Name: 一种实用的新的方法来提取基因组DNA保存血浆蛋白从血液采集套件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习从P100血浆蛋白保存管中同时提取基因组DNA和血浆的新方法。该方法通过密度梯度离心分离白膜层，简化操作流程并提高DNA质量，实现单次采血完成双重检测，适用于基因组学和蛋白质组学研究。

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1. 样本采集
<ol>
 <li>在获得受试者充分知情同意后，采集其血液样本。每位受试者使用 P100 管（BD Diagnostics，Franklin Lake，NY，USA）采集 4 至 5 ml 血液。为便于比较，同时使用 EDTA 管采集血液。</li>
 <li>BD P100 管内含 15.8 ml 喷雾干燥的 K2EDTA 以及冻干的广谱蛋白酶抑制剂专有混合物，用于防止血液凝固并稳定血浆蛋白。管内还含有机械分离层。采集全血后，将两种采血管在室温下放置 60 分钟至过夜，直至进行后续处理。</li>
 <li>将 BD P100 管在室温下以 2,500 g 离心 15 分钟。将机械分离层上方的血浆转移至微量离心管中。</li>
 <li>将含有分离层下方压缩血液的 P100 管于 -80 °C 保存，直至开始进行 DNA 提取。</li>
</ol>
2.1 从 P100 管血液中提取（P100_DNA）
<ol>
 <li>血浆提取后，将 P100 管保存在 -80 °C 条件下。在 3 至 4 个月内，从冰箱中取出含有压缩血液的 P100 管，在 37 °C 水浴中解冻 5 分钟（图 1A）。去除位于分离层上方的任何残留血浆。在 P100 管的分离层上方加入 2 ml 17% 蔗糖溶液（实验室内部测试的梯度溶液——未发表数据）（图 1B）。在室温下以 2,500 g 离心 20 分钟；此过程将机械分离层推至管顶，并形成包含白膜层在内的三层溶液（图 1C）。使用无菌的弯头金属回形针手动取出分离层（图 1D）。</li>
 <li>从每根管中取出机械分离层后（图 1D），移除并弃去上层的蔗糖溶液。将中间层（即白膜层，BC 层）转移至一支无菌的 15 ml 锥形管中。加入磷酸盐缓冲液（PBS）使白膜层体积达到 3 ml。使用 Qiagen Puregene 血液试剂盒中的试剂，按照制造商推荐的方法提取白膜层中的 DNA；但离心速度采用 2,500 g（而非 2,000 g）。</li>
 <li>为裂解并去除红细胞（RBC），向 3 ml 白膜层中加入 9 ml 红细胞裂解液。轻轻颠倒混匀各管数次，在室温下孵育 10 分钟，期间偶尔轻柔颠倒。在 2,500 g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。向每管中残留的沉淀加入 3 ml 细胞裂解液，涡旋振荡 15 秒。再加入 1 ml 蛋白沉淀液，涡旋振荡 15 秒。</li>
 <li>在 2,500 g 条件下离心 5 分钟，将上清液转移至另一支含有 3 ml 100% 异丙醇的新鲜 15 ml 锥形管中。将新管颠倒 10 次，然后在 2,500 g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，加入 1 ml 70% 乙醇。轻轻颠倒锥形管数次，以松动并清洗 DNA 沉淀。在 2,500 g 条件下离心 1 分钟。将沉淀在室温下干燥 3 分钟（将管倒置），然后加入 250 µl 重悬溶液，在 37 °C 下孵育 10 分钟以溶解 DNA，随后转移至预先标记的 1.7 ml 微量离心管中。将管保存在 -80 °C，直至使用。</li>
</ol>
2.2 从EDTA抗凝管血液中提取DNA（EDTA_DNA）
<ol>
 <li>用于常规免疫血液学检测的全血采集于喷雾涂有10.8 mg K2EDTA的塑料真空采血管中，并储存于-80 °C。由于这些试管不含机械分离装置，因此DNA提取过程不包括涉及机械分离的步骤（2.1.1和2.1.2）。</li>
 <li>在血液储存后3至4个月内，使用KingFisher Flex（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）进行DNA提取。该系统是一种基于磁性颗粒技术的自动化DNA提取系统，包括细胞裂解/DNA结合、多次洗涤步骤以及DNA洗脱。</li>
 <li>DNA提取所用试剂盒为KingFisher Flex 24 DNA Blood kit（Qiagen, Germany）。</li>
</ol>
3. DNA 定量与质量评估
通过PicoGreen法、光谱学和电泳相结合的方法，对基因组DNA的数量、质量和完整性进行了评估。
<ol>
 <li>基因组DNA的浓度通过Nanodrop和Picogreen定量法测定。</li>
 <li>纯度通过Nanodrop分光光度计测得的260/280比值确定。</li>
 <li>取500 ng样品上样至1%琼脂糖凝胶，以评估DNA的完整性（降解情况）。</li>
</ol>
4. 基因分型检测与质量控制
<ol>
 <li>随机选取五个 P100_DNA 及其对应的 EDTA_DNA 样本，使用定制的 Immunochip（Immuno DNA 分析微珠芯片）进行进一步分析。Immunochip 是一种 Infinium 基因分型芯片，包含 196,524 个多位点基因多态性位点，专为免疫遗传学研究设计5。</li>
 <li>对于每个样本，取 200 ng DNA 进行扩增、片段化、沉淀，并重悬于适当的杂交缓冲液中。</li>
 <li>变性后的样本在 48 °C 下与 Immunochip 杂交，时间不少于 16 小时。</li>
 <li>杂交完成后，对 Immunochip 进行单碱基延伸反应并染色处理。</li>
 <li>随后使用 Illumina Hiscan 微珠阵列扫描仪对 Immunochip 进行成像，并将标准化的微珠信号强度数据导入 Illumina GenomeStudio 软件，转换为基因型。基因型的判读采用 GenomeStudio 的自动判读算法。质量控制包括剔除基因分型成功率 &lt;95% 的单核苷酸多态性（SNP）位点。</li>
 <li>SNP 分型成功率用于评估 Immunochip 检测的效率，其计算方式为：芯片上所有检测位点（每张芯片编码 196,524 个 SNP）中，获得足够信号强度和质量以完成自动化基因型判读的位点所占百分比。高质量 DNA（A260/A280 比值 ≥1.8 且无降解）预期应达到与 Immunochip 检测中所含 HapMap 对照 DNA 相当或更高的分型成功率。质量控制要求在每套数据集中剔除分型成功率 &lt;95% 的 SNP 位点。</li>
</ol>

