一种用于评估颅部间充质细胞行为的组织块培养实验方法

本实验的目的是监测颅脑类器官培养物的行为。在特定的培养条件下，第一步是从一只定时交配的孕鼠中采集子宫角。

交配后8.5天。分离后，将胚胎从蜕膜中取出，并去除卵黄囊用于基因分型。随后，分离颅部中胚层组织，进行显微解剖，并转移至包被有细胞外基质的组织培养板中。

将X外植体置于含或不含特定药理学试剂的条件下培养，使其贴壁并培养最多48小时。最终拍摄外植体图像，以显示细胞迁移的差异。该方法有助于回答关键科学问题，例如：在神经褶隆起过程中，哪些信号通路和细胞外基质蛋白参与并调控颅类细胞的行为？

该方法的可视化演示至关重要，因为显微解剖步骤难以掌握，需要耐心和反复练习才能熟练。首先，如果需要进行免疫组织化学染色，则需准备盖玻片；否则可跳过此步骤，直接将组织培养板用细胞外基质（ECM）包被。将无菌的12毫米圆形玻璃盖玻片浸入乙醇中进行消毒，随后使其自然晾干。接下来，将一片无菌盖玻片放入12孔板的每一孔中。

在超净工作台中，加入一毫升细胞外基质（ECM）以包被盖玻片或组织培养板底部。将培养板置于37°C孵育三小时，孵育结束后吸除ECM溶液，并用PBS洗涤三次。此时，包被好的培养板可立即使用，也可密封后于4°C保存，最长可保存两周。

在观察透明胚胎时具有优势。制备带有抗性黑色背景的Syl防护板。按照制造商的说明书进行操作。

通过将显微针插入针 holder 中来准备解剖工具。当所有物品准备就绪后，使用磨针块将镊子磨尖。采集受孕时间明确的妊娠8.5天小鼠的子宫。

将分离的子宫放入含有无菌 PBS 的培养皿中清洗。在解剖显微镜下，使用剪刀和镊子分离各个蜕膜。用撕扯动作去除子宫结缔组织，注意避免施加压力，以防胚胎从蜕膜中脱出。

用镊子小心撕开胎盘对侧的子宫组织。为暴露包裹在卵黄囊中的胚胎，用镊子夹住胚胎和卵黄囊，使其与胎盘分离，并将子宫组织从培养皿中移除。接着，用镊子轻轻撕开，将卵黄囊从胚胎上移除。

用移液器将卵黄囊放入离心管中，用于基因分型。分离后，通过计数体节对胚胎进行分期。理想情况下，胚胎应处于6到10个体节的阶段。在此阶段，神经褶刚开始抬升，颅部间充质的主要形态发生尚未发生。

确定发育阶段后，将胚胎转移至含有不含酚红的DMEM的黑色细胞培养皿中。首先在解剖显微镜下，使用尽可能高的放大倍数，双手各持一枚解剖针，聚焦于胚胎头部，在rmba meres前方解剖分离头部。接着，沿中线切开以进行分离。

用解剖针各持一侧，将头部沿中线对称解剖为两半。解剖胚胎头部边缘及中线处的外围组织。根据需要去除多余组织，以避免所需的样本与不需要的组织混淆。

外植体将包含迁移的颅神经嵴、旁侧中胚层和表面外胚层，以去除松散附着的细胞。使用200微升移液枪头轻轻吹打数次。对于Pepin，需用移液枪头小心地将外植体吸起。

在涂有包被物的组织培养板孔中央加入约10微升DMEM，再加入20微升含15% FBS的预温DMEM，随后可将培养皿转移至组织培养孵箱中。大约1至2小时后，外植块将附着于表面，此时可额外加入250微升培养基。约24小时后，外植块将牢固地附着在盖玻片上。

此时，可在额外培养24小时后向培养基中添加药理学试剂，细胞将从这些区域迁移。通常会采集图像以记录从这些区域迁移的细胞的距离和数量。此时，由于细胞在较长的孵育时间后开始出现活力下降的迹象。

以下是颅侧突起和chix植物细胞迁移的示例。在不同基质中培养48小时后，从外植体迁移出的细胞形态和大小均依赖于基质类型。细胞迁移实验所用的基质包括纤连蛋白（fibronectin）、层粘连蛋白（laminin）、MaxGel、细胞外基质（ECM）以及透明质酸（hyaluronic acid）。

采用此方法后，可进一步使用免疫荧光和活体成像等技术，深入研究调控颅部神经褶上皮细胞在神经褶隆起过程中行为的信号通路。