DNA、RNA 或蛋白质。</li>
 <li>对于流式细胞术分析，可将类球体用 PBS 清洗，并在 37 °C 条件下通过胰蛋白酶或 Accutase 消化将其解离。操作时，将含有类球体的 Falcon 管浸入水浴中以促进胰蛋白酶消化。使用 1 ml 移液枪头反复吹打溶液可促进类球体完全解离为单细胞悬液。注意避免过度消化细胞。</li>
</ol>
用等体积的培养基中和反应，并将细胞悬液通过40-70 μm细胞筛以去除细胞团块。离心收集细胞，用PBS洗涤，计数后将所需数量的细胞重悬于FACS缓冲液中。根据生产商说明书对细胞进行染色。
5. 代表性结果
该方法可广泛应用于多种研究领域，既可用于正常卵巢生物学的研究，也可用于卵巢癌起始过程的研究。与使用商业化细胞外基质凝胶构建的三维培养体系相比，该方法的一个主要优势在于，正常卵巢成纤维细胞能够产生构成类球体核心的细胞外基质。根据我们的经验，由正常卵巢成纤维细胞所产生的基质成分具有异质性，且比任何商业化基质凝胶更接近卵巢组织天然的细胞外基质。在本实验室中，我们已使用部分转化的上皮细胞 体外 使用明确的遗传元件（例如 CMYC 过表达）并将这些细胞与正常及衰老的卵巢成纤维细胞共培养，以模拟绝经后卵巢中早期卵巢癌的微环境。我们的数据表明，衰老的微环境可促进肿瘤样特征（例如 增殖）部分转化的上皮细胞（图3），而正常的微环境则抑制肿瘤发生发展 8我们的实验室及其他研究团队也采用过类似方法来构建正常卵巢上皮细胞模型 9，输卵管上皮细胞，肿瘤发生进展的逐步模型10以及卵巢癌和子宫内膜癌细胞系 11-13 作为同型类球体培养物。我们观察到，当细胞以单层形式培养时，正常细胞和恶性细胞的某些组织学特征无法被检测到，而当细胞转为类球体培养时，这些组织学特征得以恢复。例如，在透明细胞卵巢癌细胞系的三维培养中，可以检测到透明细胞卵巢癌的组织学特征（图4，但在相同细胞的单层培养中则不表现出此特性。此外，与传统二维单层培养的相同细胞相比，三维培养的细胞更能准确反映原代组织中组织特异性的蛋白质表达模式。 9-11这些用于构建正常及恶性卵巢组织模型的方法，也为发现和功能分析新的候选卵巢癌肿瘤抑制基因、癌基因以及其他可能与疾病发生相关的分子生物标志物提供了有价值的工具。 10,14.
<img alt="三维细胞培养过程、包被烧瓶、成纤维细胞生长、上皮细胞添加、分子分析" src="/files/ftp_upload/4206/4206fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 三维异质共培养方案的示意图。 组织培养烧瓶使用1%聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（polyHEMA）溶液包被两次，并静置干燥。使用前，将包被有polyHEMA的塑料表面用1×PBS洗涤。将永生化正常卵巢成纤维细胞（4×106个细胞）以20 ml生长培养基接种至烧瓶中。连续培养7天，观察类球体的形成与生长情况。随后，向成纤维细胞类球体培养物中接种1×106个上皮细胞，两种细胞类型共同培养14天，之后收获多细胞类球体并进行后续应用（分子分析、成像等）。
<img alt="显示细胞荧光染色的显微镜图像：FSP/DAPI、Ck7/DAPI、VIM/DAPI，放大倍数200倍。" src="/files/ftp_upload/4206/4206fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. hTERT 永生化正常卵巢成纤维细胞的免疫荧光染色。 原代正常卵巢成纤维细胞（Pr NOFs）和永生化正常卵巢成纤维细胞（INOFs）均表达成纤维细胞特异性蛋白（FSP），不表达细胞角蛋白-7（Ck-7），并表达波形蛋白（VIM）。目标标记物显示为绿色，DNA经DAPI染色显示为蓝色，细胞质经伊文思蓝复染显示为红色。
<img alt="Histology comparison of day 21 INOF spheroids; H&amp;E stain, MIB1/pan-CK stain, and cell count graph." src="/files/ftp_upload/4206/4206fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
 图3. 间质细胞与上皮细胞共培养的免疫组织化学检测。 左图：正常卵巢成纤维细胞球体单培养，经苏木精和伊红染色。正常卵巢成纤维细胞在三维培养条件下单独培养时，形成由梭形细胞和丰富细胞外基质构成的球体。右图：正常卵巢成纤维细胞经过氧化氢处理以诱导衰老。部分转化的卵巢上皮细胞（IOSEcmyc向7天大的衰老成纤维细胞球体中加入细胞。经过额外14天的共培养后，将球体固定、石蜡包埋、切片，并进行双重染色，分别标记增殖标志物（MIB1，粉红色）和用于区分两种细胞类型的上皮标志物（广谱细胞角蛋白，棕褐色）。以伊红作为复染剂，球体核心未染色的成纤维细胞清晰可见（星号标记）。下图：双染共培养体系中上皮细胞增殖的定量分析。本研究使用了来自三位不同患者的永生化卵巢表面上皮（IOSE）细胞系（IOSE4、IOSE11 和 IOSE19）。衰老成纤维细胞（SEN）促进共培养的IOSE细胞增殖cmyc 细胞在衰老诱导后（衰老期，SN）显著多于衰老诱导前的相同细胞（前衰老期，PSN）。未进行衰老诱导的亲本IOSE细胞 CMYC 过表达在与PSN或SEN成纤维细胞共培养时，增殖无显著差异。这些数据表明，在我们的实验条件下 体外 共培养模型，卵巢间质中的衰老过程可能促进卵巢癌的发展 11*P≤0.05，双尾配对T检验。
<img alt="透明细胞型卵巢肿瘤H&amp;E染色及细胞系球体，电子显微镜；显微分析，20X-40X放大倍数。" src="/files/ftp_upload/4206/4206fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
 图4. 三维培养细胞的组织学特征反映原发组织特征。(A) 透明细胞型卵巢癌显示出典型的透明细胞结构，当透明细胞型上皮性卵巢癌（EOC）细胞系在塑料培养皿上生长时，这些结构消失；但当相同细胞以三维球体形式培养时，可观察到类似结构（B）。(C) 正常卵巢上皮细胞在球体培养14天后的扫描电子显微照片。表面微绒毛可见（箭头）。(D) 浆液性卵巢癌细胞系球体，处于培养状态。(A,B) 对石蜡包埋肿瘤组织或三维球体切片进行苏木精和伊红染色；(C) 扫描电子显微镜；(D) 相差显微镜。球体可呈圆形（虚线圆）或不规则形状，如图像左侧所示结构。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>培养皿/板规格</td>
 <td>聚HEMA体积（需涂布两次）</td>
 <td>培养基终体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6孔板</td>
 <td>3 ml</td>
 <td>5-7 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12孔板</td>
 <td>1.5 ml</td>
 <td>2 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24孔板</td>
 <td>500 μl</td>
 <td>1.5 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48孔板</td>
 <td>250 μl</td>
 <td>500 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96孔板</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>200 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P100培养皿</td>
 <td>4-5 ml</td>
 <td>20 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P60培养皿</td>
 <td>2-3 ml</td>
 <td>5-7 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>F25培养瓶</td>
 <td>2-3 ml</td>
 <td>7 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>F75培养瓶</td>
 <td>4-5 ml</td>
 <td>20-30 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>F175培养瓶</td>
 <td>15 ml</td>
 <td>30-50 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 聚HEMA包被和3D培养的推荐体积。

