Name: 成像pHluorin标记插入到质膜受体原代培养的小鼠神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 学习使用超敏pHluorin标记多巴胺D2受体，在原代培养小鼠海马神经元中实时成像质膜受体插入过程。该方法结合全内反射荧光显微镜技术，可揭示受体转运动态机制。

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本工作由杰克逊实验室的启动资金支持。

1. 为神经元培养条件化制备小鼠胶质细胞培养物
<ol>
	<li>将 T75 培养瓶用胶原蛋白溶液（Purecol 以 ddH2O 按 1:3 比例稀释）包被。将培养瓶直立放置，在组织培养超净台中过夜晾干。</li>
	<li>制备灌注缓冲液（aCSF：119 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、30 mM 右旋葡萄糖、25 mM HEPES，pH 7.4，不含钙离子）和胶质细胞培养基（DMEM 添加 10% FBS、10 单位/ml 青霉素、10 μg/ml 链霉素及 Glutamax），并储存于 4 °C，待用。</li>
	<li>在制备胶质细胞培养物当天，将胶质细胞培养基在 37 °C 水浴中预热至少 30 分钟，随后进行小鼠脑组织的解剖。通过快速断头法处死胚胎期或新生期小鼠，并在解剖显微镜下分离大脑皮层组织。</li>
	<li>将分离的脑组织在木瓜蛋白酶溶液（2 ml 解剖缓冲液中含 100 ml 木瓜蛋白酶和 20 μl 1% DNase I）中于 37 °C 消化 20 分钟。</li>
	<li>木瓜蛋白酶消化后，用 10 ml 预热的胶质细胞培养基清洗脑组织。向消化后的脑组织中加入新鲜胶质细胞培养基（2 ml），并用火焰抛光的玻璃巴氏吸管吹打混悬。</li>
	<li>向解离后的组织中加入新鲜胶质细胞培养基（8 ml），使用 70 μm 细胞滤器过滤细胞悬液。然后将细胞接种至 T75 培养瓶中（通常 2–3 个胚胎可接种一个 T75 培养瓶），并置于 37 °C 细胞培养箱中培养。</li>
	<li>次日，吸除 T75 培养瓶中的培养基，用 10 ml PBS 清洗培养瓶，再向每个培养瓶中加入新鲜胶质细胞培养基（10–15 ml）。</li>
	<li>10–12 天内，T75 培养瓶中的胶质细胞应达到融合状态。用 PBS 清洗胶质细胞，每瓶加入 5 ml 0.05% 胰蛋白酶溶液。</li>
	<li>在 37 °C 胰蛋白酶消化 5 分钟后，胶质细胞解离，将每个 T75 培养瓶中的细胞分种至两个不同的胶原蛋白包被的 T75 培养瓶中。</li>
	<li>将培养插件（Millipore PICM03050）放入 6 孔板中，包被胶原蛋白后过夜空气干燥。在每个培养插件下方加入胶质细胞培养基（每孔 2 ml）。</li>
	<li>将融合状态 T75 培养瓶中的胶质细胞经胰蛋白酶消化后，接种至培养插件上（每个 6 孔板接种一个 T75 培养瓶的细胞，每插件 2 ml）。这些胶质细胞培养插件将用于神经元培养的条件培养基制备。</li>
</ol>
2. 神经元培养
<ol>
	<li>用于神经元培养的玻璃盖玻片需在70% HNO3中浸泡至少过夜以进行清洗。随后用ddH2O至少清洗3次，并在Isotemp烘箱（>200 °C）中干燥过夜。</li>
	<li>将清洗后的盖玻片放入6孔板中，每孔放置一片盖玻片。在37 °C培养箱中，用聚-L-赖氨酸溶液（2 ml，0.1%溶于100 mM硼酸，pH = 8.5）对盖玻片包被过夜。</li>
	<li>移除聚-L-赖氨酸溶液，并用高压灭菌的ddH2O清洗盖玻片3次。随后在37 °C培养箱中，将盖玻片在铺板培养基（Neurobasal培养基添加5%热灭活马血清、10单位/ml青霉素、10 μg/ml链霉素、Glutamax；使用当天加入2% B27补充剂）中孵育过夜。</li>
