Name: 区分功能基因表达的作用，通过骨髓移植免疫和非免疫细胞在小鼠结肠炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 了解通过骨髓移植技术在小鼠结肠炎模型中区分免疫细胞与非免疫细胞功能基因表达的方法。本研究利用流式细胞术和组织学分析验证移植效果，为炎症性肠病治疗提供新思路。

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本工作由加州大学洛杉矶分校CURE中心的试点与可行性研究资助、美国克罗恩病和结肠炎基金会职业发展奖（#2691）以及美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所K01基金（DK084256）资助，资助对象为Hon Wai Koon。
骨髓照射操作由加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心人/鼠嵌合体核心设施的Bernard Levin和Scott Kitchen协助完成。流式细胞术操作由加州大学洛杉矶分校病毒载体核心设施协助完成。

1. 开始前的技术注意事项
<ol>
	<li>我们建议在实验中同时使用 C57/BL6 野生型小鼠和基因敲除小鼠，因为带有相应 CD 分子的小鼠可从主要的小鼠供应商处购买获得。</li>
	<li>由于在骨髓移植后难以追踪野生型小鼠和基因敲除小鼠来源的供体细胞，因此有必要使用 CD45.1 小鼠来代表野生型小鼠（CD45.1 C57/SJL WT 小鼠，Jackson Laboratories 货号 #002014）。</li>
	<li>大多数小鼠品系为 CD45.2 型。我们的基因敲除小鼠属于 CD45.2 基因型（也可选用 CD45.2 野生型小鼠，Jackson Laboratories 货号 #000664）。CD45.1 或 CD45.2 基因型的鉴定可通过本方案第 7 节所述的骨髓和外周血流式细胞术进行。</li>
	<li>经照射后的小鼠免疫功能受损，应将小鼠饲养于无病原体设施中。</li>
	<li>照射设备的操作需要特殊的安保许可和培训。为节省培训和审批所需时间，最好与拥有合格技术人员且能够操作照射设备的实验室合作。</li>
	<li>许多机构设有配备经验丰富的技术人员的流式细胞术实验室。为尽量减少流式细胞术操作中的问题，建议在开始实验前先与经验丰富的技术人员讨论您的流式细胞术实验方案。</li>
	<li>小鼠按如下方式分组（每组 10 只小鼠）：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组别</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>骨髓供体至受体</td>
			<td>处理方式</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>骨髓移植</td>
			<td>CD45.1 WT 至 CD45.2 KO</td>
			<td>DSS 结肠炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>饮水正常对照</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>骨髓移植</td>
			<td>CD45.2 KO 至 CD45.1 WT</td>
			<td>DSS 结肠炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>饮水正常对照</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>假手术</td>
			<td>CD45.1 WT 至 CD45.1 WT</td>
			<td>DSS 结肠炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>饮水正常对照</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>假手术</td>
			<td>CD45.2 KO 至 CD45.2 KO</td>
			<td>DSS 结肠炎</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>饮水正常对照</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
* 实验方案的简要示意图见图1。
2. 受体小鼠照射
<ol>
	<li>小鼠在无病原体环境中繁育和饲养。将小鼠放入经高压灭菌的辐照转盘中，每个转盘孔放置一只小鼠。将转盘放入辐照仪中，并确保转盘及其自身处于旋转状态。</li>
	<li>开启空气泵以进行通风。关闭辐照仪门并上锁。</li>
	<li>以1,000 rad（相当于10 Gy）剂量对小鼠进行约10分钟的辐照（具体时间取决于辐射源及其半衰期）。自此时间点起，辐照后的小鼠免疫功能受损，对感染的抵抗力减弱。辐照完成后，取出转盘并放入无菌容器中，转运至动物设施的生物安全柜内。应避免让小鼠暴露于外界环境，以最大限度降低感染风险。</li>
	<li>在生物安全柜中，将小鼠转移至经高压灭菌的小鼠笼具中，并铺有高压灭菌的垫料（每笼4只小鼠）。加入含磺胺甲噁唑-三甲氧苄啶（sulfatrim）悬浮液的新鲜无菌水——每100 ml水中加入3.12 ml。</li>
	<li>用水瓶外包裹铝箔，因为抗生素对光敏感。在将sulfatrim溶液加入笼具前，需充分摇匀溶液瓶。</li>
</ol>
3. 供体骨髓提取
<ol>
	<li>使用二氧化碳或异氟烷处死小鼠，随后将其浸入1:200的来苏尔溶液中。用70%乙醇喷洒小鼠以润湿皮肤，并解剖暴露骨骼。</li>
	<li>将解剖器械浸泡于70%乙醇中以进行消毒。</li>
	<li>在生物安全柜中进行解剖操作。使用无菌解剖器械暴露肱骨、股骨、胫骨和腓骨，去除附着的肌肉和韧带。</li>
	<li>剪开骨骼两端以暴露红色骨髓。用镊子夹持骨骼，使用装有25G针头的3 ml注射器吸取冷PBS冲洗骨髓至培养皿中。从骨骼两端分别冲洗，以获得更多的骨髓细胞。</li>
	<li>使用6 ml注射器和18G1/2针头，通过反复抽吸和推出的方式破碎骨髓团块。将骨髓转移至50 ml Falcon管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以1,800 rpm离心5分钟，沉淀骨髓细胞。弃去上清液，通过涡旋振荡5–10秒重悬细胞沉淀。</li>
	<li>用无菌水将10X红细胞裂解缓冲液稀释为1X工作液。每只供体小鼠加入5 ml 1X红细胞裂解缓冲液，再次涡旋振荡5秒，并在室温下准确孵育3分钟。</li>
	<li>3分钟后，向管中加入20 ml冷PBS以终止裂解反应，并混匀。将悬液直接通过40 μm细胞筛过滤至新的50 ml Falcon管中。</li>
	<li>用5 ml PBS冲洗原管，并将冲洗液也转移至细胞筛中。最后用PBS补总体积至50 ml并混匀。</li>
</ol>
4. 计数骨髓供体细胞
<ol>
