为外植体含量的颅间充质细胞行为评定
January 20th, 2013
颅间充质经历了戏剧性的形态发生变动，可能提供的驱动力升高的神经褶。在这里，我们描述一个简单的体外外植体试验，在神经胚形成的颅间充质细胞的行为特征。此法有许多应用，包括适合药物处理和实时成像分析。
该程序的目的是监测颅鼻 meen 鸣响培养物的行为。在确定的培养条件下。第一步是从定时怀孕的老鼠身上收集子宫角。
射精后 8.5 天。分离后，从蜕膜中取出胚胎，并去除卵黄囊进行基因分型。接下来，将颅骨机械植物和显微解剖转移到细胞外基质包被的组织培养板上。
允许 X 外植体附着并在存在或不存在确定的药物的情况下培养长达 48 小时。最后，拍摄 explan 图像以显示细胞迁移的差异。这种方法可用于回答关键问题，例如所涉及的信号通路和细胞外基质蛋白是什么，以及在神经折叠抬高期间使用 kind 控制 cran 的行为。
这种方法的视觉演示至关重要，因为显微解剖的步骤很难学习，需要耐心和实践才能掌握要开始，如果要进行免疫组织化学，请准备盖玻片，否则，跳过此步骤，直接用 ECM 灭菌的 12 毫米圆形玻璃盖玻片包被组织培养板，将其浸入乙醇中。让它们风干。接下来，将消毒的盖玻片放入 12 孔板的每个孔中。
在 Laina 罩中以 1 毫升细胞外基质或 ECM 涂覆盖玻片或组织培养板的底部。孵育后，将板在 37 摄氏度下孵育 3 小时，吸出 ECM 溶液并在 PBS 中洗涤 3 次。此时，涂层板可以立即使用，也可以包裹并在 4 摄氏度下储存长达两周。
Ade 在可视化半透明的胚胎中。准备具有抗性黑色背景的 Syl 保护板。遵循制造商的协议。
通过将细小的销钉插入销钉支架来准备解剖工具。一切准备就绪后，使用磨刀块磨镊子。从 quot 后 8.5 天的定时怀孕小鼠收集子宫。
将分离的子宫放入装有无菌 PBS 的培养皿中并洗涤。在解剖显微镜下，用带镊子的剪刀分离单个乳叶。以撕裂动作去除子宫结缔组织，注意不要产生压力并将胚胎从蜕膜弹出。
使用镊子小心地撕开胎盘对面一侧的子宫组织。要露出包裹在蛋黄袋中的胚胎，请使用镊子从胎盘中捏住胚胎和蛋黄袋，然后从培养皿中取出子宫组织。接下来，用镊子轻轻撕开，从胚胎中取出蛋黄袋。
将卵黄袋放入 eppendorf 管中，使用移液管进行基因分型，分离后通过计数体节对胚胎进行分期。理想情况下，胚胎将在 6 到 10 之间，阶段也可能如此。在这个阶段，神经皱襞刚刚开始升高，颅内充质的主要形态发生尚未发生。
确定阶段后，将胚胎转移到含有不含酚红的 DMEM 的黑色细胞保卫板上。首先，在具有最高放大倍率的解剖显微镜下，用每只手的解剖针聚焦胚胎的头部，解剖 rmba meres 前面的头部。接下来，沿中线切割至 bi。
用每只手的解剖针将头部解剖成相等的两半。沿着胚胎头部和中线的边缘解剖外边缘。去除所需的 a 以防止将所需的外观与不需要的组织混淆。
Explan 将包含迁移的颅神经嵴、paral 中胚层和表面外胚层，以去除松散附着的细胞。使用 200 μL 移液器吸头小心地上下移液。对于 Pepin，请用移液器吸头小心地拿起说明书。
在包被组织培养物的中心放置大约 10 微升 DMEM，在 20 微升补充有 15% FBS 的温 DMEM 中，现在可以将培养皿转移到组织培养箱中。大约 1 到 2 小时后，附上说明书，并可以额外添加 250 μL 的培养基。大约 24 小时后，说明书将牢固地贴在盖玻片上。
此时，可以在再添加 24 小时后将药物添加到培养基中，细胞将从中迁移。通常获取图像以记录从这些迁移的细胞的距离和数量。此时，sinces 开始显示出活力下降的迹象，孵化时间更长。
以下是从颅 me 和 chix 植物迁移的细胞示例。在不同基质中放置 48 小时后，从外部迁移的细胞的形状和大小都取决于。底物迁移在纤连蛋白、层粘连蛋白、最大凝胶、ECM 和透明质酸上得到支持。
在此程序之后，可以使用免疫荧光和实时成像等其他方法进一步探测在神经皱襞抬高过程中调节颅 me inkin 行为的通路。
概述
本研究提出了一种简单的体外离体器官培养法，用于研究神经化过程中颅骨间充质的细胞行为。该方法允许进行药理学操作和活体成像分析，提供关于提升神经褶皱的形态发生运动的见解。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞生物学
背景
- 颅骨间充质在神经褶皱提升中起关键作用。
- 理解神经化过程中的细胞行为对发育生物学至关重要。
- 体外测定可以提供关于细胞动力学的宝贵见解。
- 药理学试剂可以用来操作和观察这些行为。
研究目的
- 描述神经化过程中颅骨间充质的细胞行为。
- 开发一个可用于药理学和成像研究的测定方法。
- 探索参与颅骨间充质行为的信号通路和细胞外基质蛋白。
使用的方法
- 从时间怀孕的小鼠中分离胚胎。
- 对颅骨间充质离体器官进行微切割。
- 在细胞外基质涂层的板上培养离体器官。
- 使用活体成像监测细胞迁移和行为。
主要结果
- 成功附着和培养颅骨间充质离体器官。
- 观察到受基质组成影响的细胞迁移模式。
- 确定了参与神经褶皱提升的关键信号通路。
- 展示了测定方法在药理学研究中的实用性。
结论
- 体外离体器官测定是研究颅骨间充质动力学的有价值工具。
- 药理学操作可以揭示神经化过程中细胞行为的见解。
- 该方法可以促进对发育过程和相关疾病的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This ex vivo explant assay enables mechanistic interrogation of cranial mesenchyme behaviors during neurulation, supporting target validation in developmental pathways. By quantifying cell migration on defined ECM substrates, it provides predictive confidence for de-risking hypotheses about morphogenetic drivers of neural tube formation. The assay’s compatibility with pharmacological perturbation and live imaging positions it as a translational bridge between discovery biology and preclinical modeling of neurodevelopmental processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating cranial mesenchyme to clarify pathway-specific contributions to neural fold elevation.
