一种用于从血液采集套件中提取基因组DNA并同时保存血浆蛋白的实用且新颖的方法

本视频将介绍一种实用且新颖的方法，用于从新型 BDP 100 血浆蛋白质保存系统（称为 P 100 管）中提取基因组 DNA。过去，从血清或血浆管中提取 DNA 是一种相当常见的操作，但将这种新型 P 100 管与本文所述提取方法相结合，提供了一种更简便的新途径，能够以更少的操作步骤获得质量更高的 DNA。P 100 管内壁涂有 EDTA 钾盐和蛋白酶抑制剂。

这可以防止凝血并稳定血浆蛋白。采集血液时使用此类试管，目的是在离心后获取用于检测的血浆。P 100 管中的血液会根据密度不同分离成若干层：顶部为血浆，底部为红细胞，中间为白细胞。

位于这两层之间的淡黄色层。这些试管通常主要用于获取血浆。利用该血浆可进行多项检测，如抗体水平和蛋白质浓度测定。

通常会弃去血沉棕黄层，但如本视频所示，其中含有足量的DNA，可用于多项分析，包括测序、基因分型、生物标志物鉴定等。P100管由三个主要部分组成：管帽、管体和分离器。机械分离器会迁移至血沉棕黄层上方位置。

为了获得血沉棕黄层，需要增加分离器到血沉棕黄层的距离。这可以通过添加17%蔗糖来实现。通常情况下，血沉棕黄层会随P 102一同被丢弃，但如本视频所示，在从-80℃冰箱中取出P 100管之前，完全可以从该层轻松获取足量的DNA，用于进行多项分析检测。

将水浴预热至 37 摄氏度，将每支 P 100 管放入水浴中，孵育约 5 分钟以完全融化所有样本。待所有样本完全融化后，需移除分离层上方残留的任何血清。随后，在分离层上方加入 5 毫升 17% 蔗糖溶液。加入蔗糖后，将所有试管在 2,500 ×g 条件下离心 20 分钟。此时分离层已位于管子顶部，并与血沉棕黄层分离，可轻松移除。

用化学擦拭纸喷洒70%乙醇，并通过彻底擦拭整个表面来对纸夹钩进行灭菌。用无菌的纸夹夹住P 100管，使其呈45度角。轻轻向上拉动分离器边缘，同时将其引导至生物危害袋中，开始将分离器从管中取出。

分离器取出后，尽可能去除 17% 蔗糖层，但不要扰动白膜层或红细胞层，此时白膜层应位于试管最上层。将此层转移至一个新的已标记的 15 毫升锥形管中。每管所移除的白膜层体积可能不同，但应少于 3 毫升。

为了使所有离心管的体积归一化，需加入足量的磷酸盐缓冲液（PBS），使每管体积达到 3 毫升。现在所有血沉棕黄层已悬浮于相同体积的溶液中，必须通过加入 9 毫升红细胞裂解液（RBC lysis solution）去除残留的红细胞。

接下来，在室温孵育10分钟期间，反复倒置离心管数次，以分离裂解的红细胞与血沉棕黄层。在2,500 ×g条件下离心5分钟，形成用于提取DNA的沉淀。将上清液倒入液体生物危害废物容器中，每管中保留少量液体，以便重新悬浮沉淀。涡旋振荡离心管，使沉淀脱离管壁并充分重悬。

加入3毫升细胞裂解液，剧烈涡旋至少10秒。细胞裂解后，蛋白质和DNA已游离悬浮于溶液中，需进行分离。首先加入1毫升蛋白质沉淀液，强力涡旋（VORTEXING）至少15秒以沉淀蛋白质。然后，将离心管在2,500 ×g条件下离心5分钟，使蛋白质形成沉淀。

正确操作步骤。为每个待处理的样品准备一个新的15毫升锥形管，并做好标记。转移3毫升100%异丙醇。

蛋白质沉淀并离心后，每个离心管中应出现一个相对较大的沉淀以及透明、大部分为水相的上清液。将各管中含有 DNA 的上清液小心倾入对应编号的异丙醇管中（该异丙醇管已在上一步离心前准备好）。加入异丙醇后，溶液中的 DNA 将沉淀形成少量白色絮状物。将所有离心管颠倒混匀 50 次，以确保充分混合。随后，将所有离心管在 2,500 ×g 下离心 3 分钟，以形成 DNA 沉淀。DNA 通常可见为离心管底部的一个微小白点状沉淀，但若 DNA 产量较低，则可能肉眼不可见。继续完成所有样品的提取，直至测定其浓度。

