Name: 为外植体含量的颅间充质细胞行为评定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解颅间充质细胞在神经管形成过程中的行为，使用小鼠胚胎外植体培养结合活细胞成像技术。该方法支持药理学干预，为研究神经褶抬升机制提供重要工具。

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本工作由 I.E.Z. 获得的 R01-HD058629 项目资助。

1. 细胞外基质包被培养皿或盖玻片的制备
<ol>
	<li>通过将ECM基质溶解于PBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液，Invitrogen，#14040-133）中制备ECM储存液。使用0.2 mm注射器滤器（VWR，#28145-495）过滤，并分装后于-80 °C冻存。</li>
	<li>用PBS将ECM储存液稀释至所需浓度。对于MaxGel，需将其稀释于DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基，Invitrogen，#11995-065）中。</li>
	<li>若需进行免疫荧光染色，将12 mm圆形玻璃盖玻片（VWR，#89015-724）浸入乙醇中进行灭菌，随后在空气中晾干。此步骤应在无菌超净台内完成。若不进行免疫荧光染色，则跳至步骤1.5。</li>
	<li>将灭菌后的盖玻片放入24孔板（Corning，#3526）的每个孔中。</li>
	<li>向24孔板的每孔中加入0.5 ml稀释后的基质溶液，在室温下孵育3小时。</li>
	<li>吸除ECM溶液，并用PBS洗涤三次。</li>
	<li>吸除PBS，立即使用，或用封口膜包裹后于4 °C保存，最多可保存2周。</li>
</ol>
2. 解剖工具的准备
根据制造商的方案制备添加了活性炭的Sylgard板。这些平板具有抗性的黑色背景，可为固定胚胎提供支撑，其颜色还能提供良好的对比度，有助于观察半透明的胚胎。
<ol>
	<li>制备培养皿时，将150 g A组分液体、15 g B组分和1 g活性炭粉末（World Precision Instruments，货号#SYLG184）直接称量至三口烧杯中。使用木制冰棒棒或压舌板混合均匀。将混合物倒入玻璃或塑料的100 cm培养皿中。使用小型丁烷喷灯，距离培养皿上方约10至12英寸，烧除任何气泡。盖上皿盖，静置至少24小时使其凝固。</li>
	<li>制备解剖工具时，将一枚微型针（直径0.1 mm）插入针 holder 中（Fine Scientific Tools，货号分别为#26002-10和#26018-17）； alternatively，也可使用镊子辅助将26号针头（BD，货号#309597）弯成直角作为解剖工具。使用研磨石（Fine Scientific Tools，货号#29008-22）对Student Dumont #5镊子（Fine Science Tools，货号#91150-20）进行 sharpening 处理。</li>
	<li>使用前，所有解剖工具均需用70%乙醇灭菌。</li>
</ol>
3. 胚胎的收集
<ol>
	<li>根据动物使用委员会的规定，在交配后8.5天处死定时妊娠小鼠，并取出子宫。</li>
	<li>将子宫置于含有无菌PBS的塑料培养皿中。</li>
	<li>用无菌PBS清洗子宫一次。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用镊子小心地将胚胎从蜕膜中分离出来。</li>
	<li>去除胚外膜，如有需要可保存用于基因分型。</li>
	<li>通过计数体节对胚胎进行分期。用于分析神经褶隆起过程中细胞行为的外植体实验，最理想的时期为6至10个体节阶段，此时神经褶刚开始隆起，且颅部间充质的主要形态发生尚未开始。</li>
	<li>用PBS清洗胚胎，然后将其置于含有不含酚红的DMEM（Invitrogen, #21063-029）的黑色硅胶培养皿中。去除胚外膜，如有需要可保存用于基因分型。</li>
</ol>
4. 外植体的制备
<ol>
	<li>在显微镜下以尽可能高的放大倍数重新对焦至胚胎头部区域。</li>
	<li>双手各持一枚解剖针进行切割操作。使用其中一枚针固定组织，另一枚针进行切割。</li>
	<li>在菱脑节前方切断胚胎头部。</li>
	<li>沿中线切开，将头部均分为左右两半。</li>
	<li>围绕头部外缘和中线进行环切。这些切口将去除外侧边缘的未迁移神经嵴和表面外胚层，以及中线处的前脊索板。剩余的组织即为外植体，其中包含迁移中的颅神经嵴细胞、轴旁中胚层以及表面外胚层。</li>
	<li>在切割过程中，使用无菌巴斯德移液管及时清除培养皿中的解剖碎屑，以避免外植体与碎屑混淆。</li>
	<li>用20 μl移液器吸头和移液器轻轻吹打外植体，进行温和清洗。此步骤可去除松散附着的细胞，并防止外植体边缘出现锯齿状。</li>
