Name: 内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞模型缺血性中风激光多普勒血流仪在大鼠指导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学习使用内皮素-1诱导大鼠大脑中动脉闭塞模型研究缺血性中风的方法。该方案采用激光多普勒血流仪监测血流变化，通过颅骨钻孔注射ET-1实现快速且侵入性较小的手术操作，适用于神经科学研究。

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本研究得到了美国心脏协会大东南分会（09GRNT2060421）、美国医学会以及佛罗里达大学临床与转化科学研究所的资助。Adam Mecca 获美国国立卫生研究院/国立神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）NRSA 博士前 fellowship 项目支持（F30 NS-060335）。Robert Regenhardt 获佛罗里达大学高血压多学科培训项目（T32 HL-083810）博士前 fellowship 资助。

本方案已获得佛罗里达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合《实验动物照护与使用指南》（第八版，美国国家科学院，2011年）的要求。
材料
<ol>
 <li>动物：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Farms，Wilmington，MA，USA），手术时体重为250–300 g。
 </li>
 <li>麻醉
 <ol class="lalpha">
 <li>吸入式麻醉系统（VetEquip Inc.，Pleasanton，CA，USA） </li>
 <li>异氟烷麻醉剂（Baxter Pharmaceutics，Deerfield，IL，USA）</li>
 </ol>
 </li>
 <li>立体定位系统（David Kopf Instruments，Tujunga，CA，USA）
 <ol class="lalpha">
 <li>小型动物立体定位仪 </li>
 <li>大鼠用非穿刺式耳杆 </li>
 <li>大鼠用气体麻醉头固定装置 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>体温调节
 <ol class="lalpha">
 <li>BAT-12微探针温度计（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA） </li>
 <li>T/PUMP，TP600温控毯（Gaymar Industries, Inc.，Orchard Park，NY，USA） </li>
 </ol>
 </li>
 <li>手术器械 
 <ol class="lalpha">
 <li>手术刀柄及#11刀片、虹膜镊、格拉夫镊、鳄嘴钳牵开器、螺丝刀、10 μl注射器配26号斜面针头（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA） 
 </li>
 <li>微型电机钻及立体定位夹持器，Quintessential立体定位注射仪（Stoelting，Wood Dale，IL，USA） </li>
 <li>1.0 mm圆形钻头，1.0 mm倒锥形钻头（Roboz Surgical Instrument Co., Inc.，Gaithersburg，MD，USA） </li>
 </ol>
 </li>
 <li>手术耗材 
 <ol class="lalpha">
 <li>0-80 × 3/32固定螺钉（轴长2.4 mm）、21号导管套管[底座以下长度4 mm]及套管假体（Plastics one，Roanoke，VA，USA）</li>
 <li>捷式义齿用丙烯酸树脂及液剂（Lang Dental Manufacturing Co., Inc.，Wheeling，IL，USA） </li>
 <li>3.0尼龙缝线（Oasis，Mettawa，IL，USA） </li>
 <li>棉签，Puralube眼膏（Fisher Scientific，Pittsburg，PA，USA）</li>
 <li>电动剪毛器（Oster，Providence，RI，USA） </li>
 </ol>
 </li>
 <li>化学试剂
 <ol class="lalpha">
 <li>内皮素-1（American Peptide，Sunnyvale，CA，USA） </li>
 <li>2%氯己定（Agrilabs，St. Joseph，MO，USA） </li>
 <li>盐酸丁丙诺啡（Hospira Inc.，Lake Forest，IL，USA） </li>
 </ol>
 </li>
 <li>可视化设备 
 <ol class="lalpha">
 <li>手术显微镜（Seiler Instrument and Manufacturing；St. Louis，MO，USA） </li>
 <li>光纤照明仪（TechniQuip Corp.，Livermore，CA，USA）</li>
 </ol>
 </li>
 <li>激光多普勒血流仪系统（ADInstruments, Inc.，Colorado Springs，CO，USA） 
 <ol class="lalpha">
 <li>标准铅笔式探头 </li>
 <li>探头固定架</li>
 <li>血流仪 </li>
 <li>Powerlab 4/30 配 LabChart 7</li>
 </ol>
 </li>
 <li>梗死体积测量
 <ol class="lalpha">
