区分功能基因表达的作用，通过骨髓移植免疫和非免疫细胞在小鼠结肠炎
2012年10月1日
骨髓移植提供了一种方法来改变的骨髓衍生细胞的基因型。如果感兴趣的基因的表达在两个骨髓来源的细胞和非骨髓来源的细胞，骨髓移植可以改变到一个不同的基因型的骨髓来源的细胞，不改变非骨髓来源的细胞的基因型。
本视频中演示的实验的总体目标是评估抗菌肽 lyin 是否在改善硫酸葡聚糖诱导的小鼠结肠炎中发挥作用。这是通过将野生型小鼠的骨髓注射到辐照的合法和敲除小鼠中，以及将敲除小鼠的骨髓注射到辐照野生型小鼠中来实现的。移植的骨髓将在供体基因型的受体中产生新的血细胞。
然后在 4 周后将受体小鼠暴露于硫酸葡聚糖以诱导结肠炎。通过流式细胞术验证移植成功，通过组织学评估结肠组织损伤。获得的结果表明，当野生型骨髓移植到敲除小鼠体内时，结肠炎得到改善。
相反，当敲除骨髓移植到野生型小鼠中时，结肠炎会恶化。该方法可以帮助回答确定炎症或感染中骨髓来源细胞或非骨髓来源细胞的基因表达的关键问题。本实验建议使用 C 57、black six、野生型和 C 诱导的敲除小鼠，以便能够追踪野生型小鼠和敲除小鼠。
骨髓移植后的供体细胞。使用 CD 45.1 小鼠代表野生型小鼠，使用 CD 45.2 代表敲除小鼠。此处显示的图表描述了实验设置，每组分配 5 只供体小鼠和 10 只受体小鼠。
对于 A 组和 B 组，将骨髓从野生型小鼠移植到基因敲除小鼠。对于 C 组和 D.骨髓将从敲除小鼠移植到野生型，C 组仅对 E 和 F 诱导结肠炎.移植将从野生型到野生型，对于G组和H组， 移植将从敲除到敲除。为了准备供体骨髓以转移给受照射的小鼠，首先在生物安全柜中从处死小鼠的骨骼中提取骨髓。
使用无菌解剖器械暴露出没有附着肌肉和韧带的肱骨、股骨、胫骨和腓骨，并将它们转移到培养皿中。切开骨头的两端，露出红色的骨髓。然后用镊子抓住其中一根骨头。
用 3 毫升注射器和 25 号针头用冷 PBS 将红骨髓冲洗到另一个培养皿中。然后从另一端冲洗骨头以产生更多的骨髓细胞。对每个骨骼重复此过程。
汇集野生型骨髓并分别敲除小鼠。使用带有 18 号 1/2 英寸针头的 6 毫升注射器，通过反复抽吸和喷射来打破红骨髓栓塞。然后使用血清移液器将收集的骨髓转移到 50 毫升锥形管中。
转移完所有骨髓后，在 4 摄氏度下以 740 G 的离心速度旋转骨髓 5 分钟。离心后，弃去上清液，涡旋 5 至 10 秒重悬沉淀。向沉淀中，再次向供体小鼠涡旋中加入 5 mL 1 XRBC 裂解缓冲液，持续 5 秒，并在室温下孵育整整 3 分钟。
三分钟后，向每管中加入 20 mL 冷 PBS，倒置混合以停止裂解。然后，通过 40 微米的细胞过滤器将内容物倒入新的 50 毫升锥形管中。用 5 ml PBS 冲洗原管，并将溶液转移到细胞过滤器中。
继续收集锥形管中的流出物。然后用 PBS 将体积调至 50 毫升，倒置混合。接下来，使用血细胞计数器通过 trian 蓝色排除法确定活细胞计数。
确定细胞计数后，在 4 摄氏度下以 913 倍 G 的离心力离心骨髓细胞 5 分钟。旋转后，根据总细胞计数去除上清液。Resus 将沉淀以每毫升 10 至第 8 个细胞的一次 10 倍悬浮在 PBS 中。
骨髓细胞现在可以转移到受辐照的受体小鼠中。如随附文件所述，本实验的受体野生型和基因敲除小鼠已用 1000 rad 辐照，小鼠在照射后 4 至 24 小时饲养在无病原体的设施中，在加热灯下的加热垫上加热受体小鼠以注射供体骨髓。将一只受体小鼠置于限制器中，用 70% 乙醇擦拭尾巴，对注射部位进行消毒，并促进局部血管舒张，便于注射。
使用带有 28 号半号针头的胰岛素注射器，在注射后将 1 到 200 微升的剂量注射到每只小鼠的尾静脉中，以 1 到 200 微升的剂量向第七个细胞注射 10 次。在注射后的前 4 周内，将小鼠与最多三只其他注射的小鼠一起放在笼子中。将注射的受体小鼠维持在装有含有抗生素磺胺修剪的水的高压灭菌笼中。
这让动物有时间恢复免疫力，每四天更换一次笼子、经过抗生素处理的水和食物，以保持卫生。照射和骨髓移植后 4 周，改用不含抗生素的普通水，并再维持小鼠两周以恢复正常的肠道菌群。骨髓注射后 6 周，测量初始体重以诱发结肠炎。
给结肠炎实验组小鼠在饮用水中加入 5% 硫酸葡聚糖。五天后，将四只小鼠的外周血汇集在 vacutainer 肝素涂层管中，并将其置于冰上。然后在 1.5 毫升微量离心管中，将 300 微升血液与 300 微升细胞染色混合，缓冲并将血液分装到五个流式细胞术试管中，每个试管标记 1 至 5 个，每个试管在冰上加入 100 微升。
牺牲小鼠后，再次测量体重并计算变化。解剖结肠组织并在福尔马林中起搏以进行 h 和 d 染色。然后像以前一样获得骨髓细胞。
将重悬的骨髓分成 5 个微量离心管，每个离心管标有 1 到 5 个 100 毫升。在准备通过流式细胞术进行分析时，如随附文件所述，在黑暗中为每根试管制备抗体混合物，标记为 1 号的血液和骨髓样品将用作对照，不会是染色的血液和骨髓样品。标记的 2 号将用 fitzy 同种型对照、PE 同种型对照和 CD 16 slash 32 封闭溶液染色。
这些同种型对照用于确认一抗结合样品的特异性。标记的数字 3 将用 FZ CD 45.1 和 CD 16 斜线 32 染色。标记为 4 号的封闭溶液样品将用 CD 45.2 和 CD 16 斜线 32 染色。
阻塞解决方案。单色标记可以揭示血液或骨髓中供体或受体细胞的存在。显然，标记为 5 号的样品将对 CD 45.1、CD 45.2 和 CD 16 斜线 32 进行染色。
此处的双色标记显示血液或骨髓中供体细胞和受体细胞的相对比例。将 5 微升抗体混合物 2 和 5 添加到各自的样品管中。然后将 3 微升抗体混合物 3 和 4 添加到各自的样品管中。