<ol><li>Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intrinsic+proteolytic+activities+moderates+preanalytical+variability+and+instability+of+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma.</a> Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).</li>
<li>Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+method+for+extraction+of+DNA+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood.</a> Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).</li>
<li>Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedure+for+DNA+isolation+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood+useful+in+clinical+molecular+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing.</a> Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).</li>
<li>Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+DNA+purification+from+samples+of+highly+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood.</a> Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).</li>
<li>Cortes, A., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promise+and+pitfalls+of+the+Immunochip%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Promise and pitfalls of the Immunochip.</a> Arthritis Research & Therapy. 13, 101(2011).</li>
<li>Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+extraction+method+from+blood+clots+for+studies+requiring+both+host+and+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA.</a> Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).</li>
<li>Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+preparation+of+genomic+DNA+from+easily+obtainable+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood.</a> Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).</li>
<li>Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+genomic+DNA+purified+from+clotted+blood+samples+for+single+nucleotide+polymorphism+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).</li>
<li>Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+extraction+of+DNA+from+blood+collected+into+serum+separator+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes.</a> Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).</li>
<li>Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+cryopreserved+clotted+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood.</a> BioTechniques. 15, 18-20 (1993).</li>
<li>Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+isolation+from+clotted+blood+extricated+rapidly+from+serum+separator+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes.</a> Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).</li>
<li>Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+method+for+extraction+of+DNA+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood.</a> Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).</li>
<li>Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedure+for+DNA+isolation+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood+useful+in+clinical+molecular+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing.</a> Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).</li>
<li>Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+sample+collection+and+storage+methods+for+multicenter+immunologic+research+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children.</a> Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).</li>
<li>Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+DNA+purification+from+samples+of+highly+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood.</a> Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).</li>
<li>Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+points+in+mapping+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fine points in mapping autoimmunity.</a> Nature. 43, 1173-1174 (2011).</li>
<li>Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+newly+identified+loci+for+autoimmune+thyroid+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2012).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

