Name: 生产和使用背驮式多管电极药理手法的神经反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学习制作和使用背驮式多管电极进行神经电生理记录的方法。该技术可在记录神经元活动的同时，通过离子电渗精确施加药物，用于研究听觉神经回路的功能调控。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由 R01 DC 011582（AK）和 RO1 DC011555（DJT）资助。

1. 拉制玻璃电极
<ol>
	<li>拉制单管电极。 使用带丝的单管玻璃毛细管，将其尖端拉至直径约1-2微米，杆部长度为10-12毫米，在0.9% NaCl溶液中测得的电极电阻约为12 MΩ（范围为5-20 MΩ）。电极电阻过低会导致背景活动增加，从而更难分离出单个神经元的单细胞放电活动。拉制该电极时，可使用水平或垂直拉制仪，加热方式可选择加热丝或加热圈。</li>
	<li>拉制多管电极。 由于多管玻璃管直径较大，且需要在整个多管周围实现均匀加热，因此必须使用配备大直径加热圈（而非加热丝）的高功率拉制仪。多管移液管必须置于加热丝中心位置，且不得与加热圈接触。请注意，除本文所述的5管移液管外，市售的3管或7管移液管也可作为替代选择。将玻璃管拉至总尖端直径约10微米或更小。在下一步中将通过断开尖端来调整至合适直径，因此在拉制过程中，精确的尖端尺寸不如电极尖端的整体形状重要，理想形状应为细长型。理想的电极尖端形状可参考图1C。短而粗的电极形状（图1B）在插入脑组织时会造成显著的组织损伤，而过长且过细的电极形状（图1A）则容易弯曲，从而难以将尖端折断至合适直径（见步骤2）。</li>
</ol>
2. 修饰电极尖端
在将两个电极粘合在一起之前，必须对它们进行改装。单电极的电极杆需要先弯曲，然后再连接到多管电极上，以确保组装完成的背负式电极整体电极杆尽可能细。此外，还需将多管电极的尖端折断，以确保离子电渗时具有较低的电阻。
<ol>
	<li>将单管电极的电极杆弯曲约20度。 使用尽可能小的本生灯火焰。标准实验室供应商提供的典型“小型”本生灯所产生的火焰对此应用而言过大。为解决此问题，应使用最小的商用本生灯，并将一根注射针头（约18号）固定在灯口顶部，用牙科水泥密封连接处。点燃后，火焰应难以看见，直径约为5 mm或更小，高度约8 mm。由于室内任何气流都可能熄灭该火焰，因此建议在密闭房间内操作，或使用防风罩。将单管电极穿过火焰，使其弯曲约20度。目标是使火焰在距离电极尖端约10毫米的过渡区域熔化玻璃。为避免熔化电极尖端，建议将电极以约45度角持握，尖端朝下，并快速通过火焰移动电极。</li>
	<li>折断多管电极的尖端。 为确保在折断电极尖端时具有良好的视觉控制，需使用配备至少10倍物镜和10倍目镜的显微镜。还需在目镜中插入测量标尺以测量尖端尺寸。将一块有机玻璃固定在显微镜上，使其末端在显微镜视野中占据约三分之一至二分之一范围。在本例中，有机玻璃尺寸约为25 × 70 mm，厚5 mm，通过螺丝固定于显微镜载物台特制螺纹中。设计时应确保有机玻璃可独立于载玻片移动。将多管电极置于载玻片上的模型粘土槽中，并将载有电极的载玻片插入显微镜载物台的玻片夹持器内。利用载物台的xy轴操纵装置，轻柔地将电极尖端推向有机玻璃边缘，并通过显微镜目镜观察尖端断裂过程。力求将多管电极尖端整齐折断至总直径约为25–35微米。对于断裂后尖端直径过大或断裂不平整的移液管应予以弃用。由于尖端形状不理想，我们大约会弃用30%的多管电极。</li>
