一种用于评估颅部间充质细胞行为的组织块培养实验方法

本实验的目的是监测颅脑类器官培养物的行为。在特定的培养条件下，第一步是从一只定时交配的孕鼠中采集子宫角。

交配后8.5天。分离后，将胚胎从蜕膜中取出，并去除卵黄囊用于基因分型。随后，分离颅部中胚层组织，进行显微解剖，并转移至包被有细胞外基质的组织培养板中。

X 外植体被允许贴壁，并在存在或不存在特定药理学试剂的条件下培养最多 48 小时。最终，拍摄外植体的图像以显示细胞迁移的差异。该方法有助于回答一些关键科学问题，例如：在神经褶隆起过程中，哪些信号通路和细胞外基质蛋白参与并调控颅部组织的行为。

该方法的可视化演示至关重要，因为显微解剖步骤难以掌握，需要耐心和反复练习才能熟练掌握。首先，如果要进行免疫组织化学染色，则需准备盖玻片；否则跳过此步骤，直接将细胞外基质（ECM）包被于培养板上。将经灭菌的直径12毫米圆形玻璃盖玻片浸入乙醇中，随后使其自然晾干。接下来，将每片灭菌后的盖玻片放入12孔板的各个孔中。

在超净工作台中，加入一毫升细胞外基质（ECM）以包被盖玻片或组织培养板底部。将培养板置于37°C孵育三小时，孵育结束后吸除ECM溶液，并用PBS洗涤三次。此时，包被好的培养板可立即使用，也可密封后于4°C保存，最长可保存两周。

在观察透明胚胎时具有优势。制备带有抗性黑色背景的Syl防护板。按照制造商的说明书进行操作。

通过将显微针插入针座中来准备解剖工具。当所有物品准备就绪后，使用磨针块将镊子磨尖。从妊娠时间明确的孕鼠中采集子宫，该小鼠的妊娠时间为受孕后8.5天。

将分离的子宫放入含有无菌 PBS 的培养皿中清洗。在解剖显微镜下，使用剪刀和镊子分离各个蜕膜组织。用撕扯动作去除子宫结缔组织，注意避免施加压力，以防胚胎从蜕膜中脱出。

用镊子小心地从胎盘对侧撕开子宫组织。为暴露包裹在卵黄囊中的胚胎，用镊子夹住胚胎和卵黄囊，使其与胎盘分离，并将子宫组织从培养皿中移除。接着，用镊子轻轻撕开，将卵黄囊从胚胎上剥离。

将卵黄囊用移液器放入离心管中，用于基因分型。分离后，通过计数体节对胚胎进行分期。理想情况下，胚胎应处于6到10个体节的阶段。在此阶段，神经褶刚开始抬升，颅部间充质的主要形态发生尚未发生。

确定胚胎发育阶段后，将其转移至含有不含酚红的DMEM的黑色细胞培养板上。首先在解剖显微镜下以尽可能高的放大倍数，用双手各持一枚解剖针聚焦于胚胎头部，将头部在rmba meres前方解离。接着，沿中线剪开以进行分离。

用解剖针各持一侧，将头部沿中线切分为两个相等的半部分。解剖胚胎头部边缘及中线处的外围边缘组织。根据需要去除多余组织，以避免所需的表层外胚层与不需要的组织相混淆。

外植体应包含迁移的头部神经嵴、旁侧中胚层和表面外胚层，以去除松散附着的细胞。使用200微升移液枪头轻轻吹打上下混合。对于Pepin，需用移液枪头小心地将外植体吸起。

在包被过的组织培养板孔中央加入约10微升DMEM，再加入20微升含15% FBS的预温DMEM，随后可将培养皿转移至组织培养孵箱中。大约1至2小时后，外植体会附着，此时可额外添加250微升培养基。约24小时后，外植体将牢固地附着于盖玻片上。

此时，可在额外培养 24 小时后向培养基中添加药理学试剂，细胞将从这些结构中迁移。通常通过成像记录从这些结构迁移出的细胞的距离和数量。此时，由于长时间孵育后细胞开始出现活力下降的迹象。

以下是来自颅侧中胚层和chix植片的细胞迁移示例。在不同基质中培养48小时后，从外植体迁移出的细胞形态和大小均依赖于基质类型。细胞迁移实验所用的基质包括纤连蛋白（fibronectin）、层粘连蛋白（laminin）、Matrigel、细胞外基质（ECM）以及透明质酸（hyaluronic acid）。

采用此方法后，可进一步使用免疫荧光和活体成像等技术，深入研究调控神经褶隆起过程中颅侧中胚层细胞行为的信号通路。