	<li>次日，移除铺板培养基，并向每孔含玻璃盖玻片的孔中加入2 ml新鲜含B-27的铺板培养基。</li>
	<li>通过CO2处死孕鼠（E15-18），并通过断头法处死胚胎小鼠。从脑组织中分离海马或纹状体，并分别置于含有冰冻解剖缓冲液的15 ml圆锥管中，用于培养海马神经元或纹状体中型棘状神经元。</li>
	<li>解剖所得脑组织按照步骤1.4）和1.5）所述方法用木瓜蛋白酶进行解离。</li>
	<li>解离完成后，使用血细胞计数板对各神经元悬液中的细胞数量进行计数。随后以每孔0.4 × 106个细胞的密度将神经元接种至各盖玻片上，并在37 °C培养箱中培养过夜（此时神经元处于DIV 0阶段）。</li>
	<li>为准备用于神经元培养条件化的胶质细胞培养插件，需移除胶质细胞培养插件中的胶质细胞培养基，并加入新鲜铺板培养基（插件内加入2 ml，插件下方也加入2 ml）。</li>
	<li>次日（DIV 1），将带有神经元的盖玻片置于胶质细胞培养插件下方，每孔放置一片盖玻片。</li>
	<li>每隔3-4天，用半量新鲜预热的喂养培养基（含B-27）对神经元进行换液，直至其可用于转染和成像实验。</li>
</ol>
3. 转染
<ol>
	<li>使用 Lipofectamine 2000 进行神经元转染。每份神经元培养物（每张盖玻片一份培养物）使用 2 μl Lipofectamine 2000 和 1 μg DNA。采用无添加物的新鲜 Neurobasal 培养基稀释 Lipofectamine 和 DNA。</li>
	<li>DNA 与 Lipofectamine 混合后，在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>从每个胶质细胞培养插件下方保存 1 ml 培养基，同时从每个插件内部保存 1 ml 培养基，并将这些培养基转移至锥形管中。向所保存的培养基中加入等体积的喂养培养基 + B27，并在 37 °C 下孵育。该培养基用于转染后的神经元培养。</li>
	<li>在 Lipofectamine/DNA 混合物室温孵育 20 分钟后，暂时将胶质细胞培养插件从 6 孔板中取出。将 200 μl Lipofectamine/DNA 混合物加至每张含神经元的盖玻片上，然后将胶质细胞培养插件放回各孔中，位于神经元上方。应避免培养插件膜下产生气泡。神经元在 37 °C 下与 Lipofectamine/DNA 混合物共孵育 2–4 小时。</li>
	<li>在 2–4 小时孵育期结束后，再次移除胶质细胞插件。从各孔中移除含有 Lipofectamine/DNA 混合物的培养基。将步骤 3.3 中保存的培养基加入神经元培养物中（每孔 2 ml）。将胶质细胞培养插件放回各孔，移除各插件中的胶质细胞培养基，并向每个插件中加入 2 ml 步骤 3.3 中的培养基。</li>
	<li>神经元继续培养额外 24–72 小时，以允许转染的 cDNA 表达，随后对这些神经元进行 TIRF 成像。</li>
</ol>
4. 全内反射荧光成像
<ol>
	<li>活细胞成像实验将使用人工脑脊液（aCSF：119 mM NaCl、2.5 mM KCl、30 mM 葡萄糖、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、25 mM HEPES，pH = 7.4）。我们的全内反射荧光（TIRF）成像系统为自行搭建，采用100 mW的Cyan激光器作为激发光源，配备电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机作为探测器。</li>