</ol>
3. 组装Piggy-back电极
<ol>
	<li>放置电极。 从显微镜载物台上取下步骤2.2中使用的有机玻璃片。将制备好的多管电极固定在玻璃载片的模型粘土上，电极尖端略微向上倾斜。向上倾斜对于步骤3.2中的电极粘合至关重要：尖端朝上可使胶水从尖端处流开，避免将电极尖端粘连在一起。将弯曲的单管电极插入自制显微操作器的电极夹持器中（图2）。先通过肉眼引导，再借助显微镜观察，将单管电极缓慢下放至多管电极上。单管电极应准确放入由五根管状结构形成的凹槽中，其尖端应比多管电极的尖端突出约5–10微米。下放单管电极时，需密切观察两根电极之间形成的角度。为获得最佳效果，应避免两根电极尖端相互分离的角度，而应尽量使单管电极与多管电极完全平行地下降，或使其尖端先接触多管电极，形成一个极轻微的“楔形”结构。由于单管电极尖端具有高度柔韧性，当其尖端接触多管电极顶部表面后继续轻微下压时，单管电极会发生弯曲，从而形成一个结构清晰的复合尖端，并具备一定的弹性作用，有助于保持两个尖端紧密贴合。然而，若单管电极与多管电极之间的角度过陡（楔形过大），则弹性作用过强，会导致整个电极结构向下弯曲。</li>
	<li>将电极杆部粘合在一起。 使用氰基丙烯酸酯（速干胶）将两根电极的杆部粘合。用扁头牙签的小端蘸取少量胶水，轻轻触碰电极组件。从远离尖端的最远端位置开始，缓慢沿电极杆部向电极尖端方向移动牙签并施加胶水。若使用过多胶水，或在过于靠近电极尖端的位置施加胶水，可能导致电极开口被堵塞，从而使电极至少部分失去功能。</li>
	<li>用牙科水泥加固连接处。 在一次性小型塑料培养皿或称量舟中，使用扁头牙签混合少量牙科水泥与牙科丙烯酸树脂。待水泥变为可塑状态后，取少量涂抹于两根电极的连接处以加固结合部位（图3中的粉红色材料）。静置约15分钟使其干燥。</li>
	<li>取下并保存电极。 小心地将完成的背负式电极先从显微操作器夹持器中取出，然后从玻璃载片上分离，并存放于防尘容器中。</li>
</ol>
4. 准备电极填充液
配制电极填充液。由于离子电渗需要带电分子，大多数试剂必须溶解在酸性或碱性环境中（通常pH约为3-4，或pH约为8-10）。常用于离子电渗的多种化学物质列于表1中。对于表中未列出的试剂，应根据其pKa值判断在酸性或碱性环境中更易保持分子带电状态，并据此进行溶解。为获得最佳效果，建议每天新鲜配制所有溶液。
5. 填充并准备电极
使用电极前，用连接有注射器滤器的碳纤维28-34号针头，将每种药物分别注入对应的套管中。在五套管配置中，将四种选定药物填充至四个外周套管，中心套管则填充3M NaCl作为平衡套管。单套管记录电极也需填充3M NaCl。在NaCl溶液中加入染料（如快绿或酚红）有助于在将电极放置于脑表面时更清晰地观察电极尖端。将电极插入记录装置的电极夹持器中，并将所有导线插入相应的玻璃套管内。使用绝缘银线，其尖端约1 cm处已去除绝缘层。多套管电极应有5根导线（对应4个药物套管和1个平衡套管），此外还需一根放大器导线插入单套管记录电极中。
6. 开启离子电渗泵模块
打开离子电渗泵模块并测试所有桶道。每个泵模块的电极测试功能有助于确定电极桶道是否正常工作。为防止在不使用时药物从桶道中泄漏，需施加与分子电荷极性相反的保留电压。