	<li>取100 μl台盼蓝加入离心管中，再取100 μl骨髓悬液加入另一离心管中，混匀。用移液器将染色后的细胞混合液转移至血细胞计数板。</li>
	<li>细胞数量计算方法：Falcon管中总的活骨髓细胞数 = 16个方格内未染色细胞数 × 2（因台盼蓝稀释倍数）× 10,000 × 50 ml</li>
	<li>将Falcon管中的骨髓细胞在4 °C条件下以2,000 rpm离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液。根据总细胞数，用PBS重悬细胞沉淀，调整浓度至每毫升含1 × 108个细胞。</li>
</ol>
5. 输注至受体小鼠
<ol>
	<li>将受体小鼠置于加热垫上并在保温灯下预热。将受体小鼠放入固定器中，每只小鼠通过静脉注射 100–200 μl 含 1 × 107 个细胞的细胞悬液。</li>
	<li>供体骨髓的注射必须在照射后 4–24 小时内完成。</li>
	<li>每笼饲养不超过 4 只已注射的小鼠。将注射后的受体小鼠置于高压灭菌的笼盒中，在无病原动物设施中饲养，给予抗生素处理的饮水，持续 4 周，以恢复免疫功能。每 4 天更换一次笼盒、抗生素处理的饮水和饲料，以维持卫生条件。</li>
</ol>
6. 结肠炎的诱导与评估
<ol>
	<li>照射及骨髓移植4周后，更换为普通饮水，不再添加抗生素，并继续饲养小鼠2周，以恢复其正常的肠道菌群。</li>
	<li>骨髓注射6周后，测量初始体重。部分小鼠给予含5%葡聚糖硫酸钠的饮用水 随意摄取 以诱导结肠炎。部分小鼠仅给予普通饮用水作为正常对照组。</li>
	<li>5 天后，采集外周血，转移至肝素包被的试管（Vacutainer）中，并置于冰上保存。将 4 只小鼠的血液合并至 1 支试管中。取 300 μl 血液与 300 μl 细胞染色缓冲液混合，共 600 μl。将混合后的血液分装至 5 个 Eppendorf 管中，每管 100 μl。</li>
	<li>用二氧化碳或异氟烷处死小鼠。评估大体损伤评分（详情请参见另一篇 JoVE 视频出版物） 1）。测量体重变化。使用数显卡尺测量肠道长度和厚度。观察粪便质地（硬、软或带血）。采用Hemooccult试剂检测粪便隐血。解剖结肠组织并用福尔马林固定，用于后续组织学分析。&amp;E染色。</li>
	<li>每只小鼠解剖一条股骨，提取骨髓，使用25G针头和1 ml注射器以预冷的PBS冲洗骨髓。将4个骨髓组织块汇集至同一离心管中，置于冰上保存。</li>
	<li>将骨髓倒入培养皿中，使用18G针头和5 ml注射器反复剪切骨髓团块数次，直至无骨髓团块存在。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1,500 rpm 离心 5 分钟。弃上清，加入 600 μl 细胞染色缓冲液重悬细胞。将重悬的骨髓细胞分装至 5 个 Eppendorf 管中，每管 100 μl。</li>
</ol>
7. 通过流式细胞术对骨髓移植进行质量检测
<ol>
	<li>将每管血液或骨髓样本标记为1-5号：</li>
	<li>在避光条件下，为每管分别配制相应的抗体混合液。</li>
</ol>
#1 无抗体 
#2 30 μl FITC 同型对照 + 30 μl PE 同型对照 + 15 μl CD16/32 封闭抗体 
#3 30 μl FITC CD45.1 抗体 + 15 μl CD16/32 封闭抗体 
#4 30 μl PE CD45.2 抗体 + 15 μl CD16/32 封闭抗体 
#5 30 μl FITC CD45.1 抗体 + 30 μl PE CD45.2 抗体 + 15 μl CD16/32 封闭抗体
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>向血液或骨髓样本 #1 中不添加任何物质</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>向每份血液或骨髓样本 #2 中加入 5 μl 抗体混合物 #2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>向每份血液或骨髓样本 #3 中加入 3 μl 抗体混合物 #3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>向每份血液或骨髓样本 #4 中加入 3 μl 抗体混合物 #4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>向每份血液或骨髓样本 #5 中加入 5 μl 抗体混合物 #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="3">
	<li>避光冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>每管加入 2 ml 1X 红细胞裂解缓冲液，避光冰上孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1,500 rpm 离心 5 分钟（GH 3.8 转子，1,500 rpm = 350 × g），弃上清。用 500 μl 细胞染色缓冲液重悬沉淀，避光条件下短暂涡旋振荡。</li>
	<li>通过流式细胞术检测免疫染色后的血液和骨髓样本中的 CD45.1（代表野生型）和 CD45.2（代表基因敲除型）。选择 FITC 标记野生型 CD45.1，PE 标记基因敲除型 CD45.2。</li>
	<li>使用 FlowJo 软件分析流式细胞术结果，计算 FITC:PE 比值或 PE:FITC 比值，以确定供体基因型是否在血液和骨髓中占主导地位。</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).</li>
<li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li>
<li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice%3A+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li>
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<li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14%2B+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li>
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<li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP%28%2B%29+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li>
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<li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