	<li>在成像实验开始前，将aCSF置于37 °C水浴中预热至少30分钟。将活细胞成像加热插件放置于显微镜载物台上，并在成像实验开始前至少30分钟开启加热插件、激光器和相机进行预热。</li>
	<li>将载有转染神经元的盖玻片组装入活细胞成像腔室中。在完成腔室组装后，迅速加入预热的aCSF；此步骤应尽快完成。</li>
	<li>将腔室置于显微镜载物台的加热插件上后，通过落射荧光成像模式在显微镜下目视识别转染的神经元。</li>
	<li>在确认健康的转染神经元后（参见图1和图2），通常进行1分钟的光漂白，以消除质膜上已存在的pHluorin荧光。因为在TIRF成像初始阶段，质膜上的pHluorin受体荧光信号非常强，会干扰单个膜插入事件的观察。</li>
	<li>光漂白完成后，将EMCCD相机的电子倍增增益设置为最大值，并以10 Hz的频率连续采集1分钟的图像。</li>
	<li>每次记录包含600幅图像。使用ImageJ软件回放记录视频以识别单个插入事件，并通过ImageJ手动分析这些插入事件。</li>
</ol>
5. 代表性结果
稳定的神经元培养是成功进行活体成像实验的关键。图1展示了采用本实验方案培养的小鼠海马神经元，从体外培养第11天（DIV 11）至第18天（DIV 18）的形态。图像清晰显示，神经元已发育出丰富的突起，树突上密集分布着树突棘，表明这些神经元在培养中状态良好。本培养方案也可用于脑内其他类型的神经元。例如，我们近期在一项研究中采用该方案培养了小鼠纹状体中型棘状神经元，以检测多巴胺D2受体（DRD2）在这些培养神经元中的插入过程9。图2展示了采用本方案培养至体外第8天（DIV 8）的小鼠纹状体中型棘状神经元。我们已成功在此类神经元中进行全内反射荧光（TIRF）成像，用于观察超 ecliptic pHluorin 标记的DRD2受体。图3展示了pHluorin标记的DRD2（pH-DRD2）在中型棘状神经元中的表达，以及pH-DRD2在该神经元中插入过程的可视化结果。
<img alt="神经元生长显微图像；树突发育；体外培养第11-18天；比例尺为50µm、10µm。" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 采用界面培养法培养的小鼠海马神经元。DIV：体外培养天数（days in vitro），接种当天记为DIV 0。从图中可见，海马神经元在此类培养体系中于DIV 11至DIV 15之间逐渐成熟。在DIV 11和DIV 13时，神经元树突上布满丝状伪足和未成熟树突棘。在DIV 15和DIV 18时，神经元树突上出现大量较大的树突棘，提示神经元更为成熟。左侧面板：不同发育阶段小鼠海马神经元的低倍镜图像。右侧面板：高倍镜图像（对左侧面板中神经元树突区域的放大），显示不同发育阶段神经元树突及其树突棘的形态。
<img alt="神经元发育的显微镜图像，MSN DIV 7，显示树突生长和分支模式。" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图 2. 采用界面培养法培养的小鼠纹状体中等棘状神经元培养物。图像中的神经元处于 DIV 8 阶段。
<img alt="使用荧光标记进行神经元成像；显微镜实验显示细胞结构与动态。" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 转染了超椭圆型pHluorin标记的多巴胺D2受体（pH-DRD2）的小鼠纹状体中型棘状神经元。左侧图像为延时记录（600张图像，每张100毫秒）的最大强度投影。白色箭头指示单个囊泡插入pH-DRD2的过程。该图像在x-y维度上保留了插入信息，但丢失了时间信息。右侧图像显示y-t最大强度投影，其中将x-y-t图像堆栈绕y轴旋转90度，并将每条x轴线上的最大像素投影到单个y轴像素上。该图像在y-t轴向上保留了插入信息，但丢失了x轴信息。