<ol><li>Curtis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+assembly+of+%22parallel%22+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A method for assembly of "parallel" micro-pipettes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).</li>
<li>Carette, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+manufacturing+multi-barrelled+micropipettes+with+projecting+recording+barrel%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).</li>
<li>Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+associated+with+iontophoretic+studies+in+the+caudate+nucleus+and+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra.</a> Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).</li>
<li>Havey, D. C., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+constructing+%22piggy-back%22+multibarrel+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).</li>
<li>Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+construction+of+parallel+multibarrel+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes.</a> Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).</li>
<li>Oliver, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+contribution.+A+simple+rapid+method+for+preparing+parallel+micropipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).</li>
<li>Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaural+intensity+difference+processing+in+auditory+midbrain+neurons%3A+effects+of+a+transient+early+inhibitory+input%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input.</a> J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).</li>
<li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+shapes+a+topographic+organization+of+response+latency+in+the+mustache+bat%27s+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).</li>
<li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+shapes+sensitivity+to+interaural+intensity+disparities+in+the+mustache+bat%27s+inferior+colliculus%3A+implications+for+encoding+sound+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location.</a> J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).</li>
<li>Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycinergic+inhibition+creates+a+form+of+auditory+spectral+integration+in+nuclei+of+the+lateral+lemniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus.</a> J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).</li>
<li>Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT1A+and+5-HT1B+receptors+differentially+modulate+rate+and+timing+of+auditory+responses+in+the+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).</li>
<li>Wenstrup, J. J., Leroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+Integration+in+the+Inferior+Colliculus%3A+Role+of+Glycinergic+Inhibition+in+Response+Facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation.</a> J. Neurosci. 21, RC124(2001).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus.</a> Hear. Res. 122, 125-141 (1998).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+glycine+have+different+effects+on+monaural+response+properties+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+GABAergic+and+glycinergic+inhibition+on+binaural+processing+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+circuits+sharpen+tuning+curves+and+modify+response+properties+in+the+mustache+bat+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).</li>
<li>Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+GABA+as+an+inhibitory+neurotransmitter+in+inferior+colliculus+neurons%3A+iontophoretic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies.</a> Brain Res. 500, 302-312 (1989).</li>
<li>Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+excitant+amino+acids+on+acoustic+responses+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons.</a> Hear. Res. 40, 127-136 (1989).</li>
<li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+shifts+first-spike+latencies+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).</li>
<li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+effects+on+frequency+tuning+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).</li>
<li>Hurley, L. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+differentially+modulates+responses+to+tones+and+frequency-modulated+sweeps+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).</li>
<li>Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+components+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).</li>
<li>Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+and+GABA+influence+binaural+processing+in+the+inferior+colliculus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).</li>
<li>Moore, M. J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strychnine+blocks+binaural+inhibition+in+lateral+superior+olivary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons.</a> J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).</li>
<li>Nataraj, K., Wenstrup, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+inhibition+in+creating+complex+auditory+responses+in+the+inferior+colliculus%3A+facilitated+combination-sensitive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons.</a> J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).</li>
<li>Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+inhibition+sharpens+the+frequency+tuning+and+enhances+phase+locking+in+chicken+nucleus+magnocellularis+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons.</a> J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).</li>
<li>Burger, R., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+reveals+its+role+in+the+processing+of+multiple+sound+sources+in+the+inferior+colliculus+of+bats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats.</a> J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).</li>
<li>Burger, R. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+role+of+inhibition+in+shaping+responses+to+sinusoidally+amplitude-modulated+signals+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).</li>
<li>Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+and+glycinergic+inhibition+modulate+monaural+auditory+response+properties+in+the+avian+superior+olivary+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus.</a> J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们介绍一种可在活体（in vivo）条件下操控单个神经元微环路的技术，同时能够在实验操控过程中记录该神经元的反应。神经环路通过离子电渗法施加突触激动剂和拮抗剂进行操控。与压力喷射法相比，离子电渗法的主要优势在于其无需将液体从电极物理性地注入神经组织，因此不存在因施加压力或液体体积而造成组织损伤的风险。该技术的主要局限性在于无法获知药物在组织中的绝对浓度以及受药物影响的组织体积。然而，由于离子电渗法所释放的药剂量远小于压力喷射法，且更易于精确控制，因此药物作用后的恢复通常更快且更完全。微离子电渗法已成功应用于多种感觉及其他神经系统，并在固有信息处理较少或没有的脑区应用效果最佳。其原因是部分喷射出的药理学物质可能从施加部位扩散至邻近神经元，从而影响邻近神经元的反应特性。
单管和多管电极的独立制造，使得可以组合具有任意且互不相关特性的电极。若将电极管拉制在一起，并将其中一些用于记录、另一些用于离子电泳，则所产生的电极尖端特性会非常相似，导致电极尖端要么太大而不适合单细胞记录，要么太小而无法用于药物施加。此外，使单管电极尖端比多管电极尖端长约20微米，可显著降低记录中的噪声，并消除保持或推出电流对神经元放电可能产生的干扰电流效应3。
Piggy-back 多管电极最早在 30 多年前被描述 4-6 并已成功用于解析神经回路 7-18 19-29因此，该方法 本身 并不新颖或独特。然而，多年来电极制备和使用的具体细节已有所改进，本文所述的操作步骤被证明尤为简便且成功率高，其详细内容尚未在其他文献中公开发表。特别是，单管电极尖端的弯曲设计使得背负式电极的最终尖端相对较为纤细（图3）因此可以在对脑组织损伤最小的情况下记录深部核团的信号；单管电极突出于多管电极的设计几乎完全消除了电流干扰，而电流干扰过去常被视为该技术的缺点 3此处呈现的新细节，例如在粘合过程中使电极尖端向上，并将单管电极放置于多管电极的凹槽中，可确保制备背驮式电极时获得高成功率。该技术相对简单，初学者通常可在数天内掌握。

