Name: 使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略 C.线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 了解利用RNA干扰饲喂技术筛选调控秀丽隐杆线虫体型大小的基因的方法。该技术通过细菌表达双链RNA实现基因敲低，适用于大规模遗传筛选，有助于研究TGF-β信号通路在生长发育中的作用机制。

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我们感谢 James Clark 提供了动物在不同发育阶段的图像。C. elegans 菌株由得到美国国立卫生研究院研究资源中心（NCRR）支持的线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供。本研究由纽约市立大学（CUNY）向 J.L. 和 C.S.D. 资助的 CIRG 1817 项目支持；同时由 NIH 1R15GM073678-01 和 1R15GM097692-01 项目向 C.S.D. 资助。我们感谢 William J Rice 博士、Nathalia Holtzman 博士和 Melissa Silvestrini 对稿件提出的修改意见。本工作部分完成了纽约市立大学研究生中心博士学位的要求（S. Xiong）。

1. 准备含有靶基因序列的RNAi饲喂平板
<ol>
	<li>若使用市售的RNAi文库（例如 来自 Source BioScience LifeSciences），进行步骤 1.4。或者，将目标基因序列克隆至载体 L4440，一种常用的线虫 RNAi 质粒8，按照标准克隆实验方案。</li>
	<li>将重组质粒转化至HT115(DE3)菌株中，在含有25 μg/ml羧苄青霉素和12.5 μg/ml四环素的LB琼脂平板上培养，并挑取单克隆用于后续实验。</li>
	<li>同时，将空载体L4440转化至细菌菌株HT115中，作为实验的对照。</li>
	<li>在含有100 μg/ml氨苄青霉素的1 ml LB培养基中，于37 °C过夜培养携带重组质粒和空L4440质粒的细菌。不添加四环素，因其会降低RNA干扰效率。</li>
	<li>加入5 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤至过夜培养物中，于37 °C继续孵育4–6小时。</li>
	<li>将0.5 ml携带重组或空L4440质粒的细菌培养物接种至RNAi线虫培养板上。用克隆名称标记所有培养板。</li>
	<li>标记培养皿，并在37 °C下过夜培养以形成细菌菌苔；这些为含有或不含目标基因序列的RNAi培养皿。每种条件至少应准备2个培养皿。</li>
</ol>
2. 在RNAi喂养平板上培养线虫
<ol>
	<li>用火焰灭菌铂金丝接种针的尖端。使用该接种针将6-10条第四幼虫期（L4）的雌雄同体线虫转移至每个RNAi平板，平板中应含有重组质粒或空载体L4440；线虫将以平板上的细菌作为食物来源。</li>
	<li>将雌雄同体线虫在20 °C（C. elegans的标准培养条件）下培养过夜，次日它们将发育为年轻成虫。</li>
	<li>将6-10条年轻成虫转移至新制备并相应标记的RNAi平板中。</li>
	<li>让成虫产卵4-6小时，随后将所有成虫从平板中移除；此步骤用于同步子代发育。母本移除后即开始计时，此时间点定义为时间零点。</li>
	<li>将平板在20 °C下继续培养，使线虫发育至特定发育阶段；本实验方案选择年轻成虫进行表型分析。对于发育速率正常的基因敲低个体，培养72小时足以使其发育至年轻成虫阶段。然而，不同基因对线虫发育的影响各异。若RNAi导致发育速率改变，年轻成虫可依据以下特征判定：处于L4期后不超过24小时，阴门发育完全，并在子宫内含有2-6个胚胎（若具有生育能力）。若需鉴定其他发育阶段，研究者应以性腺和阴门的发育情况作为判断依据。</li>
</ol>
3. 评估RNAi处理线虫的体型表型
<ol>
	<li>在载玻片上放置两层彩色标签胶带。制作两张这样的载玻片。然后将一张新的载玻片插入两张带胶带的载玻片之间。将2%琼脂糖溶于水中，在新载玻片中央滴加一滴；然后将第二张载玻片压在上面，形成一层薄薄的2%琼脂糖，具体操作如前所述9。</li>
	<li>待琼脂糖凝固后，移除顶部的载玻片；带有琼脂糖垫的载玻片即可用于加样线虫。用克隆名称标记载玻片。</li>
	<li>在琼脂糖垫上加入10 μl 25 mM NaN3；挑取30–40只线虫进入NaN3溶液以使其固定；然后盖上盖玻片；对携带重组RNAi和空L4440载体的RNAi处理线虫均重复此操作。</li>
	<li>使用解剖显微镜和2.5倍物镜观察线虫；此处我们使用Leica数码相机及配套软件Qcapture进行成像。</li>
	<li>进行校准：首先拍摄标准微米尺的图像。然后在Image-Pro软件中打开该图像，点击“测量”并选择“校准”，再选择“空间校准向导”。在选中“校准当前图像”的情况下，点击“下一步”。输入校准名称，并确保空间参考单位设置为微米。然后勾选“创建参考校准”按钮，点击“下一步”。点击“绘制参考线”，将出现一条参考标尺。调整标尺位置，使其两端与微米尺刻度对齐，然后指定该参考长度为1,000单位。点击“确定”、“下一步”和“完成”。</li>
	<li>软件校准完成后，打开一张线虫图像。在“测量”菜单下选择“校准”，然后点击“选择空间”。在下拉菜单中选择之前为微米尺校准创建的文件名。然后在“测量”菜单下选择“测量”。在弹出的窗口中选择自由绘制工具，用计算机鼠标沿动物体中央从头部到尾部画一条线（图1）。长度将在窗口中显示。此时您已获得两组数据：经目标基因RNAi处理的线虫体长，以及经空L4440载体处理的对照组线虫体长。</li>
	<li>将长度测量数据导出至Microsoft Excel文件或其他合适的统计软件中。通过计算各样本的均值和标准差来分析数据，然后使用Student t检验对样本进行比较。</li>
</ol>