<ol><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li>
<li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li>
<li>Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PICK1+and+phosphorylation+of+the+glutamate+receptor+2+%28GluR2%29+AMPA+receptor+subunit+regulates+GluR2+recycling+after+NMDA+receptor-induced+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization.</a> J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).</li>
<li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li>
<li>Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+extrasynaptic+insertion+by+4.1N%2C+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation.</a> 12, 879-887 (2009).</li>
<li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q%2FR+editing+of+the+ion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).</li>
<li>Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Two+Functionally+Distinct+Endosomal+Recycling+Pathways+for+Dopamine+D2+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor.</a> Journal of Neuroscience. , (2012).</li>
<li>Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+delivery+of+internalized+signaling+receptors+to+the+somatodendritic+surface+by+sequence-specific+local+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion.</a> J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li>
<li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).</li>
<li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP%3A+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+versus+global+synaptic+plasticity+on+dendrites+controlled+by+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience.</a> Neuron. 72, 1001-1011 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

由于未知原因，小鼠神经元的培养通常比大鼠神经元更困难。根据我们的经验，将神经元与胶质细胞共培养对原代小鼠神经元的生长效果较好。然而，这种共培养体系不适用于全内反射荧光（TIRF）成像实验，因为在该体系中，神经元及其突起倾向于在胶质细胞上方生长，导致神经元胞体和树突过程超出TIRF显微镜的成像范围。因此，理想的TIRF成像条件是使用细胞密度较低、盖玻片上胶质细胞极少的神经元纯培养体系。我们首先测试了Banker方法19;20，该方法先在培养皿底部接种胶质细胞，再将神经元接种于盖玻片上，然后将盖玻片倒置放入培养皿中。盖玻片与胶质细胞层之间通过盖玻片上的三个微小蜡滴隔开。该方法适用于较小尺寸的盖玻片（如15 mm或18 mm盖玻片），但当我们尝试使用25 mm盖玻片时，发现盖玻片中央区域的神经元状态不如边缘区域的神经元健康。
 尽管我们尚不清楚神经元健康状况存在差异的具体原因，但我们推测这可能是由于营养物质向盖玻片中央区域扩散受限所致。因此，我们采用了本文所述的界面培养方法，因为培养插件的膜允许营养物质自由扩散至盖玻片上的神经元。我们将神经元接种在25 mm盖玻片上...

<table><tbody><tr><td>纯化牛胶原蛋白溶液（Purecol）</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-045</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strep）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNase I）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-10MG</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05%胰蛋白酶</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636-1G</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 168-500</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27无血清添加剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>热灭活马血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668 019</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养插件</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr></tbody></table>

成像小鼠原代培养神经元中phluorin标记受体插入质膜的过程

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

要更好地理解受体在质膜（PM）与细胞内区室之间转运的调控机制，需要采用具有优异空间和时间分辨率的实验方法。此外，该方法还必须能够区分定位于质膜上的受体与位于细胞内区室中的受体。尤为重要的是，由于单个囊泡仅携带少量受体，因此在单个囊泡中检测受体需要极高的检测灵敏度。目前研究受体转运的常规方法包括细胞表面生物素化后进行生化检测，但该方法缺乏必要的空间和时间分辨率；另一种方法是通过荧光显微镜观察免疫标记的细胞表面受体，但该方法需要对细胞进行化学固定，因而无法提供足够的时间分辨率1-6。为了克服这些局限性，我们及其他研究者开发并采用了一种新策略，能够以优异的空间和时间分辨率可视化受体动态插入质膜的过程7-17。该策略包括将一种pH敏感型绿色荧光蛋白——超灵敏pHluorin18，标记至受体的N端胞外结构域。超灵敏pHluorin具有独特的性质：在中性pH下具有荧光，而在酸性pH（pH &lt; 6.0）下无荧光。因此，当标记的受体位于细胞内转运囊泡或早期内体区室的酸性腔内时，不产生荧光信号；只有当其暴露于细胞外中性pH环境，即到达质膜外表面时，才可被清晰地观察到。这一策略使我们能够有效区分质膜表面的受体与细胞内转运囊泡中的受体。为了获得足够的空间和时间分辨率，以及研究受体动态转运所需的灵敏度，我们采用了全内反射荧光显微镜（TIRFM），该技术使我们实现了光学成像的最佳空间分辨率（约170 nm）、视频速率显微镜的时间分辨率（30帧/秒），以及单个GFP分子荧光信号的检测灵敏度。通过在TIRFM下对pHluorin标记的受体进行成像，我们能够在培养的神经元中直接观察到单个受体插入质膜的过程。该成像方法原则上可应用于任何具有胞外结构域并可用超灵敏pHluorin标记的膜蛋白，有助于深入解析不同类型膜蛋白（如受体、离子通道、转运蛋白等）插入质膜的关键分子机制。