<ol><li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J. Clin. , (2011).</li>
<li>Office for National Statistics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Statistics+registrations%3A+registrations+of+cancer+diagnosed+in+2008%22">Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008</a>. , England. (2011).</li>
<li>Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+type+and+substage+predict+survival+in+stage+I+and+II+ovarian+carcinoma%3A+insights+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications.</a> Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).</li>
<li>Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+subtypes+are+different+diseases%3A+implications+for+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies.</a> PLoS Med. 5, e232(2008).</li>
<li>Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer%3A+can+we+make+the+clinical+diagnosis+earlier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier.</a> Cancer. 104, 1398-1407 (2005).</li>
<li>Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impartial+comparative+analysis+of+measurement+of+leukocyte+telomere+length%2FDNA+content+by+Southern+blots+and+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR.</a> Nucleic Acids Res. 39, e134(2011).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repeat+amplification+protocol+%28TRAP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP.</a> Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
<li>Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+neoplastic+transformation+of+partially+transformed+ovarian+epithelial+cells+in+a+three-dimensional+model+of+early+stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer.</a> Neoplasia. 12, 317-325 (2010).</li>
<li>Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+modelling+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells.</a> Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).</li>
<li>Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+genetic+and+clinical+heterogeneity+in+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers.</a> Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).</li>
<li>Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+biology+models+of+ovarian+and+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer.</a> Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).</li>
<li>Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+description+of+a+3D+in+vitro+model+for+the+study+of+epithelial+ovarian+cancer+%28EOC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC.</a> Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).</li>
<li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases%3A+Biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li>
<li>Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcell-mediated+chromosome+transfer+identifies+EPB41L3+as+a+functional+suppressor+of+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers.</a> Neoplasia. 12, 579-589 (2010).</li>
<li>Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+pathogenesis+of+serous+ovarian+cancer+and+its+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact.</a> J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).</li>
<li>Kurman, R. J., Shih, I. eM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+extraovarian+origin+of+epithelial+ovarian+cancer--shifting+the+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm.</a> Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