- Operational Value: Enables biological de-risking through functional validation of mesenchymal cell behaviors in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking ECM-substrate interactions to migratory phenotypes that inform target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by standardizing explant attachment and migration readouts.
- Operational Value: Addresses assay reproducibility through defined culture conditions and quantitative outputs on fibronectin, laminin, Matrigel, ECM, and hyaluronic acid.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse for evaluating compound effects on mesenchymal migration dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through alignment with neurulation defects and translational biomarker potential in migratory cell populations.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling live imaging and pharmacological probing of signaling pathways.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by measuring cellular behaviors that predict morphogenetic outcomes in neural tube closure.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in developmental biology pipelines.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by isolating cranial mesenchyme to interrogate signaling pathways driving mesenchymal rearrangements.
- Screening: Describes assay readiness through standardized explant culture on ECM-coated plates and quantitative measurement of cell migration distance and number.
- Analytics: Highlights measurements such as migratory cell count and morphology changes that enable comparison of conditions across pharmacological or substrate variables.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling live imaging and pharmacological studies that inform models of neurulation defects.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for studying mesenchymal-ECM interactions across multiple neurodevelopmental targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in mesenchymal morphogenesis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of explant assays on defined ECM substrates.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neurodevelopmental programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative migration phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in embryonic dissection and microdissection techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs for live imaging and pharmacological compound handling.
- Cross-team standardization requirements for explant preparation and ECM coating consistency.
- Adaptation considerations across model systems due to species-specific mesenchymal composition and staging.
- Practical limitations including tissue viability beyond 48 hours and dependency on precise embryonic somite staging.
