Name: 在整个细胞群在单细胞水平上研究细胞周期蛋白B的蛋白水解 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 了解如何使用脉冲追踪标记和荧光显微镜技术在活细胞中监测细胞周期蛋白B的蛋白水解过程。该方法揭示了有丝分裂过程中细胞周期蛋白B降解动力学，为细胞周期调控研究提供了新工具。

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我们感谢 S. Taylor 提供 pLPCX-Histone H2-GFP 质粒。感谢 R. Mertelsmann 的持续支持。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助。

1. 在显微镜培养皿上接种基于U2OS的Cyclin B-SNAP报告细胞（克隆11细胞 6）
<ol>
	<li>将处于对数生长期且异步培养至少48小时的亚融合状态SNAP报告细胞进行胰蛋白酶消化处理。</li>
	<li>使用8孔显微镜培养腔室（确保细胞分布均匀）。</li>
</ol>
为将细胞均匀接种至8孔显微镜培养板的整个表面，需离心10,000个细胞，并将其重悬于350 μl不含酚红的常规生长培养基中（添加10%胎牛血清、青霉素/链霉素和丙酮酸钠）。将细胞悬液转移至显微镜培养板中（图2）。
使用8孔显微镜培养皿（中心区域细胞密度最高）。
为了在显微镜腔室中心接种更高密度的细胞，先向腔室内加入 300 μl 无酚红的正常培养基。然后小心地将 5,000 个细胞加入到显微镜腔室的中心位置（图 2）。
使用96孔特殊光学板（细胞分布均匀）。
为将细胞均匀接种至96孔板的整个孔表面，需离心5,000个细胞，并重悬于300 μl不含酚红的常规生长培养基中。将细胞悬液转移至96孔板。根据所需含细胞孔的总数，调整细胞数量及悬液培养基的总体积（图2）。
使用96孔特殊光学板（中心区域细胞密度最高）。
将细胞接种到96孔板时，小心地在每孔中央加入含1,500个细胞的15 μl无酚红正常培养基小液滴，以限制细胞生长于孔中央区域（图2）。
<ol start="3">
	<li>将接种的细胞置于标准细胞培养条件下（37 °C，100% 空气湿度，5% CO2）培养至少 18 小时。</li>
</ol>
2. 使用 SNAP 底物染色报告细胞
<ol>
	<li>在开始染色程序前30分钟，将不含酚红的正常培养基分装物升温至37 °C。</li>
	<li>为便于操作SNAP底物（本实验中为TMR Star），将TMR Star溶于DMSO中，配制成浓度为400 μM的储存液，并可在-20 °C下保存。</li>
	<li>染色前，取0.5 μl TMR Star储存液加入200 μl 37 °C的不含酚红的正常培养基中，使终浓度为1 μM。</li>
	<li>移除异步生长细胞中的正常培养基，加入标记培养基，在标准培养条件下孵育25分钟。</li>
	<li>移除标记培养基，用37 °C的不含酚红的正常培养基洗涤细胞四次。加入300 μl 37 °C的不含酚红的正常培养基，孵育30分钟。在转移至显微镜前，更换为新鲜的37 °C不含酚红的正常培养基，以去除未结合的SNAP底物残留。</li>
	<li>将细胞置于预热（37 °C）的金属导热块上，并放入泡沫塑料盒中运输至显微镜，以尽量减少温度波动。</li>
</ol>
3. 荧光强度的测量
<ol>
	<li>在分析开始前两小时，将气候箱的空气温度调节至37 °C（干燥模式），以使显微镜及其所有组件达到所需温度。在设定湿度前进行预热至关重要，可避免冷凝现象，从而防止对显微镜造成损坏。</li>
	<li>在分析开始前，将空气湿度调节至60%，CO2浓度调节至5%。</li>
	<li>启动Scan^R Acquisition软件，并设定标准参数（见表1）。</li>
	<li>设定待分析孔位的位置。</li>
	<li>设定Δt（采集周期时间）以及采集循环的总次数。</li>
	<li>若需分析较多孔位，应选择硬件自动聚焦；否则，仅使用软件自动聚焦即可满足需求。</li>
	<li>启动采集程序，并在前两个采集周期内进行监控。显微镜将首先对组蛋白H2-GFP信号进行聚焦，随后在该通道采集第一幅图像，之后切换滤光片并采集相应的TMR Star图像（图3）。此过程将在每个孔内的所有位置以及所有待检孔中重复进行，随后进入下一个循环周期。</li>
</ol>
使用Scan^R分析蛋白水解谱
<ol>
	<li>启动 Scan^R Analysis 软件，分析显示组蛋白 H2-GFP 标记的细胞核图像，将细胞核定义为主要对象，通过基于信号强度的阈值和分水岭算法来辅助分离相邻细胞。为 TMRstar 分析创建包含细胞核与细胞质的亚对象。（主要对象的重要属性包括 X 和 Y 位置、时间，以及主要对象的 GFP 最大和平均强度，亚对象的总强度除以面积。）由于数据量较大，该分析过程可能需要数小时。</li>
	<li>切换至轨迹模式，以可视化亚对象的 TMR Star 荧光平均强度随时间的变化（细胞轨迹），并将这些轨迹分配给已分析的主要对象（图 4）。可通过筛选持续至少 140 个周期且 H2-GFP 最大强度较高的细胞，缩小待分析细胞的数量。观察更多细胞可获得初步的代表性与客观性视图（图 4）。</li>
	<li>选择感兴趣的细胞轨迹，以在单细胞水平上同时可视化组蛋白 H2-GFP 与 TMR Star 荧光信号（图 5A）。</li>
	<li>使用鼠标右键点击感兴趣的细胞，生成可导出的图片图集，用于展示每个时间点的组蛋白 H2-GFP 与 cyclin B-SNAP TMR Star 荧光图像。</li>
	<li>切换至 Scan^R Analysis 软件的群体模式，并在 X 与 Y 散点图上圈选代表该感兴趣细胞的区域（图 5B）。</li>