这种骨髓移植方法适用于结肠炎、感染、癌症、肥胖及其他疾病的免疫学研究。当目的基因在骨髓来源和非骨髓来源的细胞中均有表达，且怀疑该基因通过其中任一群体的细胞介导疾病时，需要进行骨髓移植实验。例如，抗菌肽 cathelicidin 被证明可调节急性结肠炎，但它在上皮细胞和免疫细胞（如巨噬细胞）中均有表达。因此，我们利用骨髓移植来确定哪一群细胞在小鼠中调节急性结肠炎。通过骨髓移植改变骨髓中 cathelicidin 的基因型后，结肠炎的严重程度发生了显著变化。由此可以得出结论：在骨髓来源细胞中表达的 cathelicidin 在响应 DSS 诱导的急性结肠炎过程中发挥着重要作用。
骨髓来源的细胞通常包括红细胞、白细胞和血小板。骨髓移植可改变这些细胞的基因型，但不影响其他细胞。从广义上讲，该实验仅能区分目的基因在骨髓来源细胞与非骨髓来源细胞中的作用。然而，该实验无法进一步明确是哪一类骨髓来源细胞介导了结肠炎，因为所有红细胞、白细胞和血小板均起源于骨髓。在结肠炎期间迁移至结肠的骨髓来源细胞的命运，是当前活跃且存在争议的研究领域。在骨髓移植并诱导小鼠结肠炎后，部分骨髓来源细胞可能在结肠中表现...

