Name: 使用电化学传感器的细菌检测和鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习使用电化学传感器快速检测和鉴定细菌的方法，通过核糖体RNA杂交与DNA捕获探针结合，在约45分钟内完成检测。该技术显著缩短传统培养法所需时间，适用于临床诊断和传染病管理。

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本研究由美国国家过敏与传染病研究所的协作协议奖 AI075565（授予 D.A.H.）以及温迪和肯·鲁比儿童泌尿学研究卓越基金资助。B.M.C. 担任儿童泌尿学领域的朱迪思和罗伯特·温斯顿讲席教授。

1. 电化学传感器的功能化
<ol>
	<li>将巯基化捕获探针配制于含有300 μM 1,6-己二硫醇（HDT）、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.3 M NaCl 和 1 mM EDTA 的溶液中，终浓度为0.05 μM，避光室温孵育10分钟。捕获探针与HDT共孵育可确保其巯基处于还原状态，从而获得更一致的实验结果。</li>
	<li>用氮气流吹扫裸金16通道传感器芯片表面5秒，以去除水分和/或颗粒污染物。</li>
	<li>向传感器阵列全部16个传感器的工作电极上各加6 μl HDT-巯基化捕获探针混合液，将传感器芯片置于加盖的培养皿中，4 °C过夜孵育。巯基化捕获探针可直接结合至裸金电极表面，HDT的作用是防止探针过度密集堆积，并使其保持伸展构象，有利于与目标分子发生杂交。</li>
	<li>次日，用去离子H2O冲洗传感器芯片2–3秒，并在氮气流下吹干5秒。</li>
	<li>向全部16个传感器的工作电极上各加6 μl含10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.3 M NaCl、1 mM EDTA 和 1 mM 6-巯基-1-己醇（MCH）的溶液，孵育50分钟。此步骤及后续所有传感器芯片的孵育均在室温下加盖培养皿中进行。MCH作为封闭剂，可填充电极表面未被巯基化捕获探针或HDT占据的空隙区域。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>取1 ml处于对数生长期（OD600 ≈ 0.1）的细菌培养物，转移至微量离心管中，在16,000 × g条件下离心5分钟。弃去上清液。细菌沉淀可立即进行后续处理，或于-80 °C保存以备后续使用。</li>
	<li>用移液器吸取10 μl的1 M NaOH，将枪头抵住微量离心管底部，反复吹打数次，充分重悬细菌沉淀。室温孵育5分钟。</li>
	<li>加入50 μl含2.5%牛血清白蛋白（BSA）和0.25 mM荧光素标记检测探针的1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2），中和细菌裂解液。将中和后的裂解液于室温孵育10分钟。荧光素标记的检测探针可与细菌rRNA靶分子杂交。</li>
</ol>
3. 电化学传感器检测
<ol>
	<li>用去离子 H2O 冲洗传感器芯片 2-3 秒，然后在氮气流下干燥 5 秒。</li>
	<li>向 14 个传感器的每个工作电极上加入 4 μl 中和后的细菌裂解液，孵育 15 分钟。目标物-检测探针复合物将与固定化的硫醇化捕获探针杂交。</li>
	<li>向 2 个阳性对照传感器（用于信号归一化）的工作电极上加入 4 μl 含 2.5% BSA 和 0.25 μM 荧光素修饰检测探针的 1 nM 桥接寡核苷酸溶液（溶于 1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.2），孵育 15 分钟。</li>
	<li>用去离子 H2O 冲洗传感器芯片 2-3 秒，然后在氮气流下干燥 5 秒。</li>
	<li>向全部 16 个传感器的工作电极上加入 4 μl 抗荧光素-HRP 酶标抗体溶液（浓度为 0.5 U/ml，溶于含 0.5% 酪蛋白的 1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.2），孵育 15 分钟。抗荧光素-HRP 会结合到固定的荧光素修饰检测探针上。</li>
	<li>用去离子 H2O 冲洗传感器芯片 2-3 秒，然后在氮气流下干燥 5 秒。</li>
	<li>在传感器芯片表面贴上薄膜孔贴片，并将其装入传感器芯片支架。用移液器将 50 μl TMB 底物加到全部 16 个传感器上，然后关闭传感器芯片支架。</li>
	<li>使用 Helios 芯片读取仪对全部 16 个传感器进行安培法和循环伏安法测量。安培电流与传感器表面 TMB 还原速率成正比（见 图 1）。</li>
</ol>