	<li>使用20 μl移液器吸头和移液器，小心吸取约10 μl液体中的每个外植体，并将其置于包被过的培养孔中央。</li>
	<li>加入20 μl含15% FBS的培养基，以完全覆盖外植体。</li>
	<li>将培养板放入湿润的组织培养孵箱（5% CO2，37 °C）中孵育1–2小时，使外植体贴附于培养皿底部。期间定期观察，确保外植体未发生干燥。</li>
	<li>当外植体完成贴附后，小心向每孔加入250 μl已在水浴中预热至37 °C、含10% FBS的DMEM培养基。一旦外植体贴壁，即使轻轻晃动培养板，在显微镜下观察也不会发生移动。</li>
	<li>将培养皿重新放回组织培养孵箱中。</li>
	<li>24小时后，外植体将牢固贴附，细胞开始迁移。此时可向培养基中添加药理学试剂。</li>
	<li>接种48小时后，细胞已从外植体迁移而出。可观察并成像记录迁移距离。我们通常在此时终止培养，因为延长孵育时间会导致外植体活力下降。也可使用如吖啶橙或台盼蓝等活体染料检测外植体的活力。</li>
	<li>此时可获取图像，以记录从外植体迁移出的细胞数量和迁移距离。或者，若外植体接种于盖玻片上，可对其进行固定，并进行免疫组织化学分析，以观察目标蛋白的表达情况。</li>
</ol>
实验方案中的关键步骤
<ol>
	<li>切取大小相近的组织块。</li>
	<li>解剖过程中应及时清除解剖板上的所有解剖残留物，以避免残留物与目标移植物组织混淆。</li>
	<li>将组织块接种于孔板或盖玻片时，应确保含有组织块的培养基液滴位于孔中央。</li>
	<li>在向孔中加满培养基之前，应给予组织块足够的附着时间。</li>
	<li>每种测试底物和药理学试剂的处理条件应保持标准化。</li>
	<li>每个胚胎可制备两个组织块（分别来自神经管左侧和右侧）。</li>
	<li>在不同实验条件下检测突变小鼠品系细胞迁移时，应将一个突变组织块置于对照组，另一个置于处理组。</li>
</ol>
问题排查
<ol>
	<li>如果外植体未能贴壁，可延长贴壁时间。根据我们的经验，约有一半的外植体无法贴壁，且较大的外植体贴壁效率更高。</li>
	<li>如果外植体贴附在孔板边缘，则难以成像。务必将外植体放置在孔的中央位置。</li>
	<li>理想情况下，外植体应大小相近。然而，若存在外植体尺寸差异，可在定量分析细胞从外植体迁移的情况时，使用外植体直径作为校正因子进行调整。</li>
	<li>若出现污染，需确保操作环境无菌。所有工具和工作表面均应使用70%乙醇灭菌。移液器和培养皿应为全新且无菌的。</li>
	<li>若在解剖过程中外植体容易丢失，应定期清除碎片，以防止外植体丢失。</li>
	<li>掌握解剖技术需要较长时间并依赖熟练操作。合适的放大倍数、锋利的解剖工具和针头有助于提高操作效率。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本方法提供了一种强有力的检测手段，用于研究颅部间充质细胞的行为。除了本文所展示的静态分析外，还可通过明场活体成像或结合表达GFP标记蛋白的方式，实时观察细胞从外植体迁移过程中的行为。对于活体成像实验，可使用DiI对外植体进行标记，或利用ROSA-YFP;Mesp1-cre、ROSA-YFP;Wnt1-cre或其他转基因小鼠品系来区分神经嵴细胞与轴旁中胚层细胞的迁移行为。该外植体实验体系也可用于研究颅部间充质与细胞外基质（ECM）之间的相互作用。在此，我们将外植体接种于存在于颅部间充质中的不同ECM底物上，结果显示细胞在这些底物上的迁移程度存在差异，且ECM会影响细胞的形态。此外，还可将外植体包埋于三维基质中，以研究细胞在此环境下的行为特征。该外植体实验适用于分析遗传操作和药物干预对颅部间充质细胞行为的影响，从而探究调控和修饰细胞迁移的内在与外在信号。例如，在我们的研究中，利用该实验体系揭示了Hsp90过度分泌在Hectd1突变型颅部间充质细胞异常行为中的作用15。在这些实验中，我们使用抗Hsp90抗体、Hsp90蛋白、格尔达那霉素（geldanamycin）和DMA（二甲基改善胺，dimethyl amelioride）处理外植体，以阻断Hsp90的分泌，证明Hectd1突变细胞的异常行为是由于细胞外Hsp90过量所致15。类似的方法也可用于药理学手段解析调控颅部间充质正常或异常形态发生的其他信号通路。实验完成后，可对外植体及迁移细胞采用多种方法进行后续分析。例如，可进行免疫组织化学分析，以检测对细胞运动至关重要的蛋白定位情况；也可进行转录组分析，以确定不同处理对基因表达的影响。
该技术的一个重要局限性在于，它无法模拟细胞在活体（in vivo）中真实存在的三维行为。可通过修改实验方案，将外植体包埋于三维基质（例如 Matrigel）中，并结合表达荧光蛋白标记的细胞区室，以解决此问题。即便进行了上述改进，仍需进一步开展实验，以验证该离体（ex vivo）检测系统中观察到的细胞行为是否与活体（in vivo）中的行为一致。其他局限性还包括需要大量胚胎才能获得足够数量的样本，以生成具有统计学意义的数据。最重要的是，尽管该解剖操作相对简单，但仍需经过练习才能熟练掌握。