早期上皮性卵巢癌（EOC）的生物学特性尚不明确。多年来，该领域的主要障碍之一可能是对疾病组织特异性起源以及微环境在EOC发生中作用的重要性的认识不足。近年来，人们逐渐认识到EOC是一种具有多种不同组织病理学亚型的异质性疾病，不同亚型可能起源于不同的细胞来源。例如，现有数据表明，高级别浆液性EOC可能起源于输卵管分泌性上皮细胞和卵巢表面上皮细胞；至少部分子宫内膜样和透明细胞EOC被认为起源于卵巢子宫内膜异位症（子宫内膜异位囊肿）；而黏液性EOC可能起源于卵巢旁或输卵管旁的移行型上皮15,16。然而，针对这些组织学亚型中的任何一种，目前可用于研究疾病进展的体外和体内模型都非常有限。体外构建EOC异质性模型以研究肿瘤间质-上皮相互作用及其相关卵巢癌发展过程中的微环境，更是尚处于初步探索阶段的研究领域。肿瘤间质可能不仅是肿瘤生物标志物的来源，也是潜在的新型治疗靶点。因此，建立并应用EOC异质性模型，可能对于识别与早期疾病相关的新型生物标志物至关重要，这些标志物可被用于筛查和早期诊断项目；同时也可能有助于发现新的可靶向治疗靶点，从而改善EOC患者的治疗方案。
<p...

<table><tbody><tr><td>聚羟基乙酸，适用于细胞培养</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用无菌水</td><td>VWR</td><td>12001-356</td><td></td></tr><tr><td>MCDB105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-hygro-hTERT</td><td>Addgene</td><td>1773</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>12001-766</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（40 或 70&amp;mu;m)</td><td>VWR</td><td>21008-949&lt;br/&gt; 21008-952</td><td></td></tr><tr><td>抗成纤维细胞表面蛋白抗体，克隆 1B10</td><td>Sigma</td><td>F4771</td><td></td></tr><tr><td>广谱细胞角蛋白抗体（C11）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8018</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene（六亚甲基溴化铵）</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>TeloTAGGG 端粒酶 PCR ELISA&lt;sup&gt;PLUS&lt;/sup&gt;</td><td>罗氏</td><td>12013789001</td><td></td></tr><tr><td>TeloTAGGG 端粒长度检测</td><td>罗氏</td><td>12209136001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;JoVE 内容&quot;&gt;&lt;strong&gt;表1. &lt;/strong&gt; 本研究中提及的试剂与设备&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