<table><tbody><tr><td>细胞染色缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>#420201</td><td></td></tr><tr><td>10X 红细胞裂解缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>#420301</td><td></td></tr><tr><td>FITC 小鼠同型对照</td><td>Biolegend</td><td>#400207</td><td></td></tr><tr><td>PE小鼠同型对照</td><td>Biolegend</td><td>#400211</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 CD45.2</td><td>Biolegend</td><td>#109807</td><td></td></tr><tr><td>FITC抗小鼠CD45.1</td><td>Biolegend</td><td>#110705</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/32 封闭</td><td>Biolegend</td><td>#101301</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m细胞滤器</td><td>Fisherbrand</td><td>#22363547</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1×</td><td>MP Biomedicals</td><td>#1860454</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Fisherbrand</td><td>#BP2425</td><td></td></tr><tr><td>复方新诺明（SMZ）</td><td>Qualitest</td><td>NC9242720（fisher）</td><td></td></tr><tr><td>Lysol IC</td><td>安德温科学公司</td><td>NC9745686（fisher）</td><td></td></tr><tr><td>Vaccutainer</td><td>BD</td><td>#8000813</td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td>布雷因特里科学公司</td><td>#TV-150</td><td></td></tr><tr><td>辐照仪</td><td>J.L. Shepherd and Associates</td><td>Mark I 68A</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td>BD FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪测试管</td><td>Falcon</td><td>#352052</td><td></td></tr><tr><td>数字卡尺</td><td>Fisherbrand</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Hemoccult ICT</td><td>贝克曼库尔特</td><td>G0328QW</td><td></td></tr></tbody></table>

通过骨髓移植区分免疫细胞与非免疫细胞中基因表达在小鼠结肠炎中的功能作用

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

为了理解某个基因在结肠炎发展中的作用，我们比较了野生型小鼠和该目的基因敲除小鼠在结肠炎中的反应。如果该目的基因在宿主的骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中均有表达，则可通过骨髓移植技术来区分该基因在骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中的不同作用。为了改变小鼠骨髓来源细胞的基因型，首先通过照射破坏受体小鼠原有的骨髓，然后用不同基因型的供体骨髓进行替代。当将野生型小鼠的骨髓移植到基因敲除小鼠体内时，可获得在骨髓来源细胞中表达野生型基因的敲除小鼠。反之，当将基因敲除小鼠的骨髓移植到野生型受体小鼠体内时，可获得在骨髓来源细胞中不表达该目的基因的野生型小鼠。然而，骨髓移植可能无法达到100%完全替换。因此，我们利用分化簇（CD）分子（CD45.1 和 CD45.2）作为供体和受体细胞的标记，以追踪受体小鼠体内供体骨髓来源细胞的比例，评估骨髓移植的成功程度。实验中使用CD45.1基因型的野生型小鼠和CD45.2基因型的基因敲除小鼠。在对受体小鼠进行照射后，将不同基因型的供体骨髓细胞输注至受体小鼠体内。待新的骨髓再生并重建免疫系统后，通过化学试剂（葡聚糖硫酸钠，DSS 5%）处理小鼠以诱导结肠炎。本文同时展示了在小鼠中诱导结肠炎的方法，并评估由骨髓来源细胞表达的目的基因在疾病中的作用。如果来自骨髓来源细胞的目的基因在疾病（如结肠炎）的发展中起重要作用，则接受骨髓移植的受体小鼠的表型可能发生显著改变。在结肠炎实验结束时，采集小鼠外周血和骨髓中的细胞，用抗CD45.1和CD45.2抗体标记，通过流式细胞术定量分析两种细胞的比例，以评估骨髓移植的成功程度。成功的骨髓移植应在受体小鼠的骨髓和血液中均显示供体基因型（以CD分子标记为准）占绝对优势。

如果目的基因在结肠炎发展过程中对免疫细胞具有重要作用，那么通过骨髓移植接受不同基因型骨髓的小鼠（野生型至基因敲除型或基因敲除型至野生型）应对DSS诱导的结肠炎表现出不同的反应。评估结肠炎严重程度最重要的参数之一是结肠组织的苏木精-伊红（H&amp;E）染色。结肠组织结构的变化和炎症迹象可通过H&amp;E组织学评分系统进行定量评估。DSS结肠炎模型的H&amp;E组织学评分标准可参见此处2。此外，化学性结肠炎也可由三硝基苯磺酸（TNBS）诱导。TNBS诱导结肠炎的方法及H&amp;E组织学评分标准见于先前发表的研究3。组间组织学评分差异可采用学生t检验（student's t-test）进行分析。
与假骨髓移植小鼠（WT 到 WT 或 KO 到 KO）相比，这些小鼠的结肠炎可能显著改善或加重。如果目的基因通过骨髓来源的细胞在结肠炎中发挥重要作用，那么骨髓移植小鼠的反应应显著不同于假骨髓移植小鼠。
对于DSS结肠炎模型，可通过组织学评分来评估组织学变化（见<str...

