使用电化学传感器的细菌检测和鉴定
2013年4月23日
我们描述了一种电化学传感器的测定方法，细菌的快速检测和识别。的测定法涉及官能化的传感器阵列与DNA的核糖体RNA（rRNA基因）的种属特异性序列的寡核苷酸捕捉探针。目标rRNA基因的捕获探针和辣根过氧化物酶相连的DNA寡核苷酸检测探针的夹心杂交产生可测量的安培电流。
以下实验的总体目标是使用电化学传感器检测和识别细菌。这是通过首先从细菌中释放核糖体 RNA 以允许与氟化检测器探针杂交来实现的，作为第二步，将检测器探针结合的核糖体 RNA 添加到工作电极中，这允许与传感器表面的捕获探针杂交。接下来，允许抗荧光素辣根过氧化物酶偶联物与氟化检测器探针结合。
最后，在干涉电流中，其强度与捕获探针核糖体的数量相关，可以获得传感器表面的 RNA 检测器探针复合物。与基于培养的方法相比，该技术的主要优点是可以在大约 45 分钟内检测和鉴定细菌，避免了过夜重量。让细菌在 EDGAR 板上形成可见的菌落 应用这项技术将改善传染病的管理。
因为细菌病原体的早期检测对于靶向抗生素治疗和改善临床结果至关重要。虽然这种方法对传染病的诊断很有用，但也可以应用于其他诊断问题，例如免疫诊断。首先，在室温下将扩张的捕获探针与己烷二硫醇孵育 10 分钟，以确保捕获探针上的硫醇基团减少，从而获得更一致的结果。
孵育后，施入氮气流以承载黄金。16 个传感器阵列芯片 5 秒以去除任何水分或颗粒，需要小心地将少量液体涂抹在传感器阵列中的工作电极上。这种技术的视觉演示至关重要。
正确执行移液、清洗和干燥技术可大大减少芯片间的差异。接下来，将 6 微升 HDT 扩张捕获探针混合物涂抹在传感器阵列的所有 16 个传感器的工作电极上，并将传感器芯片存放在有盖的培养皿中，第二天在 4 摄氏度下过夜，用去离子水清洗传感器芯片 2 到 3 秒，然后在氮气流下干燥芯片 5 秒钟。现在，将 6 μL 盐酸氯化钠、EDTA 巯基乙醇溶液涂在所有 16 个传感器的工作电极上，并在室温下将传感器在培养皿中孵育 50 分钟。
为电化学传感器测定准备样品。将 1 毫升对数生长期细菌培养物转移到微量离心管中，然后以 16， 000 gs 离心细胞 5 分钟。请注意，病原菌应在生物安全罩中处理。
取出 snat 后，将含有 10 微升一摩尔氢氧化钠的移液器吸头贴在微量离心管的底部，并上下移液几次以彻底重悬沉淀。在室温下孵育悬浮液 5 分钟后，加入 50 μL 含有牛血清白蛋白或 BSA 的 PBS 和荧光素修饰的检测器探针，以中和细菌裂解物。然后将中和的裂解物在室温下孵育 10 分钟。
首先，用去离子水清洗准备好的传感器芯片中的巯基乙醇溶液 2 到 3 秒。如刚才所示干燥芯片后，将 4 微升中和细菌裂解物涂在工作电极上。14 个传感器。
然后将 PBS 加 BSA 加荧光素修饰的检测器探针中的 4 微升桥接寡核苷酸涂到两个阳性对照传感器上。然后，在裂解物和阳性对照传感器孵育 15 分钟后，像以前一样洗涤并干燥整个传感器芯片。现在，将 4 微升含有酪蛋白的 PBS 中的抗荧光素辣根过氧化物酶或 HRP 涂抹在所有 16 个传感器的工作电极上。
孵育 15 分钟后，清洗并擦干传感器芯片。接下来，在传感器芯片表面贴上薄膜孔贴纸，将芯片装入传感器芯片安装座，将 50 微升 TMB 底物移液到所有 16 个传感器上，然后关闭传感器芯片安装座。最后，使用 Helios 芯片阅读器获取所有 16 个传感器的高温测量和循环遥测测量值。
刚刚描述的电化学测定的结构类似于三明治 Eliza，如图所示，靶核糖体，RNA 杂交与捕获和检测器探针是通过 HRP 催化的氧化还原反应开发的，该反应与结合检测器探针上的三个松树荧光素键的抗荧光素抗体片段偶联。检测灵敏度的一个重要组成部分是金电极的表面化学性质。金电极涂有巯基乙醇和寂醇，并通过添加扩张的捕获探针进行功能化。
靶核糖体 RNA 与捕获探针和荧光素标记的检测器探针的夹心杂交产生复合物，该复合物通过添加抗荧光素辣根过氧化物酶偶联物和 TMB 底物进行检测。M 参数电流是由辣根过氧化物酶氧化 TMB 和电极电子还原 TMB 引起的氧化还原循环产生的。此处演示的分析采用基因流体 16 传感器阵列芯片。
阵列中的每个传感器都包含三个电极，即工作参考电极和辅助电极，它们在芯片边缘有触点。芯片读取器具有与每个触点连接的 pogo 引脚。芯片读取器用作传感器阵列的接口，带有由计算机算法控制的电位计。
这里显示了电化学传感器电流的示例。在参数测量开始后的最初几秒钟内，传感器中的电流在传感器中被人为地高。由于在从 TMB 施加到传感器表面到启动读取器算法的过程中氧化基板的积累，电流会迅速达到稳定状态，并且可以在 60 秒内可靠地获得准确的传感器读数。
传感器间的变异性相对恒定，因此可以在基因流体 16 传感器阵列芯片上并行执行 16 种不同的传感器检测，阳性和阴性对照作为阳性对照是必不可少的。以这种方式使用与捕获和检测器探针杂交并用作已知浓度的合成靶标的合成桥接 DNA 寡核苷酸。使用桥接寡核苷酸作为内部校准对照获得的结果，可最大限度地减少芯片间差异。
电极的负电流越大，信号越高。测试捕获和检测器探针时。检测限应通过对已知浓度的样品进行连续稀释来确定，如图所示，在分析的动态范围内，样品浓度和信号输出之间存在线性对数对数相关性。
在这些条形图中，含有 esia coli 和 kleb seal 和氨的样品的代表性结果（经常在尿路感染患者的尿液中发现）显示大多数传感器的信号将较低且相似，并且这些阴性结果可以合并，因为与 KE 探针对的背景信号反应性区分佳能和大肠杆菌。桥接寡核苷酸用作阳性对照和内部校准标准品。该技术可应用于临床标本中抗生素耐药细菌的检测 通过测量细菌对抗生素的表型反应。
该技术可用于确定个体患者的最佳治疗方法。看完这个视频后，你应该对如何通过比较芯片中不同物种特异性传感器的磁电流来检测和识别细菌有一个很好的了解。
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概述
本研究提出了一种用于快速检测和鉴定细菌的电化学传感器分析方法。该方法利用了一个功能化的传感器阵列，其中包含针对特定核糖体RNA序列的DNA寡核苷酸捕获探针。
关键研究组成部分
科学领域
- 电化学
- 微生物学
- 传感器技术
背景
- 传统的基于培养的细菌检测方法可能需要超过24小时。
- 快速检测技术对于有效管理传染病至关重要。
- 电化学传感器为快速识别提供了一个有前景的替代方案。
- 核糖体RNA是物种特异性检测的关键目标。
研究目的
- 开发一种使用电化学传感器进行细菌检测的快速分析方法。
- 与传统方法相比，提高细菌鉴定的速度。
- 利用核糖体RNA作为特定检测的目标。
所用方法
- 从细菌中释放核糖体RNA以进行杂交。
- 使用氟化探针与核糖体RNA结合。
- 探针结合的RNA与传感器表面的捕获探针杂交。
- 测量电流来定量检测。
主要结果
- 该分析方法可以在约45分钟内实现细菌的检测和鉴定。
- 电流强度与捕获的目标RNA量相关。
- 该方法显著减少了细菌鉴定所需的时间。
- 潜在应用包括改进传染病管理。
结论
- 电化学传感器分析是一种快速有效的细菌检测方法。
- 该技术可以增强临床诊断和传染病管理。