 <li>大鼠脑组织切片模具（Zivic-Miller Lab., Inc.，Allison Park，PA，USA）</li>
 <li>2,3,5-三苯基氯化四氮唑（Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO，USA），用PBS稀释至0.05%</li>
 <li>平板扫描仪（Epson Perfection V30，Epson America, Inc.，Long Beach，CA，USA） </li>
 <li>Image J软件（ImageJ 1.42q软件，美国国立卫生研究院，Bethesda，MA，USA） </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
1. 术前步骤
<ol>
 <li>手术前，将大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环环境中，可自由饮水并摄取啮齿类动物饲料。</li>
 <li>在诱导舱中使用100% O2气体混合物中含4%异氟烷进行麻醉诱导，直至大鼠对后肢足垫夹捏不再出现回缩反应。</li>
 <li>手术过程中应保持无菌操作技术，包括使用无菌手套、无菌外科器械和无菌手术单11。</li>
 <li>使用电动剪刀剃除头部顶部的毛发。</li>
 <li>将大鼠俯卧位放置在吸水垫上，垫子置于温度可控的手术台面（加热毯）上。</li>
 <li>将头部固定于立体定位仪中，首先安装气体麻醉面罩。</li>
 <li>接着插入并拧紧耳杆。</li>
 <li>手术过程中以100% O2气体混合物中含2%异氟烷维持麻醉。</li>
 <li>双眼涂抹润滑性眼膏，并闭合眼睑，以防止手术过程中眼球干燥。</li>
 <li>插入直肠温度探头，以维持动物核心体温恒定在37±0.5 °C。</li>
 <li>在立体定位装置牢固固定头部后，交替使用2%氯己定和生理盐水对术区进行三次清洁消毒。</li>
</ol>
2. 手术步骤
<ol>
 <li>使用手术刀，在颅骨表面的皮肤上从眼睛最尾侧的位置（鼻根）至耳间（上项线）做一正中切口。</li>
 <li>随后用3个血管夹将皮肤向两侧牵开。</li>
 <li>使用干燥的棉签去除颅骨上的结缔组织，以便清晰观察多个解剖结构，包括前囟点、冠状缝和右侧颅骨侧嵴。同时使用棉签清除手术区域的血液。</li>
 <li>在手术显微镜下定位前囟点，并调整立体定位仪，使直径1.0 mm的圆形钻头在前囟点处归零。</li>
 <li>然后将钻头移至前囟点前方1.6 mm、外侧5.2 mm处。</li>
 <li>钻取穿透颅骨的骨孔，用于套管植入（图1）。使用棉签持续清除多余的碎屑和血液。</li>
</ol>
此时，可插入导管套管（步骤7），或通过颅骨钻孔直接注射ET-1（直接进入步骤16）。
<ol start="7"> 
 <li>接下来，使用1.0 mm倒锥形钻头在颅骨部分厚度上钻出3个用于安装螺钉的孔（图1）。在每侧额骨上各钻一个孔，位置位于冠状缝前方约1–2 mm，矢状缝外侧约1–2 mm处；在顶骨上钻第三个孔，位置位于冠状缝后方约2–3 mm，矢状缝外侧约2–3 mm处，且与导向套管钻孔同侧。将三枚0-80 × 3/32安装螺钉旋入上述钻孔中，用于支撑固定套管的牙科水泥。螺钉仅需旋入2至3圈，以免损伤硬脑膜。</li>
 <li>将导向套管置于立体定位套管夹持器中，并定位前囟点。</li>
 <li>调节立体定位操纵器，使导向套管在前囟点处归零。随后将套管移至位于前囟点前方1.6 mm、外侧5.2 mm处的钻孔位置。</li>
 <li>最后，将导向套管下降插入钻孔中，使其尖端最终位置位于前囟点腹侧4.5 mm处。</li>
 <li>激光多普勒血流探头放置（可选）
 <ol class="lalpha">
 <li> 为使用激光多普勒血流仪（LDF）监测脑血流量，可在用牙科水泥固定导向套管之前，先将探头支架放置到位。</li>
 <li>将探头支架底部修整至与基台齐平，仅保留一小块楔形凸起部分。</li>
 <li>随后将探头支架置于导向套管后方，紧靠颅骨外侧嵴的内侧，且使楔形凸起朝向内侧（图1）。</li>
 <li>使用牙科水泥将探头支架与导向套管固定在一起。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>随后使用牙科水泥将套管牢固固定。水泥应与全部三枚螺钉接触，并完全包绕套管基部。</li>
 <li>在移除套管夹持器之前，水泥必须完全干燥，此过程约需5分钟。</li>
</ol>
完成这些步骤后，可缝合手术切口，并将假插管拧入导向插管中。或者，可在大鼠从插管植入手术中恢复一段时间后，再进行ET-1诱导的MCAO操作。采用该方法时，应接着执行步骤19，而步骤14至18可在之后的某个时间进行。若需在同一次手术中完成导向插管植入和ET-1注射，则应接着执行步骤14。
<ol start="14">
<li>将ET-1（用PBS稀释至80 μM）装入注射器，然后将注射器安装至立体定位注射装置中。</li>
<li>调节立体定位操纵器，使针尖与导管套管边缘对齐归零。</li>
<li>将针尖通过导管套管下降至比套管边缘腹侧17.2 mm的位置。若未使用导管套管，则将针尖在前囟处归零，并通过颅骨钻孔下降至前囟腹侧8.7 mm处。</li>
<li>以1 μl/min的速率注入3 μl的80 μM ET-1。</li>
<li>注射完成后，将注射器留置原位3分钟，然后缓慢取出。</li>
<li>用3.0尼龙缝线缝合切口，并将套管假插件拧入套管中。</li>
<li>术后应给予适当剂量的镇痛剂（i.e. 布托啡诺，0.05–0.1 mg/kg），以减轻恢复期间的疼痛与不适。</li>
<li>将大鼠移出手术室，置于温暖、干燥的恢复区域，以防低体温，并提供自由、便捷获取的软质食物和饮水。</li>
</ol>