<table><tbody><tr><td>本生灯</td><td></td><td>17928-027</td><td>&lt;强&gt;可从以下获取&lt;/strong&gt;VWR</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;双组分牙科水泥：&lt;/strong&gt; &quot;低温固化&quot; 牙科材料</td><td>Co-oral-ite Dental Mfg. Co</td><td>525000</td><td>&lt;强&gt;可从...获取&lt;/strong&gt;A-M Systems, Inc</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;双组分牙科水泥：&lt;/strong&gt; 义齿材料交联液 化合物</td><td>Co-oral-ite Dental Mfg. Co</td><td>525000</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;A-M Systems, Inc</td></tr><tr><td>液体胶水</td><td>亨克尔</td><td>01-06849</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;：乐泰超强胶水</td></tr><tr><td>微离子电渗仪：Neurophore BH-2</td><td>哈佛仪器</td><td>65-0200 &amp;amp; 65-0203</td><td>&lt;强&gt;可从...获取&lt;/strong&gt;哈佛仪器公司</td></tr><tr><td>绝缘银线</td><td>AM-Systems</td><td>785500</td><td>&lt;强&gt;可从...获取&lt;/strong&gt;AM-Systems</td></tr><tr><td>水平拉制仪</td><td>Zeitz DMZ-通用型拉制仪</td><td>NA</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;AutoMate Scientific</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微操作仪组件：&lt;/strong&gt; 电极夹</td><td>WPI</td><td>M3301EH</td><td>&lt;强&gt;可从...获取&lt;/strong&gt;WPI</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微操作仪组件：&lt;/strong&gt; 线性平台</td><td>Newport 423 系列</td><td>423</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;纽波特</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微操作仪组件：&lt;/strong&gt; 旋转台</td><td>Newport RSP-2</td><td>RSP-2</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;纽波特</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微操作仪组件：&lt;/strong&gt; z 翻译</td><td>Newport 433 系列</td><td>433</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;纽波特</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微操作仪组件： &lt;/strong&gt;90度角括号 &amp;deg; 组装 z 轴和 xy 轴</td><td>Newport 360-90</td><td>360-90</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;纽波特</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微操作仪组件：&lt;/strong&gt; x 轴平移 / 线性平台</td><td>Newport 423 系列</td><td>423</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;纽波特</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微操作仪组件：&lt;/strong&gt; y轴平移 / 线性平台</td><td>Newport 423</td><td>423</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;纽波特系列</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td>Leitz Laborlux 11</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微镜&lt;/strong&gt; 目的</td><td>Leitz Wetzlar 10x，NA 0.25</td><td>519760</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微镜&lt;/strong&gt; 目镜</td><td>Leitz Wetzlar，Periplan 10x/18</td><td>519748</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微镜 &lt;/strong&gt;阶段</td><td>Leitz Wetzlar</td><td>513544</td><td></td></tr><tr><td>多通道毛细管</td><td>N/A</td><td>612000</td><td>&lt;强&gt;可从以下来源获取&lt;/strong&gt;A-M 系统公司</td></tr><tr><td>单管毛细管（GC 150F-10）</td><td>哈佛仪器</td><td>30-0057</td><td>&lt;强&gt;可从以下渠道获取&lt;/strong&gt;哈佛仪器公司</td></tr><tr><td>垂直拉制仪</td><td>Narishige 型号 PE-2</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">显微操作仪的定制部件（图中以浅蓝色标记） &lt;强&gt;图1&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>钢板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倾斜底座</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电极夹持器附件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表2.&lt;/strong&gt; 实验所用全部设备和耗材的生产厂家及货号。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

