在整个细胞群在单细胞水平上研究细胞周期蛋白B的蛋白水解

中期向后期过渡被触发，通过后期促进复合物（APC / C）依赖的泛素化和随后的破坏细胞周期蛋白B.在这里，我们建立了一个系统，脉冲追踪标签，可以监控在整个细胞群的细胞周期蛋白B蛋白水解和有利于检测干扰的有丝分裂关卡。

该程序的目的是监测循环 B 的蛋白水解如何控制后期开始和有丝分裂退出。这是通过首先在显微镜载玻片上接种循环 B snap 报告细胞来实现的。第二步是用荧光底物 TMR 星标记嵌合细胞周期蛋白 B 快速报告分子。

接下来，在显微镜站采集图像系列。最后一步是分析细胞并计算 TMR 星形荧光强度随时间的变化，这反映了循环 B 蛋白水解。最终，活报告细胞的免疫荧光显微镜检查揭示了有丝分裂期间发生的循环 B 蛋白水解的动力学。

与现有方法（如监测旋风分离器 BGFP）相比，该技术的主要优点是旋风分离器 B SNAP 允许监测旋风分离 B 降解而不是整个蛋白质表达。该实验的快照报告细胞最初允许在对数期异步生长至少 48 小时。首先，接种胰蛋白酶的程序是亚汇合快速报告细胞，用于将细胞接种到八个孔显微镜室中，在腔室离心机的整个表面以恒定分布。

10， 000 个细胞和 Resus 在 350 μL（一种不含酚红的正常生长培养基）中放置。将细胞悬液转移到显微镜室中，将细胞接种到八个孔显微镜室中，室中心具有最大细胞密度。首先，用 300 μL 不含表红的正常生长培养基填充腔室。

接下来，小心地将 5， 000 个细胞添加到显微镜室的中心，以便将细胞接种到 96 个细胞上。孔的特殊光学板在孔的整个表面以恒定分布离心 5， 000 个细胞，并重悬于 300 μL 不含酚红的正常生长培养基中，具体取决于所需的含有孔的细胞总数。调整细胞数和悬浮培养基的总体积。

然后将细胞悬液转移到 96 孔板中，以便将细胞接种到 96 孔板上。孔中具有最大细胞密度的特殊光学板。小心地将 1， 500 个细胞加入 15 μL 不含酚红的正常生长培养基中，以小滴剂形式添加到每个孔的中心。

这将限制细胞生长到孔的中心。在染色程序开始前 30 分钟，在标准细胞培养条件下让所有接种的细胞生长至少 18 小时。将不含酚红的正常生长培养基升温至 37 摄氏度。

本演示中的卡扣底物是 TMR 星形，用于轻松处理 TMR 星形溶解在 DMSO 中的 TMR 星形，以获得浓度为 400 微摩尔的储备液稀释 0.5 微升 TMR 星形储备液。在 200 μL 温热的不含酚红的正常生长培养基中，获得 1 微摩尔的最终标记浓度。接下来，从异步生长的细胞中去除正常生长培养基，并替换为标记培养基，在标准培养条件下将细胞在标记培养基中孵育 25 分钟。

25 分钟后，去除标记培养基，用温热的不含酚红的正常生长培养基洗涤细胞 4 次。最后一次洗涤后，将细胞在 300 μL 温热的不含酚红的正常生长培养基中孵育 30 分钟，然后运输至显微镜。用新鲜、温暖的不含酚红的正常生长培养基替换培养基，以去除残留的未结合的卡扣底物，将细胞运输到聚苯乙烯泡沫塑料盒中的显微镜中，放在预热的 37 摄氏度加热块上。

为了在测量荧光强度前两小时最大限度地减少温度变化。在干燥模式下，将气候室的空气温度调节至 37 摄氏度，以使显微镜及其所有组件达到所需温度。为避免冷凝和随后对显微镜的损坏，在设置湿度之前预热非常重要。

当整个显微镜系统达到 37 摄氏度时，将空气湿度调整为 60%，将二氧化碳调整为 5%启动扫描或采集软件并定义标准设置。定义要分析的井的位置。定义 delta T 或采集周期时间以及采集周期的绝对数。

在这个演示中。预选硬件自动对焦用于分析更多孔。开始采集并监督前两个采集周期。

显微镜将聚焦于组蛋白 H 两个 GFP 信号，随后在更换滤光片并获取相应的 TMR 星形图像之前在该通道中采集第一张图像。这是在重复下一个循环之前，对孔内的所有位置和要检查的每个孔重复这些作。再。要分析蛋白水解谱，请启动 scan R 分析软件。

使用基于信号强度的阈值和分水岭算法来帮助分离相邻细胞，使用组蛋白 H 两个 GFP 可视化的细胞核分析图像，定义为主要对象。应创建一个由细胞核和细胞质组成的子对象，用于 TMR 星分析。主要物体的重要属性是 X 和 Y 位置、时间和最大值，以及主要物体的 GFP 平均强度和除以面积的总强度。

对于 TMR 星形子对象，更改为痕量模式以可视化子对象随时间变化的平均 TMR 星形荧光强度或分配给分析主对象的细胞迹线。观察大量细胞可以获得第一个具有代表性的客观视图，但可以通过对持续至少 140 个周期并包含较大的最大组蛋白 H 两个 GFP 强度的测量值进行门控来缩小要检查的细胞数量。选择感兴趣的细胞痕量，以在单个细胞水平上同时显示组蛋白 H、2 GFP 和 TMR 星形荧光。

使用鼠标右键单击感兴趣的单元格并生成可导出的图片。组蛋白 H 两个 GFP 和循环 B 每次捕捉 TMR 星的插图画廊。点更改扫描仪分析软件的填充模式，并设门在点印迹上表示感兴趣细胞的区域。

将新的点图窗口应用于门控区域，并可视化随时间变化的平均 TMR 星荧光强度。将数据导出到 Microsoft Excel 以进行进一步计算。此处的图描述了细胞的 TMR 星形荧光强度曲线表示的细胞周期蛋白 B 动力学，该细胞在核膜破裂后细胞质压实时没有染色体错位的迹象，或红色三角形所示的 NEBD TMR 葡萄球菌荧光强度显示突然增加，直到达到同构窗口。

当细胞进入前中期时，只要细胞通过前中期和中期，荧光强度就会保持在稳定的水平，然后开始迅速下降。一旦所有染色体都建立了稳定的中期板，这种下降就会在染色体分离之前出现。在有丝分裂晚期曲线上的蓝点表示的后期，染色质开始凝聚，细胞进入期形态。

而荧光强度曲线接近平台期，低于有丝分裂前的高原期其发展。这项技术为有丝分裂领域的研究人员探索调节有丝分裂进程的循环、降解和合成之间的紧密平衡铺平了道路。