<ol><li>Stroke--1989. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke. 20, 1407-1431 (1989).</li>
<li>Lloyd-Jones, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2009+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 119, 480-486 (2009).</li>
<li>Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohr%2C+JP+%22Stroke%3A+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+management%22">Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management</a>. Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. , Churchill Livingstone. New York. 377-450 (1986).</li>
<li>Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+local+cerebral+blood+flow+to+pathological+levels+by+endothelin-1+applied+to+the+middle+cerebral+artery+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat.</a> Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).</li>
<li>Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+microapplication+of+endothelin-1%3A+a+new+model+of+focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).</li>
<li>O'Neill, M. J., Clemens, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal cerebral ischemia.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).</li>
<li>Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candesartan+pretreatment+is+cerebroprotective+in+a+rat+model+of+endothelin-1-induced+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion.</a> Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).</li>
<li>Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia%3A+procedural+pitfalls+and+translational+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Transl.+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 1, 8(2009).</li>
<li>Tomsick, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+thrombolysis+for+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Interv.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke.</a> J. Vasc. Interv. Radiol. 15, 67-76 (2004).</li>
<li>Olsen, T. S., Lassen, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+concept+of+middle+cerebral+artery+occlusion+and+cerebral+infarction+in+the+acute+state+based+on+interpreting+severe+hyperemia+as+a+sign+of+embolic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A dynamic concept of middle cerebral artery occlusion and cerebral infarction in the acute state based on interpreting severe hyperemia as a sign of embolic migration.</a> Stroke. 15, 458-468 (1984).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).</li>
<li>Gonzalez, C. L., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+different+models+of+stroke+on+behaviour+and+brain+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 1950-1962 (2003).</li>
<li>Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+%28MCAO%29+model+for+ischemic+stroke+with+laser+doppler+flowmetry+guidance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice.</a> J. Vis. Exp. (51), e2879(2011).</li>
<li>Sharkey, J., Butcher, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+an+experimental+model+of+stroke+produced+by+intracerebral+microinjection+of+endothelin-1+adjacent+to+the+rat+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery.</a> J. Neurosci. Methods. 60, 125-131 (1995).</li>
<li>Macrae, I. M., Robinson, M. J., Graham, D. I., Reid, J. L., McCulloch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1-induced+reductions+in+cerebral+blood+flow%3A+dose+dependency%2C+time+course%2C+and+neuropathological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 276-284 (1993).</li>
<li>Mecca, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebroprotection+by+angiotensin-%281-7%29+in+endothelin-1-induced+ischaemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke.</a> Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).</li>
<li>Fisher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+stroke+therapy+academic+industry+roundtable+preclinical+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations.</a> Stroke. 40, 2244-2250 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