无论是否存在DNA沉淀，均需弃去异丙醇溶液。加入70%乙醇以观察DNA，此步骤可去除可能干扰后续分析的任何残留杂质。在2,500 ×g条件下离心一分钟。为确保DNA沉淀牢固附着于管底，将所有70%乙醇从管中弃去，然后将离心管倒置于洁净的纸巾上，室温空气干燥一小时。

继续实验步骤时，试管中不应残留可见的乙醇。提取过程的最后一步是将 DNA 重新悬浮于溶液中。对于大多数提取操作，可使用 DNA 水合溶液或水。

对于产生少量或无可见DNA絮状物或沉淀的样品，加入少于250微升的DNA水化溶液，轻柔地逐步涡旋振荡以悬浮DNA。最后，将所有悬浮的DNA转移至离心管中。此时，可使用NanoDrop或其他分光光度计测定DNA的浓度和纯度。

通常，DNA 纯度应接近于仅为获取 DNA 浓度而采集的全血样本（使用含钾 EDTA 管采集）所提取的 DNA 纯度。DNA 浓度取决于起始材料的量，一般范围为每微升 50 纳克至近 1000 纳克，平均在每微升 200 纳克范围内。采用本方案的优势有两点：首先，它允许临床医生利用一次采血完成两项临床检测，而无需进行两次采血。

其次，通过采用现代的机械分离管而非上一代产品，简化了获取含DNA细胞的过程。使用上一代凝胶分离管时，凝胶分离层本身和血凝块均会成为阻碍含DNA细胞的屏障。而使用P 100管时，可通过17%蔗糖密度分离轻松去除机械分离层。

这是对一次典型DNA提取结果的Nano Drop读数截图。采用此方法对P 109样本进行提取后，得到250微升溶液，DNA浓度为每微升209纳克。总产量约为52微克。

260与280的比值是DNA纯度的主要衡量指标，其数值为1.88，落在1.8至1.9的最佳范围内。DNA纯度的次要衡量指标是260与230的比值，其数值为2.35，接近预期的2至2.2范围。

这些是较为典型的结果。实际上，提取的产量和质量会因提取前血液的体积和状态而有所不同，可通过标准琼脂糖凝胶电泳结合溴化硫代染色进行分析。进一步的质量检测表明，从 P 100 管中提取的基因组 DNA 与从全血中提取的 DNA 同样完整。

从每条含有基因组DNA的泳道顶部出现的明亮而厚实的条带可以明显看出这一点。与之前的方法相比，使用该方案有两个主要优势。首先，它将通常需要两次采血的过程合并为一次。

其次，该方案比使用常规SST凝胶分离管的方案更快捷、更简便。当需要进行遗传学和血清学检测时，临床医生通常需要采集两管血液，以避免破坏凝结的血块。通常的做法是使用一管被称为“金帽”的SST凝胶分离管和一管被称为“紫帽”的含钾EDTA管，从SST管中分离血清，并从紫帽管中提取DNA。而使用本方法时，仅需采集一管红帽P100管即可。

尽管一些熟悉凝胶分离法提取DNA的机构可能已经在采集一份样本管用于血清学和遗传学检测。本文介绍的方法是对现有凝胶分离法的渐进但显著的改进。两种方法均需要去除某种分离介质，但凝胶通常比塑料凝胶更易造成污染。

分离管要求在提取 DNA 前，将凝固的血液通过金属网筛进行均质化处理。这种均质化过程可能较为繁琐，且当大量不含 DNA 的红细胞存在时，会使得 DNA 提取变得更加困难。本 P 100 提取方法可将含有 DNA 的白细胞与血细胞比容（hematocrit）分离，从而减少红细胞对 DNA 提取的干扰。

与上一代凝胶分离管相比，使用 P 100 血浆管提取 DNA 具有诸多优势。P 100 管中含有 EDTA，可抑制依赖镁离子的内切核酸酶，同时作为抗凝剂防止血液凝固。最终结果是 DNA 完整性更高，且提取流程更为简便，尤其是避免了破碎和均质化凝固血液的步骤。

此外，去除血浆的血液可无限期地保存在P100管中，已测试可稳定保存长达三年，直至需要提取DNA。此外，临床医生可通过较少的采血次数获得更有价值的患者数据，从而减少接受相关操作的患者的痛苦。