- 未来的研究可能扩展可检测细菌物种的范围。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid bacterial detection and identification within 45 minutes addresses a critical bottleneck in infectious disease management, enabling timely therapeutic decisions. This electrochemical sensor approach supports target validation by providing species-specific ribosomal RNA detection with quantitative amperometric readouts. The method enhances predictive confidence in early discovery by reducing reliance on slow culture-based assays and improving assay reproducibility across a 16-sensor array.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific ribosomal RNA hybridization and pathway clarification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing functional target validation via sandwich hybridization of capture and detector probes.
- Scientific Value: Increases predictive confidence for portfolio triage by delivering quantitative current measurements correlated with target RNA concentration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through consistent sensor surface functionalization with dilated capture probes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via internal calibration using bridging oligonucleotide controls to minimize chip-to-chip variability.
- Scientific Value: Highlights screening readiness and platform reuse through parallel processing of 16 sensors on a gene fluidic array for reliable compound or sample evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through detection of urinary tract pathogens like E. coli and Klebsiella, aligning with translational biomarker applications.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling rapid phenotypic response measurement to antibiotics for optimum therapy determination.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking by linking electrochemical readouts to bacterial identification, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to lead identification, supporting hypothesis testing and biological de-risking through specific rRNA detection.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification via species-specific ribosomal RNA hybridization.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through quantitative amperometric current measurements and internal calibration controls.
- Analytics: Highlights measurements and statistical outputs that enable comparison of conditions across sensor arrays, including signal intensity correlation with target concentration.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through phenotypic response measurement to antibiotics for therapy optimization.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability via the 16-sensor array chip format, enabling parallel assays and cross-platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in bacterial detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through sensor array design and calibration controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via rapid identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on 45-minute detection timelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrochemistry, molecular biology, and sensor surface chemistry for probe functionalization and assay execution.
- Needs instrumentation including potentiostat, sensor array chip reader, and fluidic handling systems for precise reagent delivery.
- Demands cross-team standardization in probe design, immobilization protocols, and data interpretation across microbiology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations for different bacterial targets through redesign of capture and detector probe sequences based on rRNA variability.
- Includes practical limitations such as the need for bacterial lysis and RNA release steps, which may require biosafety containment for pathogenic samples.