	<li>对所圈选的区域应用新的散点图窗口，可视化 TMR Star 荧光平均强度随时间的变化（图 5C）。</li>
	<li>将数据（时间与荧光强度）导出至 Microsoft Excel 进行进一步计算。</li>
</ol>
5. 典型结果
图5D和5E展示了细胞周期蛋白B（cyclin B）的动力学过程，以TMR Star荧光强度曲线表示，该细胞经历正常的有丝分裂，未出现染色体错位的迹象（图5E）。在核膜破裂（NEBD，以红色三角形表示）后细胞质发生浓缩时，TMR Star荧光强度急剧上升，直至细胞进入前中期，达到等形态窗口（图中较亮区域）6。只要细胞继续处于前中期和中期，荧光强度便维持在稳定水平；一旦所有染色体形成稳定的中期板，荧光强度即迅速下降（图5D和5E）。这一下降发生在后期染色体分离之前（曲线上的蓝色圆点）。在有丝分裂晚期，染色质开始去浓缩（蓝色条带），细胞恢复间期形态，同时荧光强度曲线趋于一个低于有丝分裂前平台期的新平台（图5D和5E）。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>自动对焦设置</td>
			<td>组蛋白 H2-GFP（主要成像采集参数）</td>
			<td>用 TMR Star 标记的周期蛋白 B-SNAP 
			（成像采集参数）</td>
			<td>采集周期时间 重复次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>粗自动对焦 ±39 μm 24 层 
			精细自动对焦 
			±5.4 μm 14 层</td>
			<td>GFP 滤光片组： 
			曝光时间：100 毫秒 
			光照强度：25%</td>
			<td>TRITC 滤光片组： 
			曝光时间：150 毫秒 
			光照强度：33.3%</td>
			<td>2 至 5 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP 滤光片组： 
			曝光时间：12 毫秒 
			光照强度：12.5%</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>持续分析最长可达 48 小时（受限于 60% 的较低空气湿度）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于分析细胞周期蛋白B降解的标准设置。 使用组蛋白H2-GFP作为参考结构，以确定用于测量细胞周期蛋白B-SNAP荧光强度的焦平面。在聚焦过程中，光照强度低于图像采集时的设置，以避免累积性光毒性。
<img alt="显示APC/C通路、TMR Star标记和荧光的Cyclin B-SNAP蛋白降解过程示意图" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 通过表达具有与内源性蛋白相似降解特性的嵌合型Cyclin B衍生物来检测Cyclin B蛋白降解过程的示意图。脉冲-追踪标记后荧光强度的下降反映了APC/C的活性。
<img alt="细胞接种技术示意图；细胞悬液制备、培养基准备、移液过程。" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 在 8 孔板或 96 孔板上对细胞进行分析。 将细胞重悬于终体积为 300 μl 的溶液中，可实现细胞在孔表面的均匀分布，若仅需对手动定义的单个或少数几个位置进行分析，则推荐采用此方法。通过将细胞加入已预加培养基或空置的孔中央区域，可实现细胞在孔中央区域的富集。在不同孔中进行自动图像采集时，建议使用此技术。
<img alt="荧光显微镜示意图：GFP、TRITC滤光片；组蛋白H2-GFP、Cyclin B-SNAP/TMR Star强度。" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 数据采集顺序。 A) 检测组蛋白H2-GFP用于确定焦平面以及监控有丝分裂过程中染色体的排列。B) TMR Star荧光强度用于衡量脉冲-追踪标记的cyclin B-SNAP的绝对含量。
<img alt="染色体排列和荧光分析的荧光强度图表与显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
 图4. 基于Scan^R分析软件展示的TMR Star荧光平均强度（总TMRstar强度除以面积）随时间变化的代表性结果。 选取一个代表性细胞的轨迹（蓝色）。相应的图像（右侧显示）可同时可视化组蛋白H2-GFP（绿色）和周期蛋白B-SNAP（红色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="使用门控、时间序列图和显微图像进行荧光强度分析以导出数据。" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
 图 5. A+B) 在 XY 点图上对代表目标细胞的点进行门控示例。C) 利用点图展示随时间变化的平均 TMRstar 荧光强度（总 TMRstar 强度除以面积）。D+E) 在核膜破裂（NEBD）至染色质去凝集（蓝色条）期间，使用 Microsoft Excel 生成的 cyclin B-SNAP 的代表性荧光强度曲线，其中等形态窗口（图中较亮区域）已标出。曲线上的蓝色点表示后期（anaphase）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
视频 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">点击此处查看补充视频</a>。