许多人类疾病具有遗传因素，探索人类疾病的遗传基础需要越来越多的高质量DNA。遗传学研究中最常用的DNA来源是抗凝全血。由于大多数临床实验室在表型结果调查中首先进行生化、血清学和病毒学检测，血液通常被采集到血浆管中。在血浆采集完成后，剩余的压缩血液通常会被丢弃。因此，当需要进行遗传学研究或检测DNA时，必须对同一患者再次采血。而这些被丢弃的压缩血液实际上是一种潜在的DNA来源，因为其中含有白细胞。因此，利用血浆管中的压缩血液可以更高效地使用已采集的血样，无需额外采血或召回患者进行二次抽血。
已有多种方法用于从凝固或凝块血液的白细胞中提取DNA6-10。这些方法的大多数挑战与血浆采集管的设计有关。早期的血浆采集管含有由凝胶制成的分离层（凝胶分离层），在离心后形成屏障，将血细胞（位于分离层下方）与血浆（位于分离层上方）分隔开。为防止血细胞被凝胶材料污染，必须首先小心地将分离层从采集管中移除11。随后需对血凝块进行破碎，以确保高效提取DNA。然而，破碎过程常导致血液样本显著损失，并降低DNA得率。为减少样本损失并优化操作流程，曾采用小孔径滤网通过...

<table><tbody><tr><td>BD P100 管</td><td>BD Diagnostics</td><td>366448</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 管</td><td>BD Diagnostics</td><td>367863</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>回形针</td><td>办公用品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>红细胞 (RBC)</td><td>Qiagen</td><td>158389 (试剂盒)</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>BioSprint 96 DNA 血液试剂盒 (48)</td><td>Qiagen</td><td>940054</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>人类免疫 DNA 分析微珠芯片试剂盒</td><td>Illumina</td><td>WG-352-1001</td><td></td></tr><tr><td>微珠阵列读取仪</td><td>Illumina</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>GenomeStudio 软件</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于从血液采集套件中提取基因组dna并同时保存血浆蛋白的实用且新颖的方法

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

血液的细胞成分或液体成分均可用于实验室检测。使用不同的采血管可决定所分析的血液成分类型（全血、血浆或血清）。研究人类疾病遗传基础的实验室通常以含EDTA的真空采血管采集的抗凝全血作为遗传学/基因组学分析的DNA来源。由于大多数临床实验室在表型结果研究中，首先进行生化、血清学和病毒学检测，因此也会使用含肝素的采血管（血浆管）采集抗凝血液。因此，当需要同时平行分析基因组和蛋白质组数据而获取DNA和血浆时，通常会分别采集EDTA管和肝素管的血液样本。如果能够使用单一采血管采集血液，并同时用于血浆和DNA的提取，则该方法将优于现有方法。在提取血浆后，利用剩余的浓缩血细胞作为基因组DNA的替代来源，可减少处理的血样量，降低每位患者所需的采血次数，最终节省时间和资源。
BD P100 血液采集系统用于血浆蛋白保存，是对以往血浆或血清采集管的改进方法1，旨在稳定血液中的蛋白质成分，从而更有利于从人血中发现蛋白质生物标志物并开展蛋白质组学实验。BD P100 采血管含有 15.8 ml 喷雾干燥的 K2EDTA 以及冻干的专有广谱蛋白酶抑制剂混合物，以防止血液凝固并稳定血浆蛋白。此外，该采血管还包含一种机械分离器，在离心后可在血浆与细胞沉淀之间形成物理屏障。目前已有少数方法用于从旧式血浆管中采集的凝血样本中提取 DNA2-4。这些方法面临的主要挑战与管内分离材料的类型（凝胶分离剂）有关，包括难以回收凝固的血液、破碎或分散血块操作不便，以及分离凝胶阻碍血块提取等问题。
我们介绍了首个从BD P100新型采血管中提取并纯化基因组DNA的方法。我们将P100管中获得的DNA样本质量与EDTA管中的样本进行了比较。该方法简单高效，主要包括以下四个步骤：1）使用带有机械分离器的血浆采集管BD P100（BD Diagnostics，美国马里兰州斯帕克斯）进行血液采集；2）利用蔗糖溶液与无菌回形针金属钩的组合去除机械分离器；3）分离含有白细胞的白膜层；4）采用常规商用DNA提取试剂盒或类似的标准方案，从白膜层中提取基因组DNA。

DNA 质量评估与浓度测定
P100_DNA 的得率显著低于 EDTA_DNA（表 1 和 表 2）。P100_DNA 和 EDTA_DNA 样本组的 DNA 纯度（以 260/280 比值表示）相似（表 1 和 表 2）。每组样本内的 DNA 质量相对均一，尽管在 EDTA_DNA 样本中可见一定程度的降解，表现为轻微拖尾（图 2）。表现出更明显降解迹象的 EDTA_DNA 样本其 DNA 浓度也有所降低。
基因分型
比较了EDTA_DNAs和P100_DNAs的基因分型检出率。两者均表现出相似的检出率，且均与内部HapMap对照DNA相当（表3）。
...