通过将膜受体的胞外结构域与超 ecliptic pHluorin 进行标记，并在培养的小鼠神经元中对这些融合受体进行成像，我们可以直接观察受体插入质膜的单个囊泡事件。该技术将有助于阐明调控受体插入质膜的分子机制。

成像小鼠原代培养神经元中pHluorin标记受体插入质膜的过程

深入理解调控受体在质膜（PM）与细胞内区室之间转运的机制，需要一项……

以下实验的总体目标是观察神经元受体在原代培养的小鼠神经元中插入质膜的过程。为此，从小鼠胚胎或新生小鼠的大脑皮层中获取胶质组织（GL），并在半透性胶原包被的培养小室中进行培养。胶质细胞培养物被置于载玻片上原代胚胎海马神经元的上方进行共培养。随后，在经过七天的诱导培养后，神经元被转染表达一种带有超 ecliptic 荧光蛋白标记的多巴胺 D2 受体。该标记受体定位于细胞内囊泡中，但在囊泡的酸性环境中不产生荧光。然而，当囊泡与细胞质膜融合时，荧光蛋白暴露于细胞外中性 pH 环境，从而强烈发光，可通过全内反射荧光显微镜进行检测。该方法有助于解答膜蛋白转运领域的关键问题，使我们能够可视化任何可用荧光标记的膜蛋白的转运过程，例如谷氨酸受体和G蛋白偶联受体。今天将与我一同演示该实验步骤的还有 breeding dry 以及我们研究团队的另外两名成员。在解剖操作的前一天，用胶原溶液处理 T75 培养瓶，将培养瓶直立放置，过夜晾干。在胶质细胞培养当天，将胶质细胞培养基在37°C水浴中预热至少30分钟；在处死动物后，在解剖显微镜下分离胚胎或新生小鼠的大脑皮层。将取出的皮层组织放入一个15毫升的锥形管中，管内装有冰上预冷的人工脑脊液（A CSF）。随后，除去大部分A CSF，仅保留2毫升，再加入100微升的木瓜蛋白酶溶液和20微升1% DNase I。将该管置于37°C水浴中，使组织消化20分钟。消化后，小心地吸除丙烷溶液，加入10毫升预温的胶质细胞培养基，轻柔洗涤脑组织，注意避免扰动组织。随后，尽可能彻底地移除胶质细胞培养基。加入 2 毫升新鲜胶质细胞培养基，使用火焰抛光的玻璃移液管轻轻吹打，直至组织不可见。当组织完全解离后，避免产生气泡。再加入 8 毫升新鲜胶质细胞培养基，并将悬液通过 70 微米细胞滤网进行吹打转移。用50毫升锥形管收集流出液。将两个到三个胚胎的解离细胞转移至胶原包被的T75培养瓶中，在37摄氏度的组织培养孵育箱中培养过夜。次日吸去培养基，用10毫升PBS洗涤细胞一次。然后向每个培养瓶中加入10至15毫升新鲜胶质细胞培养基。将培养物孵育10至12天，每3至4天更换一次培养基。待细胞融合后，用PBS冲洗胶质细胞。然后向烧瓶中加入 5 毫升 0.05% 胰蛋白酶溶液，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟，使细胞脱落。短暂孵育后，加入胶质细胞培养基，并用移液器吹打，使 GL 从烧瓶底部脱落。将细胞分种到两个新的经胶原包被的 T75 培养瓶中。待细胞生长至汇合后，按前述方法进行胰蛋白酶消化，并将每瓶细胞接种至六孔板中的胶原包被培养插入物内，置于含有2毫升神经胶质细胞培养基的培养环境中培养1至7天。这些神经胶质细胞培养插入物将用于神经元培养的条件培养。向含有已清洗的多聚赖氨酸包被盖玻片的六孔板的每个孔中加入 4 毫升铺板培养基，将板置于 37°C 培养箱中孵育过夜。此步骤最有可能通过在次日去除残留的多聚赖氨酸，从而提高神经元存活率。移除铺板培养基，并更换为 2 毫升新鲜的铺板培养基。培养基中含有培养基体积的2%。用于培养海马神经元的B27补充剂。在解剖显微镜下，从4只E15至E18胚胎小鼠的脑组织中分离海马。将海马置于含有冰上预冷的解剖缓冲液的15毫升圆锥形离心管中。