内皮素-1（ET-1）诱导的MCAO是一种成熟的实验性缺血性脑卒中模型，已在多种大鼠品系中常规使用。使用该模型时，许多变量（如大鼠品系、动物年龄、体温、麻醉方法和操作者技术水平）可能导致梗死体积的变异性增加5, 14。然而，一些研究者指出，该模型的优势包括相对非侵入性的操作方式、脑血流量对ET-1呈剂量依赖性反应，以及可通过在清醒大鼠中输注ET-1完全避免使用麻醉14, 15。值得注意的是，文献中所使用的大鼠品系和年龄存在诸多差异，因此根据这些变量报告的立体定位坐标也有所不同并不令人意外。本方案中使用的坐标针对8周龄雄性Sprague Dawley大鼠进行了优化。若偏离该品系、性别或年龄，可能需要通过脑内注射染料并结合尸检来确定适用于该操作的有效坐标。此外，ET-1诱导的脑血流减少具有剂量依赖性。本方法所用剂量可导致注射同侧半球灰质约30–40%发生梗死，实验内均值的标准误约为4–5%7, 16。对大脑中动脉（MCA）近端部分进行直接观察显示，管腔直径在3分钟内降至基线水平的0%，并在约30分钟后恢复至基线水平7。利用激光多普勒血流仪（LDF）检测...