我们正在描述一种从用于血浆/血清学检测的全血样本中分离基因组DNA的新方法。在采集血浆后，通常会丢弃剩余的浓缩血液。我们的新方法相较于现有技术具有显著改进，可在单次采血后同时获得DNA和血浆，无需额外采集血液样本。

一种用于从血液采集套件中提取基因组DNA并同时保存血浆蛋白的实用且新颖的方法

实验室检测可针对血液的细胞成分或液体成分进行。使用不同的采血管可决定所获取的血液成分……

本视频将介绍一种实用且新颖的方法，用于从新型 BDP 100 血浆蛋白质保存系统（称为 P 100 管）中提取基因组 DNA。过去，从血清或血浆管中提取 DNA 是一种相当常见的操作，但将这种新型 P 100 管与本文所述提取方法相结合，提供了一种更简便的新途径，能够以更少的操作步骤获得质量更高的 DNA。P 100 管内壁涂有 EDTA 钾盐和蛋白酶抑制剂。这可以防止凝血并稳定血浆蛋白。采集血液时使用此类试管，目的是在离心后获取用于检测的血浆。P 100 管中的血液会根据密度不同分离成若干层：顶部为血浆，底部为红细胞，中间为白细胞。位于这两层之间的淡黄色层。这些试管通常主要用于获取血浆。利用该血浆可进行多项检测，如抗体水平和蛋白质浓度测定。通常会弃去血沉棕黄层，但如本视频所示，其中含有足量的DNA，可用于多项分析，包括测序、基因分型、生物标志物鉴定等。P100管由三个主要部分组成：管帽、管体和分离器。机械分离器会迁移至血沉棕黄层上方位置。为了获得血沉棕黄层，需要增加分离器到血沉棕黄层的距离。这可以通过添加17%蔗糖来实现。通常情况下，血沉棕黄层会随P 102一同被丢弃，但如本视频所示，在从-80℃冰箱中取出P 100管之前，完全可以从该层轻松获取足量的DNA，用于进行多项分析检测。将水浴预热至 37 摄氏度，将每支 P 100 管放入水浴中，孵育约 5 分钟以完全融化所有样本。待所有样本完全融化后，需移除分离层上方残留的任何血清。随后，在分离层上方加入 5 毫升 17% 蔗糖溶液。加入蔗糖后，将所有试管在 2,500 ×g 条件下离心 20 分钟。此时分离层已位于管子顶部，并与血沉棕黄层分离，可轻松移除。用化学擦拭纸喷洒70%乙醇，并通过彻底擦拭整个表面来对纸夹钩进行灭菌。用无菌的纸夹夹住P 100管，使其呈45度角。轻轻向上拉动分离器边缘，同时将其引导至生物危害袋中，开始将分离器从管中取出。分离器取出后，尽可能去除 17% 蔗糖层，但不要扰动白膜层或红细胞层，此时白膜层应位于试管最上层。将此层转移至一个新的已标记的 15 毫升锥形管中。每管所移除的白膜层体积可能不同，但应少于 3 毫升。为了使所有离心管的体积归一化，需加入足量的磷酸盐缓冲液（PBS），使每管体积达到 3 毫升。现在所有血沉棕黄层已悬浮于相同体积的溶液中，必须通过加入 9 毫升红细胞裂解液（RBC lysis solution）去除残留的红细胞。接下来，在室温孵育10分钟期间，反复倒置离心管数次，以分离裂解的红细胞与血沉棕黄层。在2,500 ×g条件下离心5分钟，形成用于提取DNA的沉淀。将上清液倒入液体生物危害废物容器中，每管中保留少量液体，以便重新悬浮沉淀。涡旋振荡离心管，使沉淀脱离管壁并充分重悬。加入3毫升细胞裂解液，剧烈涡旋至少10秒。细胞裂解后，蛋白质和DNA已游离悬浮于溶液中，需进行分离。首先加入1毫升蛋白质沉淀液，强力涡旋（VORTEXING）至少15秒以沉淀蛋白质。然后，将离心管在2,500 ×g条件下离心5分钟，使蛋白质形成沉淀。正确操作步骤。为每个待处理的样品准备一个新的15毫升锥形管，并做好标记。转移3毫升100%异丙醇。蛋白质沉淀并离心后，每个离心管中应出现一个相对较大的沉淀以及透明、大部分为水相的上清液。将各管中含有 DNA 的上清液小心倾入对应编号的异丙醇管中（该异丙醇管已在上一步离心前准备好）。加入异丙醇后，溶液中的 DNA 将沉淀形成少量白色絮状物。将所有离心管颠倒混匀 50 次，以确保充分混合。随后，将所有离心管在 2,500 ×g 下离心 3 分钟，以形成 DNA 沉淀。