异质性三维 体外 卵巢癌起始与进展过程中间质-上皮相互作用的建模

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

上皮性卵巢癌（EOC）是西方社会中导致妇科恶性肿瘤死亡的首要原因。尽管外科治疗不断进步，基于铂类的化疗方案也有所改善，但过去四十多年中，EOC的生存率几乎没有提高1,2。虽然I期肿瘤的5年生存率&gt;85%，但III/IV期疾病的生存率却&lt;40%。因此，若能在更早期、更具可治疗性的阶段发现肿瘤，EOC的高死亡率将可显著降低3-5。目前，早期疾病发展的分子遗传学和生物学基础仍知之甚少。更具体而言，关于肿瘤起始过程中微环境的作用了解甚少；但EOC的已知风险因素（例如年龄和生育史）提示微环境在EOC的早期发生中起着关键作用。因此，我们建立了正常卵巢和早期卵巢癌的三维异质性模型。对于正常卵巢模型，我们将经逆转录病毒转导人端粒酶全酶催化亚基（hTERT）而永生化的正常卵巢表面上皮细胞（IOSE）与正常间质成纤维细胞（INOF）&nbsp;进行共培养，以延长这些细胞在体外的生命周期。为了模拟卵巢上皮细胞转化的最早阶段，在IOSE细胞中过表达CMYC癌基因，并再次与INOF细胞共培养。这些异质性模型被用于研究衰老和细胞衰老对上皮细胞转化和侵袭的影响。本文描述了构建这些三维模型的方法学步骤；这些方法不仅适用于正常卵巢和卵巢癌组织的建模，也可用于研究其他依赖间质细胞与上皮细胞相互作用来维持组织稳态及疾病发展的组织类型。

我们描述了建立 体外 包含卵巢成纤维细胞与正常卵巢表面上皮细胞或卵巢癌上皮细胞的异质性三维模型。我们探讨了利用这些模型研究卵巢癌发展过程中发生的间质-上皮相互作用。