<ol><li>Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+Surface+Monolayers+for+Ultrasensitive+%28Zeptomole%29+Amperometric+Detection+of+Nucleic+Acid+Hybridization+without+Signal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification.</a> Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).</li>
<li>Halford, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+by+Sensitive+Detection+of+Precursor+Ribosomal+RNA+Using+a+Novel+Electrochemical+Biosensing+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).</li>
<li>Campuzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+monolayers+as+DNA+recognition+interfaces+for+direct+and+sensitive+electrochemical+detection+in+untreated+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).</li>
<li>Gau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+molecular+analysis+without+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification.</a> Methods. 37, 73-83 (2005).</li>
<li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Specific+Capture+Enhances+Sensitivity+of+Electrochemical+Detection+of+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).</li>
<li>Mastali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+probe+length+and+target+location+for+electrochemical+detection+of+selected+uropathogens+at+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature.</a> J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).</li>
<li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrochemical+DNA+biosensors+for+rapid+molecular+identification+of+uropathogens+in+clinical+urine+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).</li>
<li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+electrochemical+DNA+biosensor+for+bacterial+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection.</a> J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).</li>
<li>Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroanalytical+sensors+and+devices+for+multiplexed+detection+of+foodborne+pathogen+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms.</a> Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).</li>
<li>Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+disposable+nucleic+acid+biosensors+for+direct+bioelectronic+detection+in+raw+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples.</a> Talanta. 85, 1330-1337 (2011).</li>
<li>Ecker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibis+T5000%3A+a+universal+biosensor+approach+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).</li>
<li>Casalta, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+LightCycler+SeptiFast+test+in+the+rapid+etiologic+diagnostic+of+infectious+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).</li>
</ol>

所有作者均为与本文所述方法相关的专利发明人。其中一项专利已授权给 Qvella 公司。B.M.C. 和 D.A.H. 在 Qvella 公司持有股权。V.G. 是 GeneFluidics 公司的总裁，该公司是本文所述电化学传感器阵列芯片、芯片支架和芯片读取仪的制造商。

本文所述的电化学传感器检测方法可实现对核酸靶标的快速检测。其灵敏度和特异性部分取决于靶标与探针杂交的自由能，而该自由能又受到捕获探针和检测探针的长度及GC含量的影响。我们通常在室温（约20 °C）下进行杂交步骤5, 6。然而，若将芯片置于含有湿润滤纸的密闭腔室中以防止蒸发，则杂交步骤（3.2 和 3.3）也可在杂交炉中的较高温度下进行7, 8。当捕获探针与检测探针结合于核酸靶标上相邻且无间隙的位点时，可获得最佳信号8。这种信号增强效应被认为通过碱基对堆叠作用以及提高相邻区域的杂交可及性来实现，即所谓的“辅助探针”效应。捕获探针与检测探针在相邻位点的杂交尤为重要，因为细菌的碱裂解会导致rRNA靶标发生片段化5。该方法可用于RNA或DNA靶标的检测，具有广泛的临床与科研应用前景。例如，可利用该方法研究由小RNA调控的细胞功能，或检测作为DNA或mRNA存在的抗生素耐药基因靶标。对于拷贝数较低的靶标，可能需要进行预扩增。此外，在样本制备过程中应加入RNase抑制剂，以防止潜在不稳定的RNA靶标发生降解。
<p class="jove_content...