接下来，从三只 E15 至 E18 胚胎小鼠的脑组织中分离出纹状体，并将其置于含有冰上预冷的分离缓冲液的另一个 15 毫升锥形管中。用 pepane 消化组织，操作同前。然后使用血细胞计数仪。确定每种神经元悬液中的细胞数量并进行接种。每个盖玻片接种 0.4 × 10⁶ 个细胞，并在 37°C 培养箱中培养过夜。为准备用于条件化神经元培养物的胶质细胞培养小室，吸去胶质细胞培养小室及培养板中的培养基，并为每个小室加入 2 mL 新鲜铺板培养基。次日，将带有神经元的盖玻片放入培养皿的每个孔中，置于胶质细胞培养插件的下方。继续在37摄氏度下培养，每三到四天更换一次培养基，替换为含有B27的预热新鲜培养基，直至细胞可用于转染和成像实验。神经元将在培养的第7天进行转染，并在第8天进行成像。稳定的神经元培养是成功进行活体成像实验的关键。该图显示了使用本方案培养的小鼠海马神经元，体外培养时间从11天至18天。从图像中可以明显看出，神经元已长出大量突起，且树突突起上密集分布着树突棘。这些形态特征表明每种神经元培养物中的神经元在培养条件下均保持良好的健康状态。将两微升脂质体与2001微克编码多巴胺D2受体的DNA混合，该受体与超级荧光蛋白标记物相连。混合后在室温下孵育20分钟。孵育期间，从每个胶质细胞培养小室的下方和内部各取出1毫升培养基，转移至同一锥形管中。然后向保存的培养基中加入等体积含B 27的喂养培养基，并在37°C下孵育。此培养基将在转染后20分钟脂质体作用平均DNA孵育短暂时间后用于神经元培养。从六孔板中取出胶质细胞培养小室。向每张含有神经元的盖玻片加入200微升脂质体DNA混合物。避免在培养膜下产生气泡。更换胶质细胞培养插件，并在37摄氏度下孵育2至4小时。孵育结束后，再次移除胶质细胞插件，吸出每孔中的转染溶液，然后向神经元中加入之前保存的2毫升培养基，并重新放入胶质细胞培养插件。最后，从每个插入物中移除胶质细胞培养基，并向每个培养物中加入两毫升保存的培养基。继续培养细胞24至72小时，以允许转染的CD NA表达。本视频中使用的全内反射荧光（TIRF）成像系统为定制装置，配备100毫瓦的青色激光器用于激发，以及电子倍增电荷耦合器件相机作为检测器。在成像开始前30分钟，将人工脑脊液（A CSF）置于水浴中加热至37摄氏度。同时，打开激光器、相机和加热插入装置，并将加热插入装置放置在显微镜载物台上。将转染的神经元玻片放入活细胞成像腔室，并迅速加入预热的 aCSF。将腔室置于显微镜载物台上带有加热装置的插入件中，在落射荧光成像模式下定位转染的神经元。随后切换至全内反射荧光（TIRF）成像模式，对神经元进行一分钟的光漂白，以消除细胞膜上任何预先存在的荧光信号。接下来，将 E-M-C-C-D 相机的电子倍增器增益设置为最大值，并以 10 赫兹的频率连续采集图像 1 分钟。所有成像完成后，每次记录将包含 600 张图像。使用 Image J 分析数据，以确定多巴胺 D2 受体的膜插入情况。将表达超 ecliptic 的小鼠纹状体中等多棘神经元转染了荧光标记的多巴胺 D2 受体（PDR D2）。随后进行活细胞全内反射荧光（TIRF）成像，以每 100 毫秒采集一帧的速率共获取 600 张图像。该图像显示了延时记录的最大强度投影，白色箭头指示含有 pH 敏感 D2 受体的单个囊泡与细胞膜融合的位置。该图像显示了YT最大强度投影，其中将XYT图像序列绕Y轴旋转90度，并将每个X轴线上最大像素值投影到单个Y轴像素上。为了提供有关插入时间进程的信息，这些数据表明，该方法可在其建立后成功用于研究培养的小鼠神经元中受体向质膜插入的调控机制。该技术为神经元受体转运领域的研究人员探索其他神经元质膜受体、通道蛋白及转运蛋白的调控机制奠定了基础。