上皮性卵巢癌（EOCs）是西方社会中妇科恶性肿瘤致死的主要原因。尽管在外科手术……

以下实验的总体目标是构建卵巢癌早期发展阶段的三维典型模型。首先，建立来源于原代正常卵巢上皮细胞和成纤维细胞组织的 Hturt 永生化细胞系。随后，通过在三维 S 类球体模型中对上皮细胞和间质细胞系进行共培养，以重建体内卵巢中存在的组织结构及复杂的细胞间相互作用。接着对类器官培养物进行固定和染色，并分析特定标志物的表达，以研究间质-上皮相互作用的分子特征。结果表明，三维典型模型中基质细胞区室的改变可影响共培养上皮细胞的表型。三维典型模型有助于解答卵巢癌研究领域的一些关键问题，例如探索该疾病的起源，以及阐明基质微环境在肿瘤发生和发展中的作用。相较于其他三维培养方法，这些技术的应用还可拓展至疾病诊断与治疗领域。该技术可应用于更广泛的细胞培养体积及后续应用。例如，3D同型培养可用于体外药物筛选。该方法也可拓展至其他模型系统，如用于研究其他类型的实体瘤或良性疾病。将新鲜的卵巢组织置于添加了额外抗生素和抗真菌剂的永生化正常卵巢成纤维细胞培养基中，运送至细胞培养实验室。用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗样本三次，以去除仍松散附着在组织上的任何上皮细胞。接着，将样本连同PBS一起转移至一个干净的P 100培养皿中。使用无菌器械，将组织转移至第二个干燥且洁净的P 100培养皿中。将组织切成0.5平方厘米的碎片，每块放入一个独立的P 100培养皿中。继续将组织切割成小于1平方毫米大小的碎片。然后加入20毫升INOF GM培养基，并通过相差显微镜观察细胞生长情况。在24小时内确认细胞已贴壁。使用相差显微镜监测细胞生长，细胞通常在24小时内贴附于培养皿。一周后，通过抽吸去除未贴壁的组织，更换培养基，此后在细胞集落大小约为500微米的一至三周内，每周更换培养基两次。使用三联管和包被的克隆环分离克隆。为确认细胞为100%成纤维细胞，取部分细胞系接种于玻璃盖玻片上，并对成纤维细胞标志物、上皮细胞标志物以及内皮细胞标志物进行免疫荧光染色。在对 H Turt 传代细胞进行逆转录病毒转导前一天，将正常卵巢成纤维细胞从一个 P 100 培养皿传代至三个 P 100 培养皿中。预制成的病毒上清液可通过商业途径购买，或按照标准共转染 HEC 2 9 3 T 细胞的实验方案在实验室内部制备。制备聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（poly Hema）溶液时，称取 1.5 克 poly hema，放入无菌瓶中。加入95毫升分子生物学级无水乙醇和5毫升细胞培养级蒸馏水。将聚HEMA溶液置于65摄氏度水浴中，直至完全溶解。用新配制的聚HEMA溶液包被组织培养皿。在超净工作台内将细胞培养皿风干。对于较大尺寸的培养皿或培养瓶，可使用摇床轻轻摇动，以确保表面包被均匀。若多聚赖氨酸溶液干燥过快，表面将无法保持平整。如有需要，可在进行三维培养之前对成纤维细胞进行预处理，例如，为诱导细胞衰老，可用亚致死剂量的过氧化氢预处理细胞。在体外复苏并扩增诱导型成纤维细胞（INOF）和上皮细胞培养物，以获得足够数量的细胞用于建立三维异位类器官。用 PBS 洗涤五分钟后，向聚羟基乙酸（poly hema）培养板中加入 15 毫升培养基。同时，向永生化的正常卵巢成纤维细胞中加入胰蛋白酶，使其从培养皿上脱落。3至5分钟后，加入等体积的培养基中和胰蛋白酶，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于5 mL培养基中，通过反复吹打或轻轻涡旋充分混匀。然后取10微升样品，用台盼蓝计数法测定活细胞数量。将400万个INOF细胞加入已分装至聚HEMA包被板中的培养基中。将培养基体积补至20毫升，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。通过相差显微镜监测细胞聚集形成多细胞类固醇结构，以确定每隔两到三天重新换液的时间点。将培养板倾斜静置于移液器上，使类球体沉降，然后用5毫升移液器小心移除约16毫升的耗尽培养基。在第7天，向培养物中加入16毫升新鲜培养基，并放回培养箱。通过将上皮细胞添加到成纤维细胞PHE中来建立异型培养物。首先，在对细胞计数后，按照前述方法用胰蛋白酶制备卵巢上皮细胞悬液。用无生长因子的GM培养基洗涤一次，以防止上皮细胞培养基中的任何生长因子被带入。在补充成纤维细胞OID培养物的培养基后，以上皮细胞与成纤维细胞4:1的比例加入上皮细胞。在无生长因子的GM培养基中，每隔两到三天对异位OID进行换液，持续额外培养14天。进行免疫组织化学染色时，使用中性缓冲甲醛固定PHE，离心收集PHE并用70%乙醇替换甲醛。随后采用适用于人体组织的标准方案将其处理成石蜡包埋样本。石蜡包埋的类固醇样本可切片，并使用免疫组织化学方法进行苏木精和伊红（H&E）染色或特定分子标志物的染色。或者，用 PBS 清洗类固醇，然后在 4% 多聚甲醛中固定。随后将样品包埋于 OCT 介质中，速冻以进行冰冻切片及免疫荧光染色，再通过流式细胞术进行分析。用 PBS 清洗类固醇，并在 37 摄氏度下通过胰蛋白酶或 Accutase 消化进行解离。使用1毫升移液枪头反复吹打溶液，可促进类固醇完全解离成单细胞悬液。注意避免过度吹打导致细胞损伤。用等体积的培养基中和反应，并将细胞悬液通过40至70微米的细胞筛网以去除细胞团块。随后离心收集细胞，用PBS洗涤，计数后将所需数量的细胞重悬于染色缓冲液中，并根据制造商说明书进行染色。在本实验室中，我们对卵巢上皮细胞进行了部分转化，并将这些细胞与正常及衰老的卵巢成纤维细胞共培养，以模拟卵巢癌早期发展阶段。在绝经前卵巢中，对h hert永生化正常卵巢成纤维细胞进行免疫荧光染色显示，原代正常卵巢成纤维细胞和永生化正常卵巢成纤维细胞均表达成纤维细胞特异性蛋白，但不表达细胞角蛋白7，且表达menton。在三维培养条件下单独培养的正常卵巢成纤维细胞形成PHE，呈现纺锤形形态并富含细胞外基质。在此实验中，正常卵巢成纤维细胞经七天过氧化氢处理以诱导衰老，随后与部分转化的卵巢上皮细胞共培养14天。为了区分这两种细胞类型，对获得的类固醇进行免疫染色，以mim one作为增殖标志物，pan cytokeratin作为上皮标志物。数据分析表明，衰老的微环境会促进部分转化的上皮细胞呈现肿瘤性特征，而正常的微环境则抑制肿瘤性进展；当细胞以单层培养时无法检测到的正常细胞与恶性细胞的组织学特征，在三维培养中得以恢复。例如，当细胞转入球体培养时，透明细胞卵巢癌的组织学特征可在透明细胞卵巢癌细胞系的三维培养中被检测到，但在相同细胞的单层培养中则无法检测到。观看本视频后，您应能充分了解如何建立三维典型培养体系，以研究上皮细胞与间质细胞在肿瘤早期发生过程中的相互作用。在建立三维培养体系时，应根据后续应用调整细胞数量，并考虑到处理过程中可能发生的材料损失。掌握后，可按照本方案在一小时内建立3D培养体系。还可采用其他方法，如流式细胞术联合基因表达微阵列分析，以检测在3D典型培养条件下发生但在单层培养条件下无法检测到的全局性基因表达变化。这将有助于解析在3D核心培养微环境中特异性发生的双向信号通路。