将所有试管在冰上孵育 30 分钟。孵育后，向每个试管中加入 2 毫升、1 个 XRBC 裂解缓冲液。然后将样品在黑暗中的冰上再孵育 15 分钟。
以 350 倍 G 离心细胞，在 4 摄氏度下旋转 5 分钟。离心后，去除上清液，在黑暗中用 500 μL 细胞染色缓冲液重悬沉淀。然后短暂地涡旋。
接下来，对血液和骨髓样品进行免疫染色流式细胞术。选择 FZ 代表野生型 CD 45.1，选择 PE 代表敲除 CD 45.2。使用 Flo Joe 的软件分析流式细胞术结果。
计算拟合 E 与 PE 比率或 PE 与拟合 e 比率的比率，以确定供体基因型是否是血液和骨髓中的优势基因型。该图像显示了组织学正常和 DSS 结肠炎的结肠样本 h 和 e 图像。组织学图像根据黏膜组织损伤和中性粒细胞浸润到黏膜和黏膜下组织进行评分。
因此，较高的组织学评分表明结肠炎更严重，以测试赖因是否在预防结肠炎中发挥作用。如本视频所述，在野生型小鼠和基因敲除小鼠之间交换骨髓。然后评估和评分组织学，如图所示。
当将敲除小鼠骨髓引入照射的野生型小鼠中时，组织学评分显着增加。相反，当野生型骨髓被引入基因敲除小鼠时，评分显著降低。这些数据表明，来自骨髓来源细胞的内源性 C 具有抗炎作用并改善结肠炎，以验证这些小鼠的移植是成功的。
还对移植后小鼠的骨髓和血液进行了流式细胞术。野生型骨髓对 Fitz CD 45.1 有强烈染色，但对 PE 没有，CD 45.2 如此处所示，敲除型骨髓对 PE 有强烈染色，但对 Fitz 没有强烈染色，如图所示。然而，移植后，接受敲除骨髓的野生型小鼠的骨髓和血液均对 PE 进行强烈染色，但对 Fitz 没有染色，这表明染色细胞的主要群体来自供体。
同样，来自接受野生型骨髓的敲除小鼠的骨髓和血液对 fitzy 但未进行 pe 强烈染色，再次证实主要染色群体来自供体。观看此视频后，您应该能够进行骨髓移植实验，并且应该能够通过骨髓来源的细胞改变结肠炎。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究通过骨髓移植探讨抗菌肽lyin在减轻葡聚糖硫酸盐诱导的小鼠结肠炎中的作用。通过移植野生型和敲除型小鼠的骨髓，实验评估了对结肠炎严重程度的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 移植生物学
背景
- 骨髓移植可以改变骨髓来源细胞的基因型。
- 结肠炎是研究炎症性肠病的模型。
- 抗菌肽可能对炎症有治疗作用。
- 流式细胞术和组织学是验证和评估的关键技术。
研究目的
- 确定lyin是否可以改善结肠炎症状。
- 评估骨髓基因型对结肠炎严重程度的影响。
- 验证成功的骨髓移植。
使用的方法
- 将野生型和敲除型小鼠的骨髓注射到受体小鼠中，受体小鼠已经接受了辐射处理。
- 在移植四周后使用葡聚糖硫酸盐诱导结肠炎。
- 通过流式细胞术验证移植成功。
- 通过组织学分析评估结肠组织损伤。
主要结果
- 当野生型骨髓移植到敲除型小鼠中时，结肠炎症状减少。
- 通过流式细胞术确认了成功的骨髓移植。
- 组织学分析显示治疗小鼠的结肠组织损伤较少。
- 该研究支持lyin在结肠炎中的潜在治疗作用。
结论
- 骨髓移植可以有效地改变结肠炎中的免疫反应。
- Lyin可能是炎症性肠病治疗干预的有前景的候选。
- 需要进一步研究以探索这些效应背后的机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
This approach enables biopharma R&D to dissect cell-type-specific gene functions in inflammatory disease models, supporting target validation by isolating contributions from immune versus non-immune compartments. By using bone marrow transplantation with congenic markers, researchers can de-risk mechanistic hypotheses before investing in therapeutic modalities. The method provides predictive confidence in target selection by clarifying whether a gene of interest exerts its effect through hematopoietic or stromal pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by determining if a gene's role in colitis stems from bone marrow-derived cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through genotype swapping between donor and recipient mice.