<ol><li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li>
<li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregating+sister+genomes%3A+the+molecular+biology+of+chromosome+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li>
<li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li>
<li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instabilities+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li>
<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li>
<li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+APC%2FC+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
<li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li>
<li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li>
<li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li>
<li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

本文介绍了一种基于活细胞成像的方法，可同时监测细胞周期蛋白B的蛋白水解过程和染色体排列情况。该方法能够在单细胞水平上研究未受干扰的细胞群体中的有丝分裂调控。通过细胞周期蛋白B的降解曲线，可直接了解APC/C的活性，从而间接反映纺锤体组装检查点（SAC）的状态6。
该方法尽管基于Scan^R软件建立，但可在任何类似的显微镜系统上轻松重现。此外，利用我们构建的逆转录病毒载体表达的cyclin B-SNAP融合蛋白，可通过逆转录病毒稳定整合，将报告细胞系轻松建立于任何目标细胞系中。为了进一步提高系统的灵活性，嵌合型SNAP蛋白可使用多种荧光染料进行染色。
组蛋白 H2-GFP 的应用除了在监测染色体排列方面具有必要性外，还可实现快速且简便的自动对焦。自动对焦和荧光强度设置也取决于细胞类型，需针对每种细胞系分别确定。利用 Scan^R 技术对大量细胞分裂过程中的蛋白水解谱进行采集，使我们能够筛选出发生染色体排列错误的单个有丝分裂事件。这使我们能够界定异常分裂与正常分裂之间蛋白水解谱的差异6</sup...

<table><tbody><tr><td>报告细胞系</td><td>本实验室自行构建，方法见文献&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td>克隆11号报告细胞&lt;br/&gt;（基于U2Os的cyclin B-SNAP表达细胞）</td><td></td></tr><tr><td>逆转录病毒cyclin B-SNAP表达载体</td><td>本实验室自行构建，方法见文献&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td>pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP</td><td></td></tr><tr><td>酚红-free DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td>需添加FCS、丙酮酸钠、青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR-Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>储存液：400 &amp;mu;M，溶于DMSO</td></tr><tr><td>特殊光学板，96孔</td><td>Costar</td><td>3720</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;-Slide 8孔，ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>显微成像系统</td><td>Olympus</td><td>IX-81倒置显微镜，配备环境控制室</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 20x物镜（数值孔径0.75）</td><td></td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>Olympus</td><td>Scan^R Acquisition软件（v.2.2.09）</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Olympus</td><td>Scan^R Analysis软件（v.1.2.0.6）</td><td></td></tr></tbody></table>