制造和使用piggy-back多管电极 在体 神经反应的药理学调控

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

体内单个神经元的记录使研究者能够检测神经元的放电特性，例如其对感觉刺激的反应。神经元通常接收多个兴奋性和抑制性传入和/或传出输入，这些输入相互整合，而最终测得的神经元反应特性正是由这些输入的神经整合所决定的。为了研究神经系统中的信息处理机制，有必要了解某一神经元或神经系统的各种输入及其特定性质。评估特定神经元所接收输入功能作用的一种强大且技术上相对简单的方法是动态且可逆地抑制或消除这些输入，并测量该操作引起的神经元输出变化。这一目标可通过使用“背负式”多管电极药物改变神经元的局部微环境来实现。这些电极由一根单管记录电极和一个可携带最多4种不同突触激动剂或拮抗剂的多管给药电极组成。药理学试剂可在实验过程中按需通过离子电渗法施加，从而实现时间可控的药物递送以及突触输入的可逆性重构。因此，对微环境进行药理学操控是一种强大且无与伦比的方法，可用于检验关于神经环路功能的特定假设。 
在此我们介绍piggy-back电极的制造方法及其在实验中的使用方式 体内 实验。piggy-back 系统允许研究者将具有任意特性的单管记录电极（如阻抗、尖端尺寸、形状等）与多管给药电极组合使用。这相较于标准的多管电极具有显著优势，因为在标准多管电极中，所有管的形状和特性大致相似。多管电极最早在40多年前被引入 1-3，并经历了多次设计改进 2,3 直到20世纪80年代背驮式结构被引入 4,5. 本文介绍了一组对piggy-back电极实验室制备方法的重要改进，可实现对完整脑组织的深部穿透 体内 由于电极轴相对较细，可造成最小损伤，因此适用于动物制备。此外，这些电极具有低噪声记录特性，并配备低电阻药物储液管，可高效进行所需药理学物质的离子电渗。