骨髓移植提供了一种改变骨髓来源细胞基因型的方法。如果目的基因在骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中均有表达，骨髓移植可以在不改变非骨髓来源细胞基因型的情况下，将骨髓来源细胞的基因型转变为另一种基因型。

为了理解某个基因在结肠炎发展中的作用，我们比较了野生型小鼠与该目的基因缺陷的基因敲除小鼠的反应……

本视频所展示实验的总体目标是评估抗菌肽lyin是否在缓解葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎中发挥作用。该目标通过将野生型小鼠的骨髓移植到经辐照的licit和敲除型小鼠体内，以及将敲除型小鼠的骨 marrow 移植到经辐照的野生型小鼠体内来实现。移植的骨髓将在受体动物体内生成具有供体基因型的新血细胞。四周后，对受体小鼠施加葡聚糖硫酸钠以诱导结肠炎。通过流式细胞术验证移植是否成功，并通过组织学方法评估结肠组织损伤情况。实验结果表明，将野生型骨髓移植至基因敲除小鼠后，结肠炎症状得到改善。相反，当将基因敲除的骨髓移植到野生型小鼠体内时，结肠炎会加重。该方法有助于解答在炎症或感染过程中，由骨髓来源细胞或非骨髓来源细胞所决定的基因表达相关关键问题。建议本实验使用 C57、black six 野生型小鼠以及 C elicited 基因敲除小鼠，以便能够追踪野生型小鼠与基因敲除小鼠。骨髓移植后的供体细胞。使用 CD 45.1 小鼠代表野生型小鼠，CD 45.2 小鼠代表基因敲除小鼠。此处所示图表描述了实验设计：每组分配五只供体小鼠和十只受体小鼠。对于A组和B组，将从野生型小鼠向敲除型小鼠移植骨髓。仅在A组中诱导结肠炎，而不在B组中诱导。对于C组和D组，将从敲除型小鼠向野生型小鼠移植骨髓，且仅在C组中诱导结肠炎。对于E组和F组，移植将从野生型小鼠移植至野生型小鼠；对于G组和H组，移植将从敲除型小鼠移植至敲除型小鼠。为准备供体骨髓并将其移植至经辐照小鼠，首先在生物安全柜中从已处死小鼠的骨骼中提取骨髓。使用无菌解剖器械剥离附着的肌肉和韧带，暴露肱骨、股骨、胫骨和腓骨，并将其转移至培养皿中。剪开骨骼的两端以露出红色骨髓，然后用镊子夹住其中一根骨骼。用3毫升注射器和25号针头，将预冷的PBS注入骨骼，冲洗出红色骨髓至另一个培养皿中。然后从骨骼的另一端再次冲洗，以获得更多的骨髓细胞。每根骨骼均重复此操作。分别收集野生型和基因敲除小鼠的骨髓。使用带有18号半英寸针头的6毫升注射器，通过反复抽吸和推出来破碎红骨髓凝块。然后用血清移液管将收集的骨髓转移至50毫升锥形管中。转移全部骨髓后，在4摄氏度下以740 G离心五分钟。离心结束后，弃去上清液，并通过涡旋振荡五到十秒钟重悬沉淀。向沉淀中加入每只供体小鼠5毫升的1倍红细胞裂解缓冲液，再次涡旋振荡五秒钟，并在室温下准确孵育三分钟。三分钟后，向每根试管中加入 20 毫升冷 PBS，通过倒置混匀以终止裂解。然后将液体倒入装有 40 微米细胞滤筛的新 50 毫升锥形管中。用 5 毫升 PBS 清洗原试管，并将洗涤液转移至细胞滤筛中。继续将流穿液收集到锥形管中。然后用 PBS 将体积补至 50 毫升，并通过倒置混匀。接下来，使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量。确定细胞数量后，在4摄氏度条件下，以913 × g离心骨髓细胞5分钟。离心后，根据总细胞数弃去上清液。用PBS重悬细胞沉淀，调整浓度至每毫升含1 × 10⁸个细胞。骨髓细胞现已准备好移植到经辐照的受体小鼠体内。本实验所用的受体野生型小鼠和基因敲除小鼠已按照随附文件所述接受1000 rad辐照处理。辐照后4至24小时内，将受体小鼠在加热垫上并置于保温灯下预热，以便注射供体骨髓细胞。将一只受体小鼠放入固定器中，用70%乙醇擦拭尾部，以消毒注射部位并促进局部血管扩张，便于注射。使用带有28½号针头的胰岛素注射器，将1×10⁷个细胞溶于1至200微升液体中，注射入每只小鼠的尾静脉。