<table><tbody><tr><td colspan="4"> &lt;ol&gt; &lt;li&gt;动物：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠（Charles River Farms，美国马萨诸塞州威尔明顿），手术时体重为250–300 g。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;麻醉：&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;吸入式麻醉系统（VetEquip Inc.，美国加利福尼亚州普莱森顿）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;异氟烷麻醉剂（Baxter Pharmaceutics，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德）&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;立体定位系统（David Kopf Instruments，美国加利福尼亚州图云加）：&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;小型动物立体定位系统&lt;/li&gt; &lt;li&gt;大鼠用非穿刺耳杆&lt;/li&gt; &lt;li&gt;大鼠用气体麻醉头部固定器&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;li class=&quot;lalpha">体温调节：&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;BAT-12 微探针温度计（World Precision Instruments, Inc.，美国佛罗里达州萨拉索塔）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;T/PUMP，TP600 温控毯（Gaymar Industries, Inc.，美国纽约州果园公园）&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;外科器械&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;手术刀柄及#11刀片、虹膜镊、格拉夫镊、 bulldog夹牵开器、螺丝刀、10 &amp;mu;L 注射器配26号斜面针头（World Precision Instruments, Inc.，美国佛罗里达州萨拉索塔）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;微型电机钻及立体定位固定器，Quintessential 立体定位注射器（St&amp;#8211;lting，美国伊利诺伊州伍德代尔）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1.0 mm 圆形钻头，1.0 mm 倒锥形钻头（Roboz Surgical Instrument Co., Inc.，美国马里兰州盖瑟斯堡）&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;外科耗材&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;0-80 X 3/32 固定螺钉（轴长2.4 mm）、21号引导套管[底座以下4 mm长]及套管假体（Plastics one，美国弗吉尼亚州罗阿诺克）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Jet义齿用丙烯酸树脂及液剂（Lang Dental Manufacturing Co., Inc.，美国伊利诺伊州韦林）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;3.0 尼龙缝线（Oasis，美国伊利诺伊州梅塔瓦）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;棉签，Puralube眼膏（Fisher Scientific，美国宾夕法尼亚州匹兹堡）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;电动毛发剪（Oster，美国罗德岛州普罗维登斯）&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;化学试剂：&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;内皮素-1（American Peptide，美国加利福尼亚州森尼韦尔）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2% 氯己定（Agrilabs，美国密苏里州圣约瑟夫）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;盐酸丁丙诺啡（Hospira Inc.，美国伊利诺伊州莱克福里斯特）&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;可视化设备&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;手术显微镜（Seiler Instrument and Manufacturing，美国密苏里州圣路易斯）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;光纤照明器（TechniQuip Corp.，美国加利福尼亚州利弗莫尔）&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;激光多普勒血流仪系统（ADInstruments, Inc.，美国科罗拉多州科罗拉多斯普林斯）&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;标准铅笔探头&lt;/li&gt; &lt;li&gt;探头固定器&lt;/li&gt; &lt;li&gt;血流仪&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Powerlab 4/30 配 LabChart 7&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;梗死体积测量：&lt;ol class=&quot;lalpha"> &lt;li&gt;大鼠脑切片模具（Zivic-Miller Lab., Inc.，美国宾夕法尼亚州艾利森帕克）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2,3,5-三苯基氯化四氮唑（Sigma-Aldrich Co.，美国密苏里州圣路易斯），用PBS稀释至0.05%&lt;/li&gt; &lt;li&gt;平板扫描仪（Epson Perfection V30，Epson America, Inc.，美国加利福尼亚州长滩）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Image J 软件（ImageJ 1.42q 软件，美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达）&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; </td></tr></tbody></table>

内皮素-1诱导大鼠缺血性脑卒中模型结合激光多普勒血流仪引导的大脑中动脉阻塞

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

脑卒中是全球致残的首要原因，也是第三大死亡原因，仅2009年美国的相关费用估计就达700亿美元1, 2。目前已开发出多种脑缺血模型，以模拟人类脑卒中的病理状态。有研究指出，高达80%的脑卒中病例是由大脑中动脉（MCA）区域的缺血性损伤所致3。20世纪90年代初，研究人员通过开颅后将内皮素-1（ET-1）4直接施加于MCA表面来诱导缺血。随后，该模型被改进5，采用立体定位法将ET-1注射至MCA邻近区域，以产生局灶性脑缺血。该模型的主要优势包括操作快速、可通过调节ET-1剂量精确控制动脉收缩程度、无需干预脑外供血血管，以及再灌注过程较为缓慢，更接近人类脑卒中的再灌注情况5-7。然而，ET-1模型也存在一些缺点，例如需要进行开颅手术，且脑梗死体积的变异性较高8。通过在ET-1输注过程中使用激光多普勒血流仪（LDF）监测脑血流，可有效降低这种变异性。影响脑梗死体积变异性的因素包括输注的精确性以及所用ET-1试剂批次的差异6。另一个重要考虑是，尽管再灌注在人类脑卒中中较为常见，但ET-1诱导的MCA闭塞（MCAO）模型中闭塞持续时间可能无法完全模拟人类情况，因为在许多患者中，闭塞后数小时至数天内会出现部分再灌注9, 10。本实验方案将详细描述在大鼠中建立ET-1诱导的MCAO缺血性脑卒中模型的操作步骤，并指出整个过程中需特别注意的事项及潜在局限性。

