Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans
2013年2月13日
We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-β signaling.
该视频演示了识别调节基因的程序，请参阅 elgan 生长和体型。使用 RNA 干扰或 RNA 眼灭活候选基因，制备含有表达双链 RNA 的细菌的板，靶向目标基因。将第四幼虫阶段雌雄同体转移到 RNAi 板中。
一旦它们达到年轻成体阶段，它们就会被转移到新的 RNAI 板中产卵。几个小时后，它们被移除，留下同步的胚胎种群。在所需的发育阶段，后代收集并安装在载玻片上。
最后，获取蠕虫的显微图像。图像分析表明基因失活导致体型变化。虽然这种方法可用于识别 TGF β 信号通路的调节因子，但它也可以应用于调节 Sea Elegance 胚胎后发育的其他通路，例如胰岛素信号通路。
通过将靶基因序列克隆到载体 L 4 4 4 0 A 常用的蠕虫 RNAi 质粒中，将重组质粒转化为细菌菌株来开始此过程。HT 一 15 DE 三培养。在 LB 琼脂平板上用每毫升 25 微克碳酸和 12.5 微克/毫升四环素转化的细菌，然后选择单个克隆以备将来使用。
同时，将空载体 L 4 4 4 0 转化到细菌菌株中。HT 一 15.用作实验培养物的对照，将转化的细菌放入 1 毫升 LB 肉汤中，每毫升氨苄青霉素 100 微克，在 37 摄氏度下过夜。
不添加四环素，因为它会降低 RNAI 效率。在过夜培养物中再加入 5 毫升 LB 肉汤和每毫升 100 微克氨苄青霉素，然后在 37 摄氏度下再孵育 4 到 6 小时。培养物准备好后，将 0.5 mL 实验细菌或对照细菌接种到标有适当克隆名称的 RNAI 蠕虫板上。
每种情况至少应准备两块板。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天。
应该存在表达 RNAi 的细菌草坪，有或没有靶基因序列。动物会以细菌为食物来源。一旦 RNAI 饲养板准备好，火焰就会对铂丝的尖端进行消毒。
然后使用铂丝将 6 到 10 个第四幼虫阶段或 L 4 个 C elgan 雌雄同体转移到每个 RNAi 板。让雌雄同体在 20 摄氏度下生长过夜。第二天，动物将是年轻的成年人。
将它们转移到新的、适当标记和制备的 RNAI 板中。将板在 20 摄氏度下孵育 4 到 6 小时，让成虫产蛋。孵育后，从板中取出所有成虫以同步后代。
一旦成虫被移走，就开始计算时间。这是零时间。在 20 摄氏度下孵育板，让动物生长到感兴趣的发育阶段。
在这里，将选择年轻人进行表型分析。对于以正常速率发生的敲低，需要 72 小时的孵育。请记住，各种基因对动物发育的影响不同，因此可能需要调整孵育时间。
如果 RNAi 导致动物以不同的速度生长，则可以将年轻成体识别为第 4 升后不超过 24 小时且 VUL 发育完成且子宫内有 2 至 6 个胚胎的动物，如图所示。为了确定其他发育阶段，研究者应使用性腺和 VUL 发展作为指导。一旦动物长到适当的阶段，准备对 RNAi 处理的蠕虫的体型表型进行评分。
接下来，将两层彩色标签胶带放在玻璃上，如图所示，一毫米厚的标本载玻片。制作两张这样的载玻片。然后用胶带在两张载玻片之间放置一个新的载玻片，并滴入一滴溶于水的 2%Agros。
在新载玻片的中心，将第二张载玻片压在顶部，制成一个薄的 agros 垫。一旦 agros 凝固，取下顶部玻璃。用 agros 垫滑动滑梯，准备加载蠕虫。
使用克隆名称标记幻灯片。将 10 微升 25 毫摩尔叠氮化钠添加到 aros 垫中。然后像以前一样使用铂丝，将 30 至 40 只动物转移到叠氮钠溶液中。
要固定它们，请在顶部放一个盖玻片。对携带 RNAi 处理的重组和空 L 4 4 4 0 动物执行此作。接下来，将千分尺载玻片放在带有 2.5 倍物镜的解剖显微镜下。
使用 Q Capture 或类似软件，捕获千分尺的图像并保存。然后将蠕虫置于范围下并捕获图像。要先测量身体长度，请在 Image Pro 软件中打开千分尺的图像。
然后单击 measure 并选择 calibration。然后选择 空间校准 向导，并选中校准活动图像。单击 Next（下一步）。
输入校准的名称，并确保空间参考单位设置为微米。然后选中 Create a reference calibration 按钮并单击 Next。单击 draw reference line。
将出现一个参考比例尺。重新定位比例尺以匹配千分尺的末端。然后指示引用指示 1000 个单位。
单击 确定。下一步和完成。校准软件后，打开蠕虫镜像。
然后在测量菜单下，选择 calibration（校准），然后单击 select spatial（选择空间）。在下拉菜单中，选择为千分尺校准创建的文件名。然后在 measure （测量） 菜单下，在打开的窗口中选择 measurements （测量）。
选择自由绘制工具，并使用计算机鼠标从头到尾沿着动物身体的中心画一条线。长度将在窗口中报告。对田间的所有动物重复此过程。
将长度测量值导出到 Microsoft Excel 文件或其他合适的统计软件中。通过计算每个样本的均值和标准差来分析数据。然后使用学生的 T 检验比较每个组的结果。
转化生长因子 β 或 TGF β 超家族蛋白 DBL 1 是激活 TGF β 通路所必需的。响应信号激活，细胞内 smad 信号转导易位到细胞核并启动基因转录。参见 TGF β 通路被破坏的优雅 体型更小，包括比野生动物更短的体长。
因此，屏幕呈现了海洋的优雅。体型突变体能够识别 TGF β 信号转导组分和修饰剂，通过饲养鉴定体型突变体来测试 RNAi 的有效性。RNAi 用于敲低 DBL 一通路成分 SMA 三，SMA 六四种不同海洋优雅菌株。
测试的 C 优雅菌株包括两种 RN AI 超敏反应 A 1、Lin 15 B 和 RF 3，以及标准野生型菌株 N 2 和 LIN 36 菌株，其 RNAi 敏感性与 N 2 相似，如图所示。当 SMA 3 或 SMA six 表达被破坏时，除了 Lin 36 中的 SMA six RNAi 外，动物的体型明显短于对照动物。RF 3 的背景。
RNAi 处理后年轻人的背景体长为单独载体的 84% 至 95%。在 A 中，1 Lin 15 B 背景 RNAi 后年轻成体长为对照动物的 68% 至 86%。然而，A 一 lin 15 B 菌株产生 view 后代。
这使得它们不适合进行大规模筛选。因此，建议对这些技术使用 RF 3 菌株。看完这个视频后，你应该对如何使用 RNI 干扰技术识别调节生长和体型的基因有一个很好的了解。
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概述
本视频展示了使用RNA干扰（RNAi）来识别调节秀丽隐杆线虫生长和体型大小的基因的程序。该方法允许大规模筛选以通过DBL-1/TGF-β信号发现参与体型调节的遗传组分。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 发育生物学
背景
- 秀丽隐杆线虫是研究遗传调节的模型生物。
- RNA干扰是基因敲低的强大工具。