注射后，将小鼠与最多三只其他已注射的小鼠共同置于同一笼中，持续四周。将注射后的受体小鼠饲养在高压灭菌笼中，并提供含有抗生素磺胺甲噁唑-甲氧苄啶（sulfa trim）的饮水。这可以保证动物有足够时间恢复免疫力，每四天更换一次笼具、抗生素处理的水和食物以维持卫生。照射及骨髓移植四周后，改为饮用不含抗生素的常规水，并继续饲养小鼠两周，使其肠道正常菌群得以恢复。骨髓注射六周后，测量初始体重以诱导结肠炎。给结肠炎实验组小鼠饮用含5%葡聚糖硫酸钠的水。五天后，用肝素包被的真空采血管收集四只小鼠的外周血，并置于冰上。然后在1.5毫升微量离心管中，将300微升血液与300微升细胞染色缓冲液混合，并将血液分装到五根已标记为1至5号的流式细胞术检测管中，每管100微升，置于冰上。处死小鼠后，再次测量体重并计算变化值。解剖结肠组织并置于甲醛中用于 H 和 D 染色。然后按之前方法获取骨髓细胞。将重悬的骨髓均分为五份，分别加入预先标记为一至五的微量离心管中，每管100毫升。为进行流式细胞术分析，参照随附文件在避光条件下为各管分别配制相应的抗体混合液：编号为一的血液与骨髓样本作为对照组，不进行染色；编号为二的样本将使用FITC同型对照、PE同型对照及CD16/32阻断液进行染色。这些同型对照用于确认一抗结合样本的特异性。编号为3的样本将用FZ CD 45.1和CD 16/32染色。编号为4的阻断液样本将用CD 45.2和CD 16/32染色。封闭液。单色标记可揭示血液或骨髓中供体或受体细胞的存在。显然，编号为5的样品将被染色以检测CD 45.1、CD 45.2和CD 16/32。此处通过双色标记显示血液或骨髓中供体与受体细胞的相对比例。向各自的样本管中加入 5 µL 抗体混合物二和五。然后向各自的样本管中加入 3 µL 抗体混合物三和四。将所有试管置于冰上孵育30分钟。孵育结束后，向每管中加入2毫升1倍红细胞裂解缓冲液。然后将样品置于冰上避光再孵育15分钟。在 350 × g 条件下离心 5 分钟，温度为 4 摄氏度。离心后，弃去上清液，在避光条件下用 500 微升细胞染色缓冲液重悬沉淀。然后短暂涡旋振荡。接下来，对免疫染色的血液和骨髓样本进行流式细胞术分析。选择FZ标记以代表野生型CD 45.1，PE标记以代表敲除型CD 45.2。使用Flo Joe软件分析流式细胞术结果。通过计算fit E与PE的比值或PE与fit e的比值，判断供体基因型在血液和骨髓中是否为显性基因型。该图像显示了具有正常组织学特征和DSS结肠炎的结肠组织的苏木精-伊红（H&E）染色样本图像。组织学图像的评分依据是黏膜组织损伤程度以及中性粒细胞向黏膜层和黏膜下层组织的浸润情况。因此，较高的组织学评分表明结肠炎更为严重，以此来检测lyin是否在预防结肠炎中发挥作用。骨髓在野生型小鼠和基因敲除小鼠之间进行交换，具体操作如本视频所述。随后对组织学结果进行评估并按此处所示进行评分。当将基因敲除小鼠的骨髓移植到经照射的野生型小鼠中时，组织学评分显著升高；相反，当将野生型骨髓移植到基因敲除小鼠中时，评分则显著降低。这些数据表明，来源于骨髓细胞的内源性C具有抗炎作用，并能改善结肠炎，同时也验证了这些小鼠的移植操作已成功。移植后，还对小鼠的骨髓和血液进行了流式细胞术分析。野生型骨髓对Fitz CD45.1染色强烈，但对PE、CD45.2无染色，如图所示；而基因敲除型骨髓对PE染色强烈，但对Fitz无染色，如图所示。然而，在移植后，接受基因敲除型骨髓的野生型小鼠，其骨髓和血液均对PE染色强烈，而对Fitz无染色，表明染色细胞的主要群体来源于供体。同样，接受野生型骨髓移植的基因敲除小鼠的骨髓和血液对fitzy染色呈强阳性，但对pe不染色，再次证实主要染色的细胞群体来源于供体。观看本视频后，您应能够进行骨髓移植实验，并能够通过骨髓来源的细胞调控结肠炎。

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