在本实验中，通过离子电泳施加了甘氨酸受体拮抗剂盐酸士的宁。阻断甘氨酸能抑制作用通常会增加神经元的放电活动。图4展示了记录自一个听觉神经元的示例数据，该神经元对施加于动物耳部的强度递增的正弦声刺激产生反应。此类实验被称为神经元的放电率-强度函数。 louder sounds resulted in higher spike rates (黑色曲线)。本实验中初始使用的离子电泳电流为15 nA。当电流开启、放电率-强度函数的变化稳定在新水平后（深蓝色曲线），逐次将推出电流增加至30、45和60 nA（分别为橙色、绿色和浅蓝色曲线）。在每次改变推出电流后，待放电率-强度函数的响应稳定，均记录了该神经元在相同声强范围内的反应。本示例中最合适的推出电流为45 nA至60 nA，因为在此电流水平下，神经元的反应不再发生进一步改变。该结果提示，在45 nA电流时，该神经元的所有甘氨酸受体已被盐酸士的宁完全阻断。进一步增加推出电流并释放更多士的宁，并未引起神经元放电率-强度函数的进一步变化。在实验方案完成后，关闭推出电流。约25分钟后，神经元反应恢复至基线水平（红线）。恢复时间可能因所施加药物的种类和剂量不同，从数秒至数十分钟不等。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>药物</td>
			<td>浓度</td>
			<td>溶液 pH 值</td>
			<td>溶剂</td>
			<td>公司</td>
			<td>货号</td>
			<td>典型保持电流</td>
			<td>典型喷射电流</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>3.5-4.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-2129</td>
			<td>-15 nA</td>
			<td>+5 nA 至 +100 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘氨酸</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>3.5-4.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7126</td>
			<td>-15 nA</td>
			<td>+5 nA 至 +100 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>荷包牡丹碱甲碘化物</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3.0</td>
			<td>dH2O 中含 0.165 M NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6889</td>
			<td>-15 nA</td>
			<td>+5 nA 至 +60 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>盐酸番木鳖碱</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3.0</td>
			<td>dH2O 中含 0.165 M NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8753</td>
			<td>-15 nA</td>
			<td>+5 nA 至 +80 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酸</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-1251</td>
			<td>+30 nA</td>
			<td>-10 nA 至 -150 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-天冬氨酸</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8949</td>
			<td>+30 nA</td>
			<td>-10 nA 至 -150 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>红藻氨酸</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>9.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K-0250</td>
			<td>+30 nA</td>
			<td>-10 nA 至 -100 nA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 常用药物及其溶解所需的pH值和浓度。该表格列出了离子电泳实验中最常用的突触激动剂和拮抗剂。所列pH环境考虑了这些试剂需要极化的特性，而建议浓度则反映了不同药物之间在有效性上的差异。
<img alt="微量移液器吸头比较；示意图显示用于实验室精密分析的A、B、C三种尺寸。" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 三种不同尖端长度的多通道移液管。 A：该5通道电极的尖端拉得过长且过细。注意其尖端已弯曲且非常柔软。此类尖端极难折断至理想直径。B：该电极的尖端过短且粗钝。当插入脑部较深区域时，由于尖端后数毫米处电极迅速变粗，会造成不必要的脑组织损伤。C：尖端拉制恰当的电极示例。该尖端虽长而细，但仍保持坚固，可轻易折断至所需尖端直径。
<img alt="实验装置示意图，电极夹持器的旋转与倾斜；光谱学研究方法。" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 电极操作器组件示意图。该操作器组件与显微镜配合使用，用于组装背靠背电极。灰色标记的项目为市售产品，列于表 2中。蓝色标记的部件由本机构机加工车间定制加工，分别为：1）尺寸为 43×26 cm 的 1/4 英寸钢板，根据 Newport 公司提供的孔位模式，在其上钻孔以适配 Newport 423 型平台；2）可倾斜平台，用于使组件在任意角度下倾斜；3）连接器，用于将电极夹持器安装至顶部平移平台。
<img alt="静态平衡；平衡；移液器；黏土支架，概念演示，物理实验。" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 样品背负式电极照片。一个组装完成的五通道电极与单通道记录电极结合。注意长约7 mm的长轴，可用于深部脑区记录。
<img alt="神经反应图；脉冲计数与声音强度关系；听觉阈值分析。" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 推注电流的滴定。 该图显示了在动物耳朵受到不同强度纯音刺激时，单个听觉神经元记录到的放电率-强度函数。声音越强，引发的放电率越高。在给药前，该神经元的放电率-强度函数表现出最低的脉冲频率（黑色曲线）。逐步增加推注电流会逐步阻断该神经元上更多的甘氨酸受体，从而导致放电率逐步升高。该神经元的最佳推注电流为 45–60 nA。在此推注电流下，可实现对该神经元所有甘氨酸受体的完全阻断。实验方案完成后，终止离子电渗给药，并允许神经元恢复。当恢复后的放电率-强度函数与初始给药前的函数一致时，即实现完全恢复。经美国生理学会许可，引自 Klug et al，1995。

在细胞外在体记录过程中，通过离子电泳施加神经激动剂和拮抗剂是调控神经元微环境的一种强有力方法。此类操作最简便的方式是使用并联多管电极。本文将介绍如何制备此类电极，并将其应用于听觉记录实验中。