在全细胞群体中于单细胞水平研究细胞周期蛋白b的蛋白水解

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

细胞分裂过程中将染色体均等分配到两个子细胞中，是保证遗传稳定性的前提条件1。染色体分离过程中的错误是恶性肿瘤的特征之一，并与疾病进展相关2-4。纺锤体组装检查点（SAC）是一种有丝分裂监控机制，可将细胞阻滞在中期，直到每一条染色体都与有丝分裂纺锤体形成稳定的双极连接1。SAC通过干扰APC/C的活化亚基Cdc20，抑制securin和cyclin B的蛋白降解，从而阻止染色体分离和有丝分裂的退出。染色体连接异常会阻止SAC信号的沉默，导致APC/CCdc20持续受到抑制，直至问题解决，以避免染色体错误分离、非整倍性和恶性增殖1。
大多数研究染色体错误附着对APC/C依赖性蛋白水解影响的实验，均利用微管去聚合或微管稳定药物破坏纺锤体，以干扰染色体与微管之间的附着。由于干扰微管动力学会影响关键调控因子的运输和定位，这些操作存在引发人为假象的风险5。
为了研究在未受干扰的细胞群体中，纺锤体组装检查点（SAC）如何干扰有丝分裂期间细胞周期蛋白B（cyclin B）的APC/C依赖性蛋白水解过程，我们建立了一种基于组蛋白H2-GFP的系统，该系统可同时监测有丝分裂染色体的中期排列以及cyclin B的蛋白水解过程6。
为了描绘蛋白水解谱，我们构建了一种嵌合的细胞周期蛋白B报告分子，其C端带有SNAP基团6（图1）。在自标记反应中，SNAP基团能够与烷基鸟嘌呤载体（SNAP底物）形成共价键7,8（图1）。SNAP底物分子易于获得，并可携带多种不同的荧光染料。当将膜通透性的SNAP底物加入培养基后，嵌合的细胞周期蛋白B-SNAP分子即被标记7（图1）。标记反应完成后，细胞周期蛋白B-SNAP的荧光强度以类似脉冲-追踪反应的方式下降，荧光强度的变化反映了细胞周期蛋白B的降解水平6（图1）。该系统可并行监测大量细胞（或多个细胞群体）中依赖有丝分裂后期促进复合物/环体（APC/C）的蛋白水解过程。因此，该系统可能成为筛选能够干扰中期至后期转换过程中蛋白水解活性的试剂或小分子的有力工具。此外，最近研究表明，在小鼠和人类中，有丝分裂期间细胞周期蛋白B的持续合成可能通过维持其表达水平的稳定，发挥促进有丝分裂阻滞的重要作用9,10，本系统使我们能够将细胞周期蛋白B的蛋白水解作为动态平衡中的一个组成部分进行分析6。

从中期到后期的转变是通过后期促进复合物（APC/C）依赖性的泛素化作用以及随之发生的细胞周期蛋白B的降解所触发的。在此，我们建立了一个系统，该系统在脉冲-追踪标记后，可监测整个细胞群体中细胞周期蛋白B的蛋白水解过程，并有助于检测有丝分裂检查点的干扰作用。

