在全细胞群体中于单细胞水平研究细胞周期蛋白B的蛋白水解

本实验的目的是监测周期蛋白B的蛋白水解如何调控后期起始及有丝分裂退出。首先在显微镜载玻片上接种周期蛋白B SNAP报告细胞，然后用荧光底物TMR star标记嵌合的周期蛋白B SNAP报告分子，以此实现上述目标。

接下来，在显微镜工作站获取图像序列。最后一步是分析细胞并计算随时间变化的 TMR star 荧光强度，该强度反映了周期蛋白 B 的蛋白水解过程。最终，对活体报告细胞进行免疫荧光显微观察，可揭示有丝分裂过程中周期蛋白 B 蛋白水解的动力学特征。

与现有的监测cyclone BGFP等方法相比，该技术的主要优势在于，cyclone B SNAP能够监测cyclone B的降解过程，而非整个蛋白质的表达水平。本实验所用的SNAP报告细胞最初需在对数生长期异步培养至少48小时。实验开始时，胰蛋白酶消化的接种步骤是将亚汇合状态的SNAP报告细胞接种至八孔显微镜培养室中，确保细胞在整个培养室表面均匀分布，随后进行离心。

将10,000个细胞重悬于350微升不含酚红的正常培养基中。将细胞悬液转移至显微镜培养腔，接种到八孔显微镜培养腔中，使细胞在腔室中央达到最大密度。首先在腔室中加入300微升不含酚红的正常培养基。

接下来，小心地将 5,000 个细胞加入显微镜培养腔的中心，以将细胞接种到 96 孔特殊光学培养板上，确保细胞在整个孔底表面均匀分布。根据所需含细胞孔的总数，将 5,000 个细胞重悬于 300 微升不含酚红的正常生长培养基中。根据需要调整细胞数量和悬浮培养基的总体积。

然后将细胞悬液转移至96孔板，用于将细胞接种到96孔光学专用板上，使细胞在孔中央区域达到最大密度。在每孔中央小心加入含1,500个细胞的15微升无酚红正常培养基小液滴。

这将限制细胞在孔板中央区域生长。在染色程序开始前30分钟，让所有接种的细胞在标准细胞培养条件下至少生长18小时。将不含酚红的正常生长培养基预热至37摄氏度。

本实验中使用的快照底物为 TMR star，为便于操作，将 TMR star 溶解于 DMSO 中，配制浓度为 400 微摩尔的储存液。取 0.5 微升 TMR star 储存液，加入 200 微升温热的不含酚红的正常培养基中，得到终浓度为 1 微摩尔的标记工作液。接下来，移除异步生长细胞中的正常培养基，更换为上述标记工作液，在标准培养条件下孵育细胞 25 分钟。

孵育25分钟后，移除标记培养基，并用37°C的无酚红正常生长培养基洗涤细胞4次。最后一次洗涤后，在300 µL 37°C的无酚红正常生长培养基中孵育细胞30分钟，然后转移至显微镜。更换为新鲜的37°C无酚红正常生长培养基，以去除未结合的SNAP底物，随后将细胞置于预热至37°C的泡沫盒中的加热块上，运输至显微镜进行观察。

为尽量减少温度波动，在测量荧光强度前两小时，将气候箱的空气温度调节至37摄氏度（干式模式），使显微镜及其所有组件达到所需温度。为避免冷凝水形成并防止对显微镜造成后续损害，务必在设定湿度前进行预热。

当整个显微镜系统达到 37 摄氏度时，将空气湿度调节至 60%，二氧化碳浓度调节至 5%。启动扫描或图像采集软件，并设定标准参数。定义需要分析的孔位位置。设定时间间隔（delta T）或采集周期时间，以及采集循环的总次数。

在此演示中，为分析较多数量的孔，已预先选择硬件自动对焦。启动采集，并监控前两个采集周期。

显微镜将首先聚焦于组蛋白H2 GFP信号，并在该通道下获取第一幅图像，随后更换滤光片并获取相应的TMR star图像。此过程将对孔内所有位置以及需要检测的每个孔重复进行，之后再开始下一个循环。为分析蛋白水解谱，启动Scan R分析软件。

使用组蛋白H2-GFP所显示的细胞核对图像进行分析，将细胞核定义为主要对象，通过基于信号强度的阈值和分水岭算法来帮助分离相邻的细胞。为进行TMR star分析，应创建包含细胞核及细胞质的子对象。主要对象的重要属性包括X和Y位置、时间，以及主要对象的GFP最大强度和平均强度，还有总强度除以面积的比值。

对于 TMR star 亚对象，切换至轨迹模式，以可视化该亚对象的平均 TMR star 荧光强度随时间的变化，或已分配给被分析主对象的细胞轨迹。观察较大量的细胞可获得初步的代表性及客观视图，但可通过门控筛选出持续至少 140 个周期且具有较高组蛋白 H2A-GFP 最大荧光强度的测量数据，从而缩小需分析的细胞数量。选择感兴趣的细胞轨迹，以在单细胞水平上同时观察组蛋白 H2A-GFP 与 TMR star 的荧光信号。

使用右键鼠标点击目标细胞，生成可导出的图片。图库用于展示组蛋白 H2A-GFP 和每个时间点的 Cyclin B-SNAP-TMR*。将扫描分析软件切换至群体模式，并在点印迹图上圈定目标细胞所在的区域。

对门控区域应用新的点图窗口，并随时间可视化TMR star荧光强度的平均值。将数据导出至Microsoft Excel进行进一步计算。此处的图示展示了细胞周期蛋白B的动力学，表现为TMR star荧光强度曲线，该细胞在胞质收缩后经历正常的有丝分裂，且在核膜破裂（NEBD）时未出现染色体错位迹象，如红色三角形所示。TMR staph荧光强度迅速增加，直至达到等形态窗口。

当细胞进入前中期时，只要细胞继续经历前期和中期，荧光强度会保持在稳定水平，随后开始迅速下降。一旦所有染色体建立了稳定的中期板，这种下降即发生在染色体分离之前。在后期（由曲线晚期有丝分裂中的蓝点指示），染色质开始去凝缩，细胞逐渐转变为末期形态。

当荧光强度曲线趋近于平台期时，该平台期低于有丝分裂前的平台期。该技术为有丝分裂领域的研究人员探索调控有丝分裂进程的周期性、蛋白降解与合成之间的紧密平衡奠定了基础。