<ol><li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li>
<li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA%3A+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li>
<li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+movement+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li>
<li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Febs.+J%22%5BJournal%5D)">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li>
<li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+TGF%CE%B2+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo%3A+variations+on+ancestral+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在本实验方案中，我们描述了利用RNAi饲喂法鉴定C. elegans体形缺陷突变体的方法。该方法适用于TGF-β信号通路组分的鉴定。由于这些组分在进化过程中高度保守15，此类筛选对于阐明所有后生动物中TGF-β信号转导的分子机制具有重要意义。设计此类筛选实验时需考虑的一个重要因素是起始菌株的选择。我们已证实，eri-1;lin-15b和rrf-3菌株对RNAi饲喂的敏感性均高于对照菌株，这与先前的研究结果一致12,13。然而，尽管eri-1;lin-15b表现出最显著的表型，但其动物生长状况较差且子代数量较少。因此，在大规模筛选中，该菌株无法提供足够数量的个体用于表型评分。基于此，我们倾向于选用rrf-3菌株，将其应用于体形调控的RNAi饲喂实验。选择起始菌株时还需考虑的第二个因素是：应使用DBL-1通路完整的菌株进行筛选，还是采用DBL-1通路功能受损或过度激活的致敏菌株作为起始材料。这两种不同的起始策略可能会鉴定出部分重叠但又各自独特的信号通路组分。本实验方案也可经修改后用于研究其他胚后表型。在此情况...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;RNAi 蚕食平板&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 17.7 g 线虫培养基混合物&lt;br/&gt; 60 g 琼脂&lt;br/&gt; 加入 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 至 3 升。高压灭菌。 &lt;br/&gt; 加入3 ml 1M IPTG（无菌）和3 ml 25 mg/ml氨苄西林（无菌）；然后倒入60 mm培养皿中。 &lt;strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 线虫培养板&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 17.7 克线虫培养基混合物&lt;br/&gt; 0.6 g 硫酸链霉素&lt;br/&gt; 60 g 琼脂&lt;br/&gt; 加入 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 至 3 升。高压灭菌。倒入 60 mm 培养皿中。 &lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;线虫培养基混合物&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 55 g Tris-Cl &lt;br/&gt; 24 g Tris-OH &lt;br/&gt; 310 g 胰蛋白胨 &lt;br/&gt; 800 mg 胆固醇 &lt;br/&gt; 200 g NaCl&lt;br/&gt; 充分混匀，确保无结块；该粉末混合物可在使用前储存数月。&lt;br/&gt;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;2% 琼脂糖 &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 0.5 g 琼脂糖&lt;br/&gt; 加入 25 ml dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 微波加热至溶解。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1 M 异丙基 &amp;#946;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 2 g IPTG&lt;br/&gt; 溶解于10 ml dH₂O中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1M NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 6.5 g NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 加入 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 至 100 毫升&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;25 mM NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 2.5 ml 1M NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 加入 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 至 100 毫升&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫 &lt;/em&gt;来自秀丽隐杆线虫遗传学中心&lt;br/&gt; L4440 质粒（携带氨苄青霉素抗性基因）&lt;br/&gt; 细菌菌株 HT115 (DE3)（含有 IPTG 诱导型 T7 聚合酶；缺乏 RNase III 基因（一种 dsRNA 酶），并携带四环素抗性基因）&lt;sup&gt;16&lt;/sup&gt; &lt;br/&gt; 60 mm 培养皿&lt;br/&gt; 100 mm 培养皿&lt;br/&gt; 14 ml 圆底 Falcon 培养管&lt;br/&gt; 载玻片&lt;br/&gt; 玻璃盖玻片&lt;br/&gt; 1-20 &amp;mu;l 移液器&lt;br/&gt; 20-200 &amp;mu;l 移液器&lt;br/&gt; 200-1000 &amp;mu;l 移液器&lt;br/&gt; 1-200 &amp;mu;l 移液器吸头&lt;br/&gt; 200-1000 &amp;mu;l 移液器吸头&lt;br/&gt; 1.5 ml 离心管 &lt;br/&gt; 铂金丝线虫挑取针 </td></tr></tbody></table>