在全细胞群体中于单细胞水平研究细胞周期蛋白B的蛋白水解

细胞分裂过程中将染色体均等分配至两个子细胞，是确保遗传稳定性的前提条件1。分配错误……

本实验的目的是监测周期蛋白B的蛋白水解如何调控后期起始及有丝分裂退出。首先在显微镜载玻片上接种周期蛋白B SNAP报告细胞，然后用荧光底物TMR star标记嵌合的周期蛋白B SNAP报告分子，以此实现上述目标。接下来，在显微镜工作站获取图像序列。最后一步是分析细胞并计算随时间变化的 TMR star 荧光强度，该强度反映了周期蛋白 B 的蛋白水解过程。最终，对活体报告细胞进行免疫荧光显微观察，可揭示有丝分裂过程中周期蛋白 B 蛋白水解的动力学特征。与现有的监测cyclone BGFP等方法相比，该技术的主要优势在于，cyclone B SNAP能够监测cyclone B的降解过程，而非整个蛋白质的表达水平。本实验所用的SNAP报告细胞最初需在对数生长期异步培养至少48小时。实验开始时，胰蛋白酶消化的接种步骤是将亚汇合状态的SNAP报告细胞接种至八孔显微镜培养室中，确保细胞在整个培养室表面均匀分布，随后进行离心。将10,000个细胞重悬于350微升不含酚红的正常培养基中。将细胞悬液转移至显微镜培养腔，接种到八孔显微镜培养腔中，使细胞在腔室中央达到最大密度。首先在腔室中加入300微升不含酚红的正常培养基。接下来，小心地将 5,000 个细胞加入显微镜培养腔的中心，以将细胞接种到 96 孔特殊光学培养板上，确保细胞在整个孔底表面均匀分布。根据所需含细胞孔的总数，将 5,000 个细胞重悬于 300 微升不含酚红的正常生长培养基中。根据需要调整细胞数量和悬浮培养基的总体积。然后将细胞悬液转移至96孔板，用于将细胞接种到96孔光学专用板上，使细胞在孔中央区域达到最大密度。在每孔中央小心加入含1,500个细胞的15微升无酚红正常培养基小液滴。这将限制细胞在孔板中央区域生长。在染色程序开始前30分钟，让所有接种的细胞在标准细胞培养条件下至少生长18小时。将不含酚红的正常生长培养基预热至37摄氏度。本实验中使用的快照底物为 TMR star，为便于操作，将 TMR star 溶解于 DMSO 中，配制浓度为 400 微摩尔的储存液。取 0.5 微升 TMR star 储存液，加入 200 微升温热的不含酚红的正常培养基中，得到终浓度为 1 微摩尔的标记工作液。接下来，移除异步生长细胞中的正常培养基，更换为上述标记工作液，在标准培养条件下孵育细胞 25 分钟。孵育25分钟后，移除标记培养基，并用37°C的无酚红正常生长培养基洗涤细胞4次。最后一次洗涤后，在300 µL 37°C的无酚红正常生长培养基中孵育细胞30分钟，然后转移至显微镜。更换为新鲜的37°C无酚红正常生长培养基，以去除未结合的SNAP底物，随后将细胞置于预热至37°C的泡沫盒中的加热块上，运输至显微镜进行观察。为尽量减少温度波动，在测量荧光强度前两小时，将气候箱的空气温度调节至37摄氏度（干式模式），使显微镜及其所有组件达到所需温度。为避免冷凝水形成并防止对显微镜造成后续损害，务必在设定湿度前进行预热。当整个显微镜系统达到 37 摄氏度时，将空气湿度调节至 60%，二氧化碳浓度调节至 5%。启动扫描或图像采集软件，并设定标准参数。定义需要分析的孔位位置。设定时间间隔（delta T）或采集周期时间，以及采集循环的总次数。在此演示中，为分析较多数量的孔，已预先选择硬件自动对焦。启动采集，并监控前两个采集周期。显微镜将首先聚焦于组蛋白H2 GFP信号，并在该通道下获取第一幅图像，随后更换滤光片并获取相应的TMR star图像。此过程将对孔内所有位置以及需要检测的每个孔重复进行，之后再开始下一个循环。为分析蛋白水解谱，启动Scan R分析软件。使用组蛋白H2-GFP所显示的细胞核对图像进行分析，将细胞核定义为主要对象，通过基于信号强度的阈值和分水岭算法来帮助分离相邻的细胞。为进行TMR star分析，应创建包含细胞核及细胞质的子对象。主要对象的重要属性包括X和Y位置、时间，以及主要对象的GFP最大强度和平均强度，还有总强度除以面积的比值。对于 TMR star 亚对象，切换至轨迹模式，以可视化该亚对象的平均 TMR star 荧光强度随时间的变化，或已分配给被分析主对象的细胞轨迹。观察较大量的细胞可获得初步的代表性及客观视图，但可通过门控筛选出持续至少 140 个周期且具有较高组蛋白 H2A-GFP 最大荧光强度的测量数据，从而缩小需分析的细胞数量。选择感兴趣的细胞轨迹，以在单细胞水平上同时观察组蛋白 H2A-GFP 与 TMR star 的荧光信号。使用右键鼠标点击目标细胞，生成可导出的图片。图库用于展示组蛋白 H2A-GFP 和每个时间点的 Cyclin B-SNAP-TMR*。将扫描分析软件切换至群体模式，并在点印迹图上圈定目标细胞所在的区域。对门控区域应用新的点图窗口，并随时间可视化TMR star荧光强度的平均值。将数据导出至Microsoft Excel进行进一步计算。此处的图示展示了细胞周期蛋白B的动力学，表现为TMR star荧光强度曲线，该细胞在胞质收缩后经历正常的有丝分裂，且在核膜破裂（NEBD）时未出现染色体错位迹象，如红色三角形所示。TMR staph荧光强度迅速增加，直至达到等形态窗口。当细胞进入前中期时，只要细胞继续经历前期和中期，荧光强度会保持在稳定水平，随后开始迅速下降。一旦所有染色体建立了稳定的中期板，这种下降即发生在染色体分离之前。在后期（由曲线晚期有丝分裂中的蓝点指示），染色质开始去凝缩，细胞逐渐转变为末期形态。当荧光强度曲线趋近于平台期时，该平台期低于有丝分裂前的平台期。该技术为有丝分裂领域的研究人员探索调控有丝分裂进程的周期性、蛋白降解与合成之间的紧密平衡奠定了基础。