DNA 通常可见为离心管底部的一个微小白点状沉淀，但若 DNA 产量较低，则可能肉眼不可见。继续完成所有样品的提取，直至测定其浓度。无论是否存在DNA沉淀，均需弃去异丙醇溶液。加入70%乙醇以观察DNA，此步骤可去除可能干扰后续分析的任何残留杂质。在2,500 ×g条件下离心一分钟。为确保DNA沉淀牢固附着于管底，将所有70%乙醇从管中弃去，然后将离心管倒置于洁净的纸巾上，室温空气干燥一小时。继续实验步骤时，试管中不应残留可见的乙醇。提取过程的最后一步是将 DNA 重新悬浮于溶液中。对于大多数提取操作，可使用 DNA 水合溶液或水。对于产生少量或无可见DNA絮状物或沉淀的样品，加入少于250微升的DNA水化溶液，轻柔地逐步涡旋振荡以悬浮DNA。最后，将所有悬浮的DNA转移至离心管中。此时，可使用NanoDrop或其他分光光度计测定DNA的浓度和纯度。通常，DNA 纯度应接近于仅为获取 DNA 浓度而采集的全血样本（使用含钾 EDTA 管采集）所提取的 DNA 纯度。DNA 浓度取决于起始材料的量，一般范围为每微升 50 纳克至近 1000 纳克，平均在每微升 200 纳克范围内。采用本方案的优势有两点：首先，它允许临床医生利用一次采血完成两项临床检测，而无需进行两次采血。其次，通过采用现代的机械分离管而非上一代产品，简化了获取含DNA细胞的过程。使用上一代凝胶分离管时，凝胶分离层本身和血凝块均会成为阻碍含DNA细胞的屏障。而使用P 100管时，可通过17%蔗糖密度分离轻松去除机械分离层。这是对一次典型DNA提取结果的Nano Drop读数截图。采用此方法对P 109样本进行提取后，得到250微升溶液，DNA浓度为每微升209纳克。总产量约为52微克。260与280的比值是DNA纯度的主要衡量指标，其数值为1.88，落在1.8至1.9的最佳范围内。DNA纯度的次要衡量指标是260与230的比值，其数值为2.35，接近预期的2至2.2范围。这些是较为典型的结果。实际上，提取的产量和质量会因提取前血液的体积和状态而有所不同，可通过标准琼脂糖凝胶电泳结合溴化硫代染色进行分析。进一步的质量检测表明，从 P 100 管中提取的基因组 DNA 与从全血中提取的 DNA 同样完整。从每条含有基因组DNA的泳道顶部出现的明亮而厚实的条带可以明显看出这一点。与之前的方法相比，使用该方案有两个主要优势。首先，它将通常需要两次采血的过程合并为一次。其次，该方案比使用常规SST凝胶分离管的方案更快捷、更简便。当需要进行遗传学和血清学检测时，临床医生通常需要采集两管血液，以避免破坏凝结的血块。通常的做法是使用一管被称为“金帽”的SST凝胶分离管和一管被称为“紫帽”的含钾EDTA管，从SST管中分离血清，并从紫帽管中提取DNA。而使用本方法时，仅需采集一管红帽P100管即可。尽管一些熟悉凝胶分离法提取DNA的机构可能已经在采集一份样本管用于血清学和遗传学检测。本文介绍的方法是对现有凝胶分离法的渐进但显著的改进。两种方法均需要去除某种分离介质，但凝胶通常比塑料凝胶更易造成污染。分离管要求在提取 DNA 前，将凝固的血液通过金属网筛进行均质化处理。这种均质化过程可能较为繁琐，且当大量不含 DNA 的红细胞存在时，会使得 DNA 提取变得更加困难。本 P 100 提取方法可将含有 DNA 的白细胞与血细胞比容（hematocrit）分离，从而减少红细胞对 DNA 提取的干扰。与上一代凝胶分离管相比，使用 P 100 血浆管提取 DNA 具有诸多优势。P 100 管中含有 EDTA，可抑制依赖镁离子的内切核酸酶，同时作为抗凝剂防止血液凝固。最终结果是 DNA 完整性更高，且提取流程更为简便，尤其是避免了破碎和均质化凝固血液的步骤。此外，去除血浆的血液可无限期地保存在P100管中，已测试可稳定保存长达三年，直至需要提取DNA。此外，临床医生可通过较少的采血次数获得更有价值的患者数据，从而减少接受相关操作的患者的痛苦。

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