制造和使用Piggy-back多管电极 在体 神经反应的药理学调控

单个神经元的在体记录可使研究者检测神经元的放电特性，例如其对感觉刺激的反应。

本实验旨在对脑内微环路进行药理学物质的离子电渗给药，同时记录神经活动。首先，拉制用于单细胞记录的单通道玻璃电极，并将尖端弯曲。同时，拉制多通道玻璃电极，并将尖端折断至所需直径。接下来组装两个电极。最终制备的电极可用于细胞外在体记录，在需要时可将药理学试剂直接施加于神经微环路以进行操控。大家好，我是阿希姆·克鲁博士，今天我们的实验室将向您展示如何制备背负式多管电极。这些电极可用于将离子载体类神经激动剂和拮抗剂注入神经元的微环境，从而在活体中调控神经元的神经回路。大家好，我是安·齐洛博士，我在阿希姆·克劳实验室担任博士后，今天将由我演示该操作流程。对于单通道电极，应使用带纤维丝的单通道玻璃毛细管，将其尖端拉制至直径约1–2微米， shaft长度为10–12毫米。通过将拉制的电极填充三摩尔氯化钠溶液，并在0.9%生理盐水中使用标准欧姆计进行检测，间歇性地验证电极的阻抗。一旦电极内充满盐溶液，溶液会迅速干燥，导致电极失效。因此，仅在必要时进行此项测试。踩踏一些不会用于背负式生产的电极。要制作完整的多管电极，需将玻璃管拉制成总直径约为10微米或更小的移液器尖端。正确拉制的电极尖端对成功至关重要。除了要细长之外，尖端还必须具有一定的硬度，以便在需要时能够轻松折断至理想的尖端直径。在下一步中，将把尖端折断至正确的直径，因此在拉制电极的过程中，尖端的精确尺寸不如电极尖端的整体形状重要，而该形状应细长且相对较细。现在，将单通道电极保持在约45度角，尖端向下，迅速通过火焰。使火焰在距离电极尖端约10毫米的过渡区域熔化玻璃，从而使其弯曲约20度。将多通道电极插入置于载玻片上的 modeling clay（模型黏土）床中，然后将其放入显微镜载物台上。使用显微镜载物台的 XY 操纵器，轻轻移动电极尖端接触有机玻璃片。通过显微镜目镜观察尖端的断裂过程。此处展示了电极组件的装置示意图。将多管电极固定在显微镜载物台的玻璃载片上。单管电极则由手动多轴操纵器夹持，使操作者能够以高精度将单管移液管下放至多管移液管上。将单管电极直接下放至多管电极的凹槽内，该凹槽由五根管的排列形成，使其尖端突出于多管电极尖端约5至10微米。使用氰基丙烯酸酯将两个电极的杆部粘合在一起。从电极尖端最远端的位置开始，用牙签蘸取一滴胶水，沿电极杆部缓慢向电极尖端方向涂抹。若将胶水涂抹得过于靠近电极尖端，则可能导致尖端堵塞，使电极至少部分失去功能。取少量牙科水泥混合，静置约15分钟使其干燥，然后小心取下制作完成的背负式电极。首先从显微操作仪支架上取下，然后从载玻片上分离。在使用电极前，立即准备用各自对应的药物反向填充每个管腔。在五管配置中，将四个外侧管腔填充四种选定的药物，中心管腔则填充3摩尔的氯化钠作为平衡管腔。然后用三摩尔的氯化钠填充单管记录电极。现在打开离子电泳泵模块并测试所有管路。每个泵模块的电极测试功能将有助于确定电极管路对于深部脑记录是否正常工作。组装完成的五管电极与单管记录电极结合后，具有约七毫米长的长轴。在离子电泳中常使用多种突触激动剂和拮抗剂，例如甘氨酸受体拮抗剂，以阻断甘氨酸介导的抑制作用。盐酸曲普九通常可增加神经元的放电活动。该样本数据测量了听觉神经元的放电率与强度关系函数，展示了对动物耳朵施加强度递增的正弦声刺激后的响应。在严格应用九之前，声音越大，引发的脉冲率越高。该神经元的放电率-强度函数显示脉冲率较低。以15纳安的初始离子电渗电流刺激，可引起推出电流轻微增加。逐步提高推出电流会逐步阻断神经元上更多的甘氨酸受体，从而导致神经元放电频率逐步升高。当电流达到45纳安时，该神经元的所有甘氨酸受体似乎均被士的宁盐酸盐完全阻断。进一步增加推出电流并释放更多的利血平并未引起进一步的变化。神经元放电率在离子电渗结束后的水平函数显示，神经反应在约25分钟后完全恢复至基线水平。该恢复过程取决于所推出药物的类型和剂量。需要牢记的是，所施加的药物会扩散至记录位点周围，并可能阻断邻近神经元上的受体。观看本视频后，您应能充分理解如何将记录电极与多管给药电极结合使用，以实现低噪声的深部脑区记录，同时实现最多四种药理学试剂的时间可控递送。