以rRNA作为细菌检测和鉴定的靶分子具有多项优势。细菌细胞中rRNA的含量丰富，使得检测灵敏度可达每毫升250个细菌，且无需进行靶标扩增1。细菌rRNA包含可被DNA探针杂交识别的特异性种属序列。因此，可使用一组电化学传感器来鉴定未知细菌，其中每个传感器均修饰有不同种属特异性的捕获探针。应设置阳性对照传感器，用于检测可“桥接”捕获探针与检测探针的合成寡核苷酸靶标，从而产生内部校准信号。
电化学传感器在基础研究和转化研究中具有广泛的应用。例如，本文所述的检测方法已被用于精确测量大肠杆菌（E. coli）生长阶段对其rRNA和pre-rRNA拷贝数的影响，这一问题在细菌生理学研究领域备受关注2。电化学传感器检测的灵敏度由信噪比决定。研究人员已探索了多种信号放大和噪声降低方法。我们发现，优化传感器表面的化学修饰是减少检测探针和/或辣根过氧化物酶（HRP）非特异性结合的关键。特别是，采用烷基二硫醇与巯基乙醇组成的混合单分子层，可更充分地覆盖电极表面，同时保持捕获探针对目标序列杂交的可及性，从而有效降低背景信号3。这类表面化学处理在涉及复杂生物样本的检测中尤为重要。

<table><tbody><tr><td>6-巯基-1-己醇（MCH）</td><td>Sigma</td><td>451088</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>1,6-己二硫醇（HDT）</td><td>Sigma</td><td>H-12005</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>巯基化捕获探针</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>以0.1x TE缓冲液配制成100 &amp;mu;M溶液，于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>荧光素标记的检测探针</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>以0.1x TE缓冲液配制成100 &amp;mu;M溶液，于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>桥接寡核苷酸</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>以0.1x TE缓冲液配制成100 &amp;mu;M溶液，于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>抗荧光素-HRP Fab片段</td><td>Roche</td><td>11 426 346 910</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Helios芯片读取仪</td><td>GeneFluidics</td><td>GFR-2009</td><td></td></tr><tr><td>传感器芯片支架</td><td>GeneFluidics</td><td>GFR-003</td><td></td></tr><tr><td>薄膜孔贴片</td><td>GeneFluidics</td><td></td><td>随传感器芯片一同提供</td></tr><tr><td>裸金16传感器阵列芯片</td><td>GeneFluidics</td><td>SC1000-16X-B</td><td>在100% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;环境中室温保存</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>1M 磷酸盐缓冲液，pH 7.2</td><td></td><td></td><td>含0.35M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 0.65M K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，调节pH至7.2</td></tr><tr><td>PBS中的酪蛋白封闭剂</td><td>Pierce</td><td>37528</td><td>用等体积的1M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）稀释后，4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1. 试剂与设备。&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

使用电化学传感器进行细菌检测与鉴定

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

电化学传感器广泛用于血糖的快速准确检测，并可被改造以检测多种多样的分析物。电化学传感器通过将生物识别事件转化为有用的电信号来实现工作。信号转导是通过将氧化还原酶的活性与安培电极相偶联而实现的。传感器的特异性要么是酶本身固有的特性（例如葡萄糖传感器中的葡萄糖氧化酶），要么是酶与抗体或探针连接后所产生的特性。
本文介绍一种电化学传感器检测方法，用于直接检测和鉴定细菌。在所有情况下，此处描述的探针均为DNA寡核苷酸。该方法基于捕获探针和检测探针与靶标核糖体RNA（rRNA）的夹心杂交原理。捕获探针固定在传感器表面，而检测探针则连接辣根过氧化物酶（HRP）。当向电极表面加入含有捕获探针-靶标-检测探针复合物的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）等底物时，底物被HRP氧化，并由工作电极还原。这一氧化还原循环导致底物将电子从电极传递至HRP，从而在电极中产生电流信号。

我们描述了一种电化学检测方法，其结构类似于夹心ELISA。如图1所示，靶标核糖体RNA（rRNA）与捕获探针和检测探针发生杂交，随后通过辣根过氧化物酶（HRP）催化的氧化还原反应产生信号；该HRP标记在抗荧光素抗体片段上，可结合检测探针3'端的荧光素连接位点。检测灵敏度的一个关键因素是金电极的表面化学性质。我们发现，由硫醇化捕获探针、巯基己醇和己二硫醇组成的三元单分子层可显著降低报告蛋白的非特异性背景结合，从而显著提高信噪比3。本文所述检测使用GeneFluidics 16传感器阵列芯片，如图2所示。阵列中的每个传感器包含三个电极：工作电极、参比电极和辅助电极，这些电极在芯片边缘设有接触点4。芯片读取器通过弹簧针（pogo pins）与各接触点连接，作为传感器阵列与由计算机算法控制的电位计之间的接口。
安培法测量开始后的最初几秒内，由于从TMB加样至传感器表面到启动读数仪算法这段时间内氧化底物的积累，传感器中的电流会人为偏高，图3展示了电...