利用rna介导的干扰喂养策略筛选参与线虫 c. elegans 体尺寸调控的基因

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

双链RNA介导的干扰（RNAi）是一种有效抑制靶基因表达的策略1-3已将其应用于多种模式系统，包括植物、无脊椎动物和脊椎动物。实现RNAi的方法有多种 体内4,5例如，可将目的基因插入RNAi载体中，随后永久性或瞬时性地转染至细胞系或原代细胞，以实现基因敲低效果；或者，可将针对特定目的基因合成的双链寡核苷酸（RNAi寡核苷酸）瞬时转染至细胞系或原代细胞，以沉默目的基因；亦可通过显微注射将合成的双链RNA分子导入生物体内。由于线虫 秀丽隐杆线虫 以细菌作为食物来源，通过喂食表达针对目标基因的双链RNA的细菌，提供了一种可行的策略6在此，我们介绍一种通过RNAi饲喂法来评估体型表型的方法。体型在 秀丽隐杆线虫 主要由类似TGF-β的配体DBL-1调控，因此该检测适用于鉴定TGF-β信号通路组分7我们使用了不同品系，包括两种RNAi超敏感品系，重复了RNAi饲喂实验。结果显示 rrf-3 该品系产生了最符合预期的RNAi表型。该方法操作简便、可重复性强，且易于量化。此外，我们的实验方案最大限度减少了对专用设备的依赖，因此适用于规模较小的实验室或以本科生为主的教学科研机构。

在我们的研究中，我们关注 DBL-1/TGF-β 信号通路对体形大小的调控作用。DBL-1 通路功能缺失会导致体型变小，包括与野生型动物相比体长缩短7,10,11。因此，对 C. elegans 体形大小突变体的筛选能够鉴定出 TGF-β 信号通路的组分及其调控因子。DBL-1 信号通过一条保守的 TGF-β 信号转导通路介导，该通路包括细胞表面受体和细胞内 Smad 信号转导蛋白12。为了检验通过喂养方式进行 RNAi 干扰在鉴定体形大小突变体中的有效性，我们利用该技术敲低了 DBL-1 通路的多个组分：dbl-1/配体；sma-2、sma-3、sma-4/Smad 蛋白；以及 sma-6/受体。在本研究中，我们采用了两种不同的 RNAi 超敏感 C. elegans 品系进行实验：eri-1;lin-15b 和 rrf-313,14。同时，我们也使用了 N2（标准野生型）品系以及 lin-36 品系，后者是 lin-15 通路...

我们演示了如何利用RNAi饲喂技术在C. elegans中敲低目标基因，并评估其体长表型。该方法可用于大规模筛选，以鉴定潜在的感兴趣遗传组分，例如参与DBL-1/TGF-β信号通路调控体长的基因。

