骨转移模型

本实验的总体目标是通过特定方式注射肿瘤细胞，以诱导肿瘤细胞在骨组织中生长，并继而导致骨破坏。该过程首先将肿瘤细胞重悬于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于冰上。随后，将适当数量的细胞注射至麻醉小鼠的左心室或胫骨内。

随后通过多种成像技术对骨肿瘤生长情况及骨参数进行纵向监测。最后对肿瘤和骨参数进行终点定量分析。最终结合体内和离体荧光或生物发光二维放射成像与三维成像。

采用微型CT和组织学方法，在细胞和生长结构水平上显示肿瘤生长及骨微环境的变化。这些方法有助于回答癌症转移领域中的关键问题，例如骨内的哪些因素允许乳腺癌和前列腺癌发生转移性定植。细胞制备的示范由本实验室研究助理 Alisa Merkel 完成，细胞维持时间应少于一周。

在含有10%胎牛血清和0.1毫克/毫升青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养表达GFP标记的M-D-A-M-B 2 3 1克隆细胞，于37摄氏度、5%至8%二氧化碳条件下培养。当细胞融合度达到80%至90%时进行传代，按1:10比例稀释。为准备接种，当细胞融合度达到80%至90%时，使用10毫升含0.15%胰蛋白酶和EDTA的溶液对细胞进行消化处理。

立即将细胞用含10% FBS的冰冻DMEM转移至50毫升锥形管中，以离心力×g离心5分钟。将沉淀重悬于50毫升锥形管中的25毫升冰冻PBS（不含钙和镁）中，计数细胞，离心去除上清，再将细胞重悬于冰冻PBS中，用于心内注射时细胞浓度为每毫升10的6次方个细胞，用于胫内注射时为每毫升250,000个细胞。

选用免疫缺陷的雌性小鼠，年龄为4至6周，在注射前5到10天饲喂Tela 29 20 x饮食。实验时，先将小鼠置于含2.5%异氟烷的麻醉舱内进行麻醉，随后将小鼠移至通风橱内的鼻罩下，并使其仰卧位固定。用10%聚维酮碘溶液擦拭胸部，再用70%乙醇脱碘。

在小鼠胸骨切迹与剑突顶端之间的中点处、胸骨稍偏左侧的位置标记注射点。接着，使用一支300 µL、28号半英寸的胰岛素注射器，先吸取少量空气，以在活塞与液面之间形成间隙，然后用一只手绷紧小鼠皮肤，另一只手吸取100 µL细胞悬液。

保持针头垂直向上，成功插入左心室后，注射器内应出现明显的鲜红色搏动性血流。到达此深度后，小心下压注射器活塞，同时避免针头明显移动，以防刺破心脏或将细胞溢入胸腔。为减少细胞滴入胸腔，可轻微回抽活塞，以产生少量负压。

然后在拔出针头时，直接将其从胸腔中抽出，注意拔出过程中避免倾斜针头，以免撕裂心脏外膜并引起出血。在注射部位施加轻柔压力约一分钟，以减少出血。移除鼻罩时，将小鼠转移至加热垫上，直至其完全恢复意识。

在进行胫骨内注射操作前，立即给小鼠注射布比卡因。将小鼠麻醉后置于鼻罩中。用四指和拇指以10%聚维酮碘清洁双侧腿部，随后用乙醇擦拭。

轻轻握住外踝、内踝及胫骨下半部分，然后弯曲腿部，使膝关节显露并便于操作。用70%乙醇润湿皮肤，以增强下方髌韧带的可见度；在牢固握住脚踝的同时，髌韧带应呈现为一条清晰的白色粗线。

将28号半英寸针头穿过髌骨中点的髌韧带，插入胫骨近端的前髁间区域。以稳定而坚定的压力，配合轻微的钻入动作，小心引导针头穿过生长板。当针头穿透胫骨生长板时，阻力将明显减小。

轻轻横向移动针头，以确保其位于胫骨内并穿过生长板。若针头位置正确，移动将受到限制。缓慢按压推杆，注入 10 µL 细胞溶液。

此时应几乎感觉不到阻力，然后缓慢抽出针头。将小鼠移出麻醉状态，并置于加热垫上直至其恢复。

每周监测小鼠两到三次。对麻醉后的小鼠进行多种成像技术检测，如荧光素酶成像、GFP荧光和X射线成像。荧光信号指示肿瘤所在区域。

采用雌酮扫描来定位病灶。这些病灶与荧光图像相对应。有关成像技术的更多详细信息可在此方案的书面部分找到。

注射后21至35天，采用经IACUC批准的方法处死小鼠，并将骨骼置于4%福尔马林中保存，随后对分离的骨骼进行显微CT以及苏木精和DSN染色的组织形态学体外分析。具体操作细节详见肿瘤细胞经心内或胫内接种后的书面实验方案。

通过放射摄影以及荧光或生物发光技术对小鼠进行每周监测。病灶通常在第二至第三周之间通过X射线显现。虽然根据模型的不同（如此处所示），病灶最早可在第二周通过荧光和生物发光检测到，但病灶在骨骼中表现为暗色孔洞，并可能随时间推移而更加明显。病灶通过放射图像和荧光的MetaMorph分析进行定量。

使用 Maestro 成像采集与分析软件进行定量。在本图中，骨量丢失通过显微CT分析进行量化。显微CT测量所得的骨结构与矿化数据被重建为健康骨与荷瘤骨的三维图像，其中骨破坏区域显示为空缺区域。

随后对样品进行组织形态几何学分析，以确定肿瘤负荷以及骨体积与组织体积的比值。在进行这些操作时，重要的是保持耐心，并仔细摆放每只小鼠，密切监测小鼠状态。如果小鼠开始出现死亡，可能是由于细胞聚集所致，此时应立即重新制备细胞。

最不应该做的就是匆忙操作或感到沮丧。请记住，随着练习次数的增加和时间的推移，在掌握这些技术后，您的操作会变得越来越熟练和迅速。这些技术为癌症研究人员在活体条件下研究骨转移铺平了道路。