- 体型调节受各种遗传因素影响。
- DBL-1/TGF-β信号在生长和发育中起作用。
研究目的
- 展示RNAi喂养技术。
- 识别影响秀丽隐杆线虫体型的基因。
- 促进大规模遗传筛选。
使用的方法
- 准备表达双链RNA的细菌的RNAi板。
- 将第四阶段的雌雄同体转移到RNAi板上。
- 在产卵后收集同步的胚胎群体。
- 将后代装载到载玻片上进行观察。
主要结果
- 成功使用RNAi敲低目标基因。
- 观察秀丽隐杆线虫的体型表型。
- 识别参与生长调节的潜在遗传组分。
- 展示RNAi在发育环境中的有效性。
结论
- RNAi喂养技术对秀丽隐杆线虫的基因敲低是有效的。
- 该方法可以用于大规模遗传筛选。
- 研究结果有助于理解体型的遗传调节。
常见问题
Executive Industry Relevance
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by knocking down candidate genes to assess body size phenotypes.
- Operational Value: Uses RNAi hypersensitive strains like rrf-3 to enhance knockdown sensitivity and reduce false negatives.
- Predictive Value: Identifies TGF-β pathway components such as sma-3 and sma-6, supporting target confidence in growth regulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized worm populations for consistent developmental staging and phenotypic scoring.
- Quantitative Output: Enables body length measurement via microscopy and image analysis, generating continuous data for statistical comparison.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and bacterial feeding systems for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with conserved TGF-β signaling pathways implicated in fibrosis, oncology, and metabolic disorders.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit to preclinical validation by confirming phenotypic impact in a whole-organism context.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on body size penetrance and expressivity across genetic backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in body size regulation through loss-of-function phenotyping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative body size readouts essential for assay standardization and hit confirmation.
- Analytics: Generates length measurements analyzed via mean, standard deviation, and Student’s T-test to evaluate statistical significance.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating hits in conserved pathways like TGF-β, which have mammalian orthologs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNAi feeding platform applicable to other phenotypes such as motility, lifespan, or stress resistance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking gene knockdown to defined phenotypic outcomes in a genetically tractable model.
- Operational Value: Standardizes worm handling, RNAi feeding, and imaging protocols across users and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage target triage using low-cost, high-information-content assays.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic strength and pathway relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi techniques, and microscopic imaging.
- Depends on bacterial culture systems, RNAi plasmids, and temperature-controlled incubators.
- Necessitates standardization of worm staging, feeding duration, and phenotypic scoring across teams.
- Must account for variable RNAi efficiency across genetic backgrounds, as seen in lin-36 and rrf-3 strains.
- Limited to phenotypes observable in whole worms; not suitable for subcellular or biochemical readouts without adaptation.