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成像pHluorin标记插入到质膜受体原代培养的小鼠神经元

本方案概述了分离、通过电穿孔转染以及培养小鼠海马和皮层神经元所需的步骤。短期培养可用于轴突生长和导向研究，而长期培养则适用于突触形成和树突棘分析的研究。...

胚胎小鼠海马和皮层神经元的核转染与原代培养

本报告介绍了利用活细胞成像和光漂白技术，研究在神经元质膜上外源性表达的、pH敏感型GFP标记蛋白的表面表达、转运途径及运输动力学。...

利用荧光恢复与荧光丢失光漂白技术评估培养神经元中膜蛋白的侧向扩散与胞吐作用

来源：Schönherr, S., 等. 结合光遗传学与冰冻断裂复型免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布。 J. Vis. Exp.

小鼠脑组织冰冻断裂标本中神经元膜蛋白的免疫标记

来源： Lacin, E., et al．用于体内神经递质光学检测的基于细胞的神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）的构建．J. Vis. Exp.

利用基于细胞的神经递质荧光工程报告系统成像神经递质释放

此处介绍一种通过基因编码将光反应性非天然氨基酸定点插入培养神经元中表达的靶向神经元蛋白，从而利用短时闪光选择性激活该神经元蛋白的方法。 体内...

利用基因编码的非天然氨基酸在神经元中光学控制神经元蛋白

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic...

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

本文介绍了一种研究β-淀粉样蛋白（Aβ）在脑内早期作用的实验方案。该方案表明，Aβ可诱导网格蛋白介导的内吞作用以及轴突生长锥的塌陷。本方案适用于研究Aβ对轴突生长锥的早期影响，可能有助于阿尔茨海默病的预防。...

可视化培养小鼠神经元中轴突生长锥的塌陷及早期淀粉样蛋白β效应

在本报告中，我们描述了一种简单的方法，通过将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与目的蛋白共转染，以研究胚胎大鼠皮层神经元的神经突生长。...

基于增强型绿色荧光蛋白的原代神经元 neurite 生长研究方法

本文介绍了一种利用原代小鼠中脑神经元培养物，在体外检测中脑神经元内Ca2+流及其对caspase-3下游效应的方法。该模型可用于研究与中脑神经元Ca2+活动异常相关的病理生理变化，并用于筛选具有抗凋亡特性的新型治疗药物。...

量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca2+ 流及其下游效应

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

学习使用超敏pHluorin标记多巴胺D2受体，在原代培养小鼠海马神经元中实时成像质膜受体插入过程。该方法结合全内反射荧光显微镜技术，可揭示受体转运动态机制。

成像小鼠原代培养神经元中pHluorin标记受体插入质膜的过程

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