1. 术后神经功能评估
动物恢复意识后，可采用多种测试评估神经功能缺损，包括平衡能力、抓握力量、足爪放置、姿势不对称性以及攀爬阶梯等。向日葵种子任务是一种对运动和感觉功能的粗略评估方法，其结果与梗死体积具有显著相关性7, 12。在此任务中，记录大鼠打开并吃掉5颗向日葵种子所需的时间。将5颗种子放置于一个空的、干燥的塑料笼子的一角，记录大鼠操作种子所用的时间。此外，还需记录所有种子被打开并食用后，笼内残留的壳碎片数量。神经功能缺损更严重的大鼠打开和食用种子所需时间更长，且会将种壳破碎成更多碎片。尽管并非该任务的正式组成部分，但在实验性脑卒中后的大鼠中，很容易观察到频繁误抓和掉落向日葵种子的现象。这包括主要使用一侧前爪，以及在尝试打开种壳时咬合无效等情况。
2. 脑梗死体积的染色与定量测量
在进行大脑中动脉（MCA）阻断和再灌注以建立短暂性脑缺血模型后，动物被实施安乐死，其冠状切片的脑组织采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，以评估梗死体积（<strong...

已开发出多种脑缺血动物模型以模拟人类中风状况。本方案描述了内皮素-1（ET-1）诱导的大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠缺血性中风模型。此外，还讨论了该模型的重要注意事项、优势与局限性。

中风是全球致残的首要原因和死亡的第三大原因，在美国每年造成的经济损失估计达700亿美元……

本视频方案描述了一种采用激光多普勒血流监测引导的大鼠内皮素-1诱导大脑中动脉阻塞缺血性脑卒中模型。该模型通过观察多个如图所示的解剖标志，经颅骨钻孔注射内皮素-1来实现，注射时可选择使用或不使用导向套管。目前已开发出多种脑缺血方法，用于模拟人类脑卒中的病理状态。一种模型涉及在颅内肿瘤附近的中动脉周围脑组织中注射强效血管收缩剂内皮素-1（endothelin-1）或81。ET-1脑卒中模型的主要优点是手术操作快速，且相较于其他模型（如经腔内线栓法诱导的中动脉闭塞模型）更具微创性。然而，ET-1脑卒中模型也存在一些缺点，包括需要进行开颅手术，以及脑卒中体积的变异性较高。本视频将逐步演示大鼠缺血性脑卒中的ET单次击打模型。我们还将讨论该操作的若干特殊注意事项以及常见误区。现在让我们开始。在诱导室中使用含4%异氟烷（ISO）的氧气诱导麻醉，并在手术期间以2%异氟烷维持麻醉。待大鼠麻醉后，使用电动剪毛器去除其头部冠状区域的毛发。随后将大鼠俯卧位放置于温控手术台面的纱布垫上，头部固定于立体定位仪中。然后收紧并调整耳杆。将润滑性眼用软膏涂抹于双眼，以防止眼睛干燥。在手术过程中，使用氯己定溶液和无菌生理盐水清洁头皮。在颅骨表面的皮肤上做一正中切口，切口位置从两眼最内侧之间延伸至双耳之间。接下来，将皮肤向侧方牵拉。使用干燥的棉签将结缔组织向侧方移动，以便观察骨性标志，如图所示。然后将钻头移至相对于人字缝前1.6毫米、侧方5.2毫米的位置。在此位置钻一个小的骨孔，应穿透颅骨但不损伤硬脑膜。接着，将钻头移开约三到四毫米，钻出三个相互分开的浅孔。这些浅孔用于放置三个固定锚钉，将三个固定螺钉部分旋入，以支撑固定引导套管的牙科水泥。将不锈钢21号导引套管插入颅骨钻孔中，深入至bgma以下4.5毫米处。随后将激光多普勒血流探头固定器置于导引套管稍后方及颅骨侧部内侧位置。使用Ridge牙科水泥将套管和探针固定器固定到位。重要的是要将水泥塑形，使其与全部三个螺丝接触，同时避免接触皮肤。待水泥完全干燥后，再移除立体定位臂的连接装置。记录大脑中动脉血流。将激光多普勒炎症探头置于探头架中。使用26号Hamilton注射器吸取新鲜的80 µM内皮素-1，并将其装入自动注射泵中。使用立体定位仪，将 Hamilton 注射器针头 lowered 直至接触导管套管的边缘。随后，将针头通过导管套管向腹侧降低 17.2 毫米，并注入三微升内皮细胞。注射速率为每分钟一微升，使用激光多普勒血流仪进行监测。可以看出，血流量较基线水平下降超过50%。随着时间推移，数分钟后逐渐恢复至接近基线水平。注射完成后数分钟，将针头从引导套管中轻柔抽出。最后，用缝线闭合伤口，并将套管封帽。为了评估卒中缺损的程度，可进行不同的神经学检查。这是向日葵籽进食实验的一个示例。通过记录大鼠吃完五颗种子所需的时间以及遗留的种壳碎片数量来评估其表