在小鼠胚胎中，头部区域的神经管闭合发生在胚胎发育第8.5天（E8.5）至第9.5天之间。头部神经管未能正常闭合将导致无脑畸形，这是一种在人类中常见的结构性出生缺陷，且无法存活。驱动头部神经管闭合的力来源于神经组织本身以及周围的表皮和间充质3。特别是颅部间充质的扩展被认为对颅神经褶的抬升至关重要1,2。颅部间充质富含细胞外基质蛋白，尤其是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸软骨素和透明质酸等糖基化蛋白4-8。
与鸡胚中神经嵴细胞在神经管闭合后从背侧神经管迁移不同，小鼠胚胎的神经嵴细胞在神经褶开始隆起的同时即启动迁移（即在5体节阶段之后）。因此，在小鼠胚胎神经管形成过程中，颅部间充质由来自神经嵴和轴旁中胚层的细胞共同组成。神经嵴和轴旁中胚层细胞群在发育的不同阶段被诱导形成，在胚胎中的位置不同，并发育为不同的结构9,10。轴旁中胚层起源于原条，迁移至胚胎前部区域，位于预定神经板的下方。神经嵴在神经板与表皮外胚层交界处被诱导形成，在啮齿类胚胎神经褶隆起之前经历上皮-间充质转化并发生去层化。神经嵴细胞沿着表皮下轴旁中胚层的典型路径迁移至鳃弓、额鼻区及眼周间充质。轴旁中胚层将参与形成颅骨穹窿的部分骨骼以及面部肌肉；而神经嵴则将参与形成颅骨和面部的其他骨骼结构，并贡献于颅神经的形成9-11。轴旁中胚层和神经嵴的谱系可通过转基因小鼠品系 Mesp1-cre 和 Wnt1-cre 分别进行特异性标记9。
颅部间充质在神经管闭合中的关键作用，是通过在神经管形成期间用细胞外基质破坏剂（如透明质酸酶、软骨素酶ABC、肝素酶或重氮氧代正亮氨酸（DON））处理啮齿类动物胚胎的实验推断得出的，这些处理会损害神经管的闭合7,12-14。在这些实验中，神经管形成结束后对静态切片进行组织学分析，发现颅部间充质存在相关的形态发生异常7,12-14。然而，由于致畸剂可作用于多种组织，目前仍需确定颅部间充质是否确实是其靶组织。支持颅部间充质对神经管形成至关重要的结论是，在一些表现为露脑畸形的小鼠突变体中，组织学分析显示其颅部间充质呈现异常15-17。然而，在大多数情况下，这些突变对颅部间充质细胞行为的影响尚未被研究。
我们设计了一种ex vivo（离体）组织块培养实验，用于直接检测基因突变或药物干预对颅部间充质细胞行为的影响15。该实验方法类似于Tzahor et al 2003年发表的方法，用于评估位于菱脑节下方的颅部间充质的分化潜能18，但我们对组织块的解剖步骤进行了修改，以研究位于前部神经板下方的更靠前区域的颅部间充质细胞的迁移特性。我们的方法也借鉴了在鸡胚中用于分析神经嵴细胞迁移行为的组织块实验，但存在若干关键差异。以往的研究通常分离神经嵴或更靠后部的轴旁中胚层组织19,20。此外，在鸡胚神经褶隆起阶段，神经嵴细胞尚未从背侧神经管迁移出来，因此取自前部轴旁中胚层的组织块不会包含神经嵴细胞。在我们的实验中，制备的颅部间充质组织块包含轴旁中胚层、神经嵴以及表面外胚层，并将其接种于基质上。可进行多种实验干预，包括从基因突变体中分离组织块、将组织块接种于不同的细胞外基质（ECM）上，或进行药物处理。细胞会从组织块中迁移出来，其迁移距离、数量及行为特征可在不同处理组之间进行分析和比较。此外，该样本制备方法适用于活细胞成像技术对细胞迁移过程进行动态观察。迁移实验结束后，可将组织块固定并进行免疫组织化学分析，以进一步阐明处理因素的作用效果。总体而言，本文所描述的方案是一种简便的ex vivo（离体）实验方法，可用于研究颅部间充质细胞的行为。作为代表性实验，我们利用该方法检测颅部间充质在不同细胞外基质上的迁移能力。