studying-proteolysis-cyclin-b-at-single-cell-level-whole-cell

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在整个细胞群在单细胞水平上研究细胞周期蛋白B的蛋白水解

基于FRET的报告分子正越来越多地用于监测活细胞中激酶和磷酸酶的活性。本文介绍了一种利用基于FRET的报告分子评估细胞周期依赖性靶蛋白磷酸化变化的方法。...

通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

通过本方案，利用流式细胞术可轻松测定细胞群体的细胞周期位置，或了解信号如何影响细胞增殖。我们报告了一种简单的实验方法，用于对细胞进行染色并定量分析其在细胞周期中的位置。...

哺乳动物细胞周期位置分析

为了研究蛋白质稳态、应激与衰老之间的关系，我们利用遗传操作简便的多细胞生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

我们报道了一种用于研究细胞和胚胎的装置及新方法。单个细胞被精确地排列在微腔阵列中。这种三维限制更接近生理条件下的三维环境，有助于细胞器的定向排列。通过控制细胞形态，该装置可最大限度地减少标准检测中常见的变异性。...

在三维限域中排列单细胞与单胚胎：一种用于高内涵筛选的新装置

本文概述了如何研究一种（细胞周期）激酶在线粒体中的定位，以及如何确定其在线粒体内的亚结构定位和潜在的线粒体底物或靶标。将蛋白强制表达于线粒体中，是研究目的蛋白在线粒体定位后所产生功能效应的有效工具。...

研究核细胞周期激酶Cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

蛋白质丰度反映了蛋白质合成与蛋白质降解的速率。本文介绍了在模式单细胞真核生物酿酒酵母（Saccharomyces...

蛋白质降解的放线菌酮追踪分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。...

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

我们介绍一种用于HeLa细胞的双胸苷同步化方案，随后利用高分辨率共聚焦显微镜进行分析。该方法对于获得大量同步从S期进入有丝分裂期的细胞至关重要，从而能够研究兼具间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。...

结合有丝分裂细胞同步化与高分辨率共聚焦显微镜技术研究多功能细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外...

通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

本文介绍了两种用于表征B淋巴细胞在免疫突触（IS）形成过程中细胞极化事件的方法。第一种方法涉及对细胞器向突触膜募集以及细胞骨架在突触膜处重排的定量分析。第二种为生化方法，用于表征发生向免疫突触极化的中心体在组成上的变化。...

研究B细胞在免疫突触形成过程中的细胞器动力学

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

了解如何使用脉冲追踪标记和荧光显微镜技术在活细胞中监测细胞周期蛋白B的蛋白水解过程。该方法揭示了有丝分裂过程中细胞周期蛋白B降解动力学，为细胞周期调控研究提供了新工具。

在全细胞群体中于单细胞水平研究细胞周期蛋白B的蛋白水解

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