heterotypic-three-dimensional-vitro-modeling-stromal-epithelial

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

异型三维<em在体外</em&gt;卵巢癌的发生和发展过程中的间质 - 上皮细胞相互作用模型

本文所述的间皮清除实验利用荧光标记的细胞和延时视频显微镜技术，对卵巢癌多细胞球状体与间皮细胞单层之间的相互作用进行可视化观察和定量测量。该实验模拟了卵巢癌转移的早期步骤。...

体外 腹膜间皮清除实验：模拟卵巢癌转移早期步骤

在本视频中，我们演示了以下内容的开发过程  一个 体外...

在腹膜腔衬里中模拟卵巢癌转移：一种建立腹膜衬里体外三维模型的方法

本文介绍一种三维共培养方案，可用于研究多细胞相互作用以及细胞外基质对癌细胞行为的调控作用。在此实验模型中，将癌细胞培养在嵌有人大肠癌相关成纤维细胞的胶原凝胶上。...

三维共培养模型用于肿瘤-间质相互作用研究

在此，我们介绍一种构建三维的方案 体外 由原代人腹膜间皮细胞和成纤维细胞与细胞外基质分层构建的腹膜腔内衬模型，用于研究卵巢癌细胞的黏附、侵袭和增殖。...

模拟人类腹膜腔类器官培养中卵巢癌扩散的早期步骤

我们展示了一种生成三维乳腺癌替代模型的方法，该模型可通过灌注生物反应器系统进行培养，以提供氧气和营养物质。在培养完成后，将替代模型固定并经处理制成石蜡包埋样本，用于评估相关参数。本文详细说明了其中一项参数——细胞密度的评估方法。...

制备与分析 体外 三维乳腺癌替代模型

为了在生理相关模型中研究卵巢肿瘤的进展，将多细胞球体在微流控装置中于模拟流体流动条件下进行培养。该动态三维模型模拟了卵巢癌转移发生的腹腔内环境，包含其中的细胞和机械组分。...

模拟卵巢癌多细胞球体在动态三维腹膜微装置中的行为

卵巢癌干细胞（OCSC）负责肿瘤的发生、复发、治疗耐药性和转移。OCSC的血管微环境被认为可促进OCSC的自我更新，从而导致化疗耐药。本实验方案为体外建立可重复的OCSC血管微环境模型提供了基础。.

利用三维共培养系统 NICO-1 评估卵巢癌干细胞样细胞的促血管生成特性

本方案描述了一种癌细胞与大网膜相互作用的三维（3D）ex vivo...

一个 离体 利用人网膜建立卵巢癌腹膜转移模型

迫切需要能够模拟异质细胞间串扰的三维癌症模型来研究癌症转移。本研究展示了在有支架和无支架环境中构建异质多细胞间质-上皮模型的方法，可用于研究细胞侵袭行为及空间分布特征。...

无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立，到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的遗传特征，再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内...

由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

学习构建三维异型卵巢癌模型，通过共培养卵巢成纤维细胞与上皮细胞研究肿瘤微环境中基质-上皮相互作用。该方法有助于揭示卵巢癌早期发生机制并探索潜在治疗策略。

异质性三维体外卵巢癌起始与进展过程中间质-上皮相互作用的建模

探索更多视频

异质性三维 体外 卵巢癌起始与进展过程中间质-上皮相互作用的建模

探索更多视频

异质性三维体外卵巢癌起始与进展过程中间质-上皮相互作用的建模