一种用于评估颅部间充质细胞行为的组织块培养实验方法

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

中枢神经系统起源于神经板，神经板经历一系列复杂的形态发生运动，最终形成神经管，这一过程称为神经管形成（neurulation）。在神经管形成过程中，位于神经板下方的间充质的形态发生被认为驱动了神经褶的抬升。头部间充质由轴旁中胚层和神经嵴细胞组成。头部间充质细胞形成一种多孔状网状结构，由星状细胞和交错分布的细胞外基质（ECM）纤维构成，为神经褶提供支撑。在神经管形成期间，头部间充质经历典型的重排过程，导致其扩张，这些运动被认为提供了推动神经褶抬升的驱动力。然而，驱动头部间充质形态发生的信号通路和细胞行为仍研究较少。细胞外基质与头部间充质细胞之间的相互作用是这些细胞行为的基础。本文介绍一种简单的ex vivo组织外植体实验方法，用于表征这些细胞的行为。该方法适用于药理学干预以解析相关信号通路，也适用于活体成像分析，以进一步表征这些细胞的行为。我们展示了一个代表性实验，证明该方法在研究头部间充质细胞在多种细胞外基质成分上的迁移特性方面的应用价值。

从颅部间充质外植体迁移出的细胞形态如图2所示。我们测试了神经管形成期间存在于颅部间充质中的多种细胞外基质（ECM）底物上的细胞迁移情况，包括纤连蛋白（100 mg/ml；Sigma #F1141）、层粘连蛋白（100 mg/ml；Sigma #L2020）、MaxGel ECM（以DMEM按1:500稀释；Sigma #E0282）以及透明质酸（1 mg/ml；Sigma, #53747）。当不存在ECM时，细胞无法从外植体迁移（数据未显示），而所有测试的底物均能支持细胞迁移。从外植体迁移出的细胞形态及其大小均依赖于底物类型。这是预期结果，因为先前研究表明，细胞与不同ECM相互作用所产生的机械力会影响细胞的形态及迁移特性21。
<img alt="显示龋洞制备和充填方法的牙科手术示意图；牙齿的横截面。" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 外植体的制备。 （A）制备外植体时，将 E8.5 胚胎从蜕膜及胚外组织中分离出来。（B）将胚胎头部从菱脑节前方的躯体部分解剖分离。通过去除头部中线及外缘组织，分别移除位于中线的前脊索板以及位于边界的未迁移神经嵴细胞和表面外胚层，从而制备外植体。（C）通过切除头部中线和外缘的组织，分别去除中线处的前脊索板以及边界处的未迁移神经嵴细胞和表面外胚层，以制备外植体。（D）将外植体置于经细胞外基质包被的培养皿或盖玻片上，加入少量培养基使其贴壁，之后再添加更多培养基。
<img alt="纤连蛋白、层粘连蛋白、MaxGel ECM、透明质酸底物上的细胞黏附效率；显微镜观察。" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 不同底物上培养的外植体颅部间充质细胞的迁移情况。将外植体接种于纤连蛋白、层粘连蛋白、MaxGel ECM 或透明质酸底物上，培养 48 小时后拍照。标尺 = 200 mm。

颅部间充质经历显著的形态发生运动，这可能为神经褶的抬升提供驱动力1,2。在此，我们描述一种简单的ex vivo外植体实验方法，用于表征神经管形成过程中颅部间充质的细胞行为。该方法具有多种应用，包括适用于药物干预和活体成像分析。