我们描述了一种用于快速检测和鉴定细菌的电化学传感器分析方法。该分析方法采用经DNA寡核苷酸捕获探针功能化的传感器阵列，该探针针对核糖体RNA（rRNA）的物种特异性序列。目标rRNA与捕获探针及辣根过氧化物酶标记的DNA寡核苷酸检测探针发生夹心杂交反应，产生可测量的安培电流。

电化学传感器广泛用于血糖的快速准确检测，并可改造用于检测多种……

以下实验的总体目标是利用电化学传感器检测并鉴定细菌。首先从细菌中释放核糖体RNA，以便与氟化检测探针进行杂交，这是第二步；然后将结合了核糖体RNA的检测探针加入工作电极，使其与传感器表面的捕获探针发生杂交。接下来，抗荧光素-辣根过氧化物酶偶联物与氟化检测探针结合。最后，在干涉测量电流中，可获得其强度与传感器表面捕获探针核糖体RNA检测探针复合物数量相关的信号。该技术相较于基于培养的方法主要优势在于，可在约45分钟内实现细菌的检测与鉴定，避免了过夜培养所需的时间。对于细菌在EDGAR平板上形成可见菌落的应用而言，该技术将有助于改善感染性疾病的管理。由于细菌病原体的早期检测对于靶向抗生素治疗和改善临床预后至关重要。尽管该方法可用于感染性疾病的诊断，也可应用于其他诊断问题，例如免疫诊断。首先将扩增的捕获探针与己二硫醇在室温下孵育10分钟，以确保捕获探针上的巯基被还原，从而获得更一致的结果。孵育后，用氮气流吹扫金表面的16个传感器阵列芯片5秒，以去除任何水分或微粒。需小心地将少量液体加至传感器阵列的工作电极上。该技术的可视化演示至关重要。正确执行移液、洗涤和干燥技术可显著降低芯片间的变异。接下来，将6 µL HDT稀释的捕获探针混合物加至传感器阵列全部16个传感器的工作电极上，并将传感器芯片置于培养皿中加盖，于4°C下孵育过夜。次日，用去离子水冲洗传感器芯片2至3秒，然后在氮气流下干燥5秒。随后，向全部16个传感器的工作电极上加6 µL氯化氢-氯化钠-EDTA-巯基乙醇溶液，并将传感器置于室温下的培养皿中孵育50分钟。为电化学传感器检测准备样品。取一毫升处于对数生长期的细菌培养物，转移至微量离心管中，然后在16,000 ×g 条件下离心五分钟。请注意，病原菌应在生物安全柜中操作。去除 snat 后，将含有 10 微升 1 摩尔氢氧化钠的移液枪头插入微量离心管底部，上下吹打数次，充分重悬沉淀。将悬液在室温下孵育 5 分钟后，加入 50 微升含有牛血清白蛋白（BSA）和荧光素标记检测探针的 PBS 溶液，以中和细菌裂解物。随后将中和后的裂解物在室温下孵育 10 分钟。从已准备好的一个传感器芯片开始此步骤，用去离子水冲洗巯基乙醇溶液，持续两到三秒。按照前述方法干燥芯片后，将四微升中和后的细菌裂解液施加到工作电极上。14个传感器。然后将4 µL桥接寡核苷酸加入含PBS、BSA及荧光素标记检测探针的溶液中，并将其施加至两个阳性对照传感器上。随后，将裂解液和阳性对照传感器孵育15分钟，之后同前法清洗并干燥整个传感器芯片。现在，将4 µL含抗荧光素辣根过氧化物酶（HRP）的PBS溶液（含酪蛋白）施加至全部16个传感器的工作电极上。孵育15分钟后，清洗并干燥传感器芯片。接着，将薄膜孔贴片贴到传感器芯片表面，将芯片装入传感器芯片架中，用移液器向全部16个传感器各加入50微升TMB底物

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