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular origin of gene expression in disease phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with known chimeric genotypes for downstream immune or epithelial screening assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility by tracking donor engraftment via CD45.1/CD45.2 flow cytometry.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation in colitis models where immune cell contribution is isolated.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling colitis in a system where gene expression can be compartmentalized to hematopoietic or non-hematopoietic cells.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating chimerism levels with histological colitis scores.
- Scientific Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by distinguishing whether target modulation requires immune cell targeting.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly when immune-mediated mechanisms are under investigation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating gene function to bone marrow-derived versus stromal compartments.
- Screening: Describes assay readiness through validated chimerism and reproducible colitis induction via DSS.
- Analytics: Highlights quantitative flow cytometry readouts of CD45.1/CD45.2 ratios to measure engraftment and enable group stratification.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by linking chimerism validation to histological outcomes in colitis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any gene of interest in immune cell-dependent disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through cellular resolution of gene function in inflammation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via congenic marker tracking and flow cytometry validation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying whether therapeutic targeting should focus on immune or non-immune cells.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on mechanistic clarity of target mechanism of action.
Implementation Considerations
- Required expertise in bone marrow harvest, irradiation, and hematopoietic cell transplantation.
- Instrumentation for flow cytometry to detect CD45.1 and CD45.2 chimerism in blood and bone marrow.
- Standardization across laboratories for irradiation dosing and engraftment validation thresholds.
- Adaptation considerations for different genetic backgrounds beyond C57BL/6.
- Practical limitation: incomplete engraftment necessitates chimerism tracking to confirm experimental validity.