中枢神经系统起源于神经板，神经板经历一系列复杂的形态发生运动，最终形成……

本实验的目的是监测颅脑类器官培养物的行为。在特定的培养条件下，第一步是从一只定时交配的孕鼠中采集子宫角。交配后8.5天。分离后，将胚胎从蜕膜中取出，并去除卵黄囊用于基因分型。随后，分离颅部中胚层组织，进行显微解剖，并转移至包被有细胞外基质的组织培养板中。X 外植体被允许贴壁，并在存在或不存在特定药理学试剂的条件下培养最多 48 小时。最终，拍摄外植体的图像以显示细胞迁移的差异。该方法有助于回答一些关键科学问题，例如：在神经褶隆起过程中，哪些信号通路和细胞外基质蛋白参与并调控颅部组织的行为。该方法的可视化演示至关重要，因为显微解剖步骤难以掌握，需要耐心和反复练习才能熟练掌握。首先，如果要进行免疫组织化学染色，则需准备盖玻片；否则跳过此步骤，直接将细胞外基质（ECM）包被于培养板上。将经灭菌的直径12毫米圆形玻璃盖玻片浸入乙醇中，随后使其自然晾干。接下来，将每片灭菌后的盖玻片放入12孔板的各个孔中。在超净工作台中，加入一毫升细胞外基质（ECM）以包被盖玻片或组织培养板底部。将培养板置于37°C孵育三小时，孵育结束后吸除ECM溶液，并用PBS洗涤三次。此时，包被好的培养板可立即使用，也可密封后于4°C保存，最长可保存两周。在观察透明胚胎时具有优势。制备带有抗性黑色背景的Syl防护板。按照制造商的说明书进行操作。通过将显微针插入针座中来准备解剖工具。当所有物品准备就绪后，使用磨针块将镊子磨尖。从妊娠时间明确的孕鼠中采集子宫，该小鼠的妊娠时间为受孕后8.5天。将分离的子宫放入含有无菌 PBS 的培养皿中清洗。在解剖显微镜下，使用剪刀和镊子分离各个蜕膜组织。用撕扯动作去除子宫结缔组织，注意避免施加压力，以防胚胎从蜕膜中脱出。用镊子小心地从胎盘对侧撕开子宫组织。为暴露包裹在卵黄囊中的胚胎，用镊子夹住胚胎和卵黄囊，使其与胎盘分离，并将子宫组织从培养皿中移除。接着，用镊子轻轻撕开，将卵黄囊从胚胎上剥离。 将卵黄囊用移液器放入离心管中，用于基因分型。分离后，通过计数体节对胚胎进行分期。理想情况下，胚胎应处于6到10个体节的阶段。在此阶段，神经褶刚开始抬升，颅部间充质的主要形态发生尚未发生。确定胚胎发育阶段后，将其转移至含有不含酚红的DMEM的黑色细胞培养板上。首先在解剖显微镜下以尽可能高的放大倍数，用双手各持一枚解剖针聚焦于胚胎头部，将头部在rmba meres前方解离。接着，沿中线剪开以进行分离。用解剖针各持一侧，将头部沿中线切分为两个相等的半部分。解剖胚胎头部边缘及中线处的外围边缘组织。根据需要去除多余组织，以避免所需的表层外胚层与不需要的组织相混淆。外植体应包含迁移的头部神经嵴、旁侧中胚层和表面外胚层，以去除松散附着的细胞。使用200微升移液枪头轻轻吹打上下混合。对于Pepin，需用移液枪头小心地将外植体吸起。在包被过的组织培养板孔中央加入约10微升DMEM，再加入20微升含15% FBS的预温DMEM，随后可将培养皿转移至组织培养孵箱中。大约1至2小时后，外植体会附着，此时可额外添加250微升培养基。约24小时后，外植体将牢固地附着于盖玻片上。此时，可在额外培养 24 小时后向培养基中添加药理学试剂，细胞将从这些结构中迁移。通常通过成像记录从这些结构迁移出的细胞的距离和数量。此时，由于长时间孵育后细胞开始出现活力下降的迹象。以下是来自颅侧中胚层和chix植片的细胞迁移示例。在不同基质中培养48小时后，从外植体迁移出的细胞形态和大小均依赖于基质类型。细胞迁移实验所用的基质包括纤连蛋白（fibronectin）、层粘连蛋白（laminin）、Matrigel、细胞外基质（ECM）以及透明质酸（hyaluronic acid）。采用此方法后，可进一步使用免疫荧光和活体成像等技术，深入研究调控神经褶隆起过程中颅侧中胚层细胞行为的信号通路。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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