利用RNA介导的干扰喂养策略筛选参与线虫 C. elegans 体尺寸调控的基因

双链RNA介导的干扰（RNAi）是一种有效抑制靶基因表达的策略1-3。该技术已应用于多种模式系统……

本视频演示了一种用于鉴定调控线虫生长和体型大小基因的实验方法。通过RNA干扰（RNAi）技术使候选基因失活：首先制备含有表达针对目的基因的双链RNA细菌的培养板。将处于四龄幼虫期的雌雄同体线虫转移至RNAi培养板中。当它们发育至年轻成虫阶段后，将其转移至新的RNAi平板以产卵。数小时后移除成虫，留下同步化的胚胎群体。在所需发育阶段收集后代，并将其置于载玻片上进行观察。最后，获取线虫的显微图像。图像分析展示了基因失活所引起的身体尺寸变化。尽管该方法可用于鉴定TGF-β信号通路的调控因子，也可应用于其他调控海鞘类动物幼后发育的信号通路，例如胰岛素信号通路。首先将目标基因序列克隆到载体 L4440 中（一种常用的线虫 RNAi 质粒），然后将重组质粒转化至细菌菌株 HT115(DE3) 中进行培养。将转化后的细菌接种于含有 25 µg/mL 氨苄青霉素和 12.5 µg/mL 四环素的 LB 琼脂平板上，随后挑取单克隆用于后续实验。同时，将空载体 L 4 4 4 0 转化至细菌菌株 HT one 15 中。作为实验对照，将转化后的细菌接种于 1 毫升含有 100 微克/毫升氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，在 37 摄氏度下过夜培养。不添加四环素，因为它会降低RNAI的效率。向过夜培养物中加入5毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基，然后在37摄氏度下继续孵育4至6小时。培养物准备就绪后，将0.5毫升实验组或对照组细菌接种到标记有相应克隆名称的RNAI线虫平板上。每种条件至少应准备两个培养皿。将培养皿在37摄氏度下孵育过夜。第二天。应存在表达RNAi（含或不含目标基因序列）的细菌菌苔。动物将利用这些细菌作为食物来源。一旦RNAi喂养平板准备就绪，用火焰灭菌铂丝的尖端。然后用铂金丝将六到十只四龄幼虫期（L4期）的秀丽隐杆线虫雌雄同体转移到每个RNAi平板上。在20摄氏度下培养过夜。次日，这些线虫将发育为年轻成虫。将它们转移到新制备且正确标记的RNAi平板上。在20摄氏度条件下孵育4至6小时，使成虫产卵。孵育结束后，从平板中移除所有成虫，以同步后代发育。成虫移除后，开始计时，此为零时。将培养皿置于20摄氏度条件下孵育，使动物生长至目标发育阶段。此处将选择年轻成体进行表型分析。对于发育速率正常的基因敲低样本，需要72小时的孵育时间。需要注意的是，不同基因对动物发育的影响各不相同，因此孵育时间可能需要相应调整。如果RNAi导致动物以不同的速率生长，则可通过以下特征识别年轻成虫：即处于L4期后不超过24小时，且具有完全发育的外阴结构（VUL）以及子宫内含有2至6个胚胎的个体，如图所示。要识别其他发育阶段，研究人员应以性腺和外阴（VUL）的发育情况作为参考依据。一旦动物生长至适当阶段，即可准备对经RNAi处理的线虫进行体长表型的评分。接下来，如图所示，在一个厚度为一毫米的玻璃载玻片上放置两层彩色标签胶带。制备两个这样的载玻片。然后将一个新的玻璃载玻片置于两个带有胶带的载玻片之间，并加入一滴溶于水的2% Agros溶液。在新载玻片中央，将另一块载玻片压在上面，形成一层薄薄的琼脂垫。待琼脂凝固后，移除上方的载玻片。带有琼脂垫的载玻片即可用于加样线虫。用克隆名称标记载玻片。向 aros 垫中加入 10 微升 25 毫摩尔的叠氮化钠。然后像之前一样使用铂金丝，将 30 至 40 只动物转移至叠氮化钠溶液中。为了固定它们，在顶部放置盖玻片。对携带RNAi处理的重组和空L 4 4 4 0动物均进行此操作。接着，将微米尺载玻片置于解剖显微镜下，使用2.5倍物镜。使用 Q Capture 或类似软件拍摄显微测微尺的图像并保存。然后将线虫置于显微镜下并拍摄图像。首先测量体长时，在 Image Pro 软件中打开显微测微尺的图像。然后单击“测量”并选择“校准”。接着选择“空间校准向导”，并选中“校准活动图像”选项。单击“下一步”。输入校准的名称，并确保空间参考单位设置为微米。然后勾选“创建参考校准”按钮，点击“下一步”。点击“绘制参考线”。将出现一个参考比例尺。移动比例尺的位置，使其两端与显微测微尺的末端对齐。然后指明该参考比例尺表示1000个单位。单击“确定”，然后单击“下一步”和“完成”。软件校准后，打开一张线虫图像。然后在“测量”菜单下选择校准，再点击选择空间。在下拉菜单中，选择为显微测微尺校准创建的文件名。然后在“测量”菜单下，选择打开窗口中的测量选项。选择自由绘制工具，使用计算机鼠标沿动物身体从头部到尾部的中心画一条线。长度将在窗口中显示。对视野中的所有动物重复此过程。将长度测量数据导出至 Microsoft Excel 文件或其他合适的统计软件中。通过计算每个样本的均值和标准差来分析数据，然后使用学生t检验对各组结果进行比较。转化生长因子β（TGFβ）超家族蛋白DBL-1是激活TGFβ信号通路所必需的。在信号激活后，细胞内Smad信号转导分子会转位至细胞核，并启动基因转录。TGFβ通路发生缺陷的秀丽隐杆线虫表现为体型较小，其体长较野生型动物更短。因此，秀丽隐杆线虫可用于筛选体形大小突变体，以鉴定TGFβ信号通路的组分和调控因子，并通过喂养法RNAi检测其有效性，从而筛选体形大小突变体。利用RNAi通过喂养法敲低了秀丽隐杆线虫四种不同品系中DBL-1通路组分SMA-3和SMA-6。测试的秀丽隐杆线虫品系包括两种对RNAi高度敏感的品系：A一、Lin 15 B和RF三，以及标准野生型品系N二和LIN 36品系，其中LIN 36的RNAi敏感性与N二相似，如图所示。当SMA三或SMA六的表达被干扰时，除Lin 36中SMA六RNAi外，动物体长显著短于对照动物。RF三为背景品系。经RNAi处理后，幼龄成虫的体长为仅含载体对照组的84%至95%。在A型lin-15B背景下，经RNAi处理后幼龄成虫的体长为对照动物的68%至86%。然而，A型lin-15B品系产生的子代数量较少。这使得它们不适合大规模筛选。因此，建议在这些技术中使用RF三菌株。观看本视频后，您应该能够很好地理解如何利用RNA干扰技术鉴定调控生长和体型的基因。