manufacturing-using-piggy-back-multibarrel-electrodes-for-vivo

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

生产和使用背驮式多管电极<em在体内</em&gt;药理手法的神经反应

本文描述了一种在加州海兔（Aplysia...

电极制备及在完整自由活动动物中用于多通道神经和肌肉记录的加州海兔（Aplysia californica）体内植入

理解行为的神经基础需要对脑回路集合进行记录。由于小鼠具有良好的遗传可操作性，因此可作为研究脑回路解析和模拟疾病的模型。本文介绍一种设计和制备微型探针的方法，适用于小鼠深部脑结构的靶向研究。...

超轻量、可调节多电极探针的设计与制备用于小鼠电生理记录

我们演示了两种用于测量脑组织中离子浓度的离子选择性微电极（双管型和同心型）的制备、校准及其特性。随后在小鼠海马脑片制备中应用这些电极，证明了兴奋性活动会同时改变细胞外钾离子和钠离子浓度。...

用于测量脑组织中细胞外离子信号的双管微电极与同心微电极

我们介绍了用于构建电极的方法，可在清醒小鼠中同时记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。该技术能够对目标神经元的潜在局部突触输入进行详细分析。...

清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

本方案描述了一种利用神经递质谷氨酸在体外对大鼠全层视网膜进行化学神经刺激研究的新方法。in...

利用神经递质谷氨酸对大鼠视网膜进行仿生化学神经调节的方法学 体外

本研究探讨了基于酶的微电极阵列（MEA）技术在监测中的创新应用 体内 仔猪神经递质活性.

利用微电极阵列技术研究麻醉诱导的新生仔猪脑神经毒性的方法改良

网格电子探针可无缝整合并实现大脑内稳定、长期的单神经元水平记录。本方案采用网格电子技术用于 体内...

可注射网状电子器件用于稳定的大鼠慢性电生理记录

本方案描述了一种用于在小鼠（Mus musculus）和雪貂（Mustela putorius...

用于急性和慢性在体记录的碳纤维微电极阵列的构建与实施

本文介绍了一种在小型猪模型中对柔性硬膜下电极阵列进行长期性能与安全性评估的方法，详细描述了手术方法与工具、术后磁共振成像、听觉皮层的电生理学特性、植入物的电化学特性以及死后免疫组织化学分析。...

皮层下柔性脑皮层电图（ECoG）阵列植入及小型猪长期皮层记录

我们的目的是提供一份更新的、易于遵循的表肌电图电极制备与测试指南。为此，我们提供了材料采购的说明，以及电极制备和测试过程的详细操作步骤。...

低成本表肌电图电极的开发：一种简化的制备与测试工作流程

学习制作和使用背驮式多管电极进行神经电生理记录的方法。该技术可在记录神经元活动的同时，通过离子电渗精确施加药物，用于研究听觉神经回路的功能调控。

制造和使用Piggy-back多管电极在体神经反应的药理学调控

探索更多视频

制造和使用Piggy-back多管电极 在体 神经反应的药理学调控

探索更多视频

制造和使用Piggy-back多管电极在体神经反应的药理学调控