using-rna-mediated-interference-feeding-strategy-to-screen-for-genes

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Biology

生物学

使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略<em&gt; C.线虫</em

神经连接蛋白（neurexins）和神经连接素（neuroligins）是膜性神经元黏附蛋白，在突触分化和信号传递中发挥关键作用。C. elegans...

渗透压回避行为中的Caenorhabditis elegans：两个基因的突触功能——人类NRXN1和NLGN1的同源基因作为自闭症候选基因的研究

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C.

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

我们描述了一种利用 C. elegans 和RNAi饲喂文库的实验方案，可对群体中单个线虫的荧光强度、体型大小和不透光度等多个参数进行自动化测量。我们以一个筛选参与C.

C. elegans 中的定量自动化高通量全基因组 RNAi 筛选

RNAi 是一种强大的遗传学工具，可供 C. elegans 研究人员使用。本视频介绍了一种利用液体培养条件处理比平板喂养更多线虫的 RNAi...

在液体培养中进行RNAi饲喂：一种在 C. elegans 中敲低基因表达的高通量方法

使用 dsRNA 饲喂文库在 C. elegans 中进行大规模基因敲低以产生稳定的基因功能缺失表型

C. elegans 已成为研究宿主-病原体相互作用的一种新型遗传学模型。本文介绍了一种利用Salmonella typhimurium感染C.

一种感染方案 秀丽隐杆线虫 与 鼠伤寒沙门氏菌

本文详细描述了专门用于监测线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

表征线虫胚胎伸长的新指标 秀丽隐杆线虫

本实验方案演示了如何利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白作为标记，并结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在热应激条件下追踪蛋白质的核转位过程。DAPI染色步骤快速，且能有效保留GFP及蛋白质亚细胞定位信号。...

通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

评估测量寿命和健康寿命的低成本方法 秀丽隐杆线虫

了解利用RNA干扰饲喂技术筛选调控秀丽隐杆线虫体型大小的基因的方法。该技术通过细菌表达双链RNA实现基因敲低，适用于大规模遗传筛选，有助于研究TGF-β信号通路在生长发育中的作用机制。

利用RNA介导的干扰喂养策略筛选参与线虫 C. elegans 体尺寸调控的基因

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