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内皮素-1诱导大脑中动脉闭塞模型缺血性中风激光多普勒血流仪在大鼠指导

在大鼠中通过手术诱导缺血性脑损伤是卒中研究中广泛应用的模型。本文展示了通过阻断大脑中动脉诱导局灶性脑缺血的方法。同时展示了通过组织学染色和磁共振成像对所形成的梗死区域进行可视化。...

大鼠大脑中动脉线栓法内血管闭塞局灶性脑缺血模型

大脑中动脉闭塞（MCAO）的管腔内模型是实验性缺血性卒中模型中最常用的模型。本文将结合激光多普勒血流仪的引导，详细演示该模型的全部操作步骤及其典型结果。...

小鼠缺血性卒中激光多普勒血流仪引导下经腔内大脑中动脉阻塞（MCAO）模型

本文介绍了一种通过颅窗和时序性颅骨切除术观察大鼠大脑动脉的方法，以可视化大脑中动脉的近端部分（图1）。该方法具有良好的适应性，可与多种药物递送技术结合，用于在活体（in...

利用颅窗技术观察内皮素-1诱导的中动脉闭塞期间的中脑动脉

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改良的大鼠大脑中动脉内栓塞卒中模型脑灌注监测系统

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本方案描述了通过大脑中动脉腔内阻塞建立小鼠短暂性局灶性脑缺血模型的方法。此外，还展示了使用磁共振成像和行为学测试进行结果评估的示例。...

短暂性大脑中动脉闭塞卒中模型

本方案描述了一种大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型，该模型在不造成损伤的情况下保留了脑血管的解剖结构。...

一种不损伤脑血管解剖结构的大鼠中动脉闭塞/再灌注模型

本方案为研究人员提供了使用改良Longa颈外动脉法在小鼠上进行大脑中动脉阻塞手术的逐步操作指南。本文介绍的改良方法旨在提高大脑中动脉阻塞的准确性，并确保完全再灌注。...

Longa 大脑中动脉阻塞法在完全再灌注中的优化

此处展示了一种微创外科手术操作，该操作包括将激光多普勒探头放置于颅骨上大脑中动脉（MCA）远端区域，即适用于大鼠和小鼠的眶周位置，以评估短暂性MCA闭塞期间的血流情况。...

在啮齿类动物模型中脑中动脉闭塞前将激光多普勒探针置于眼眶周围用于脑血流监测

本方案描述了通过颈总动脉进行大脑中动脉闭塞再灌注的准备工作流程。...

一种改良的中动脉闭塞再灌注模型制备方法

学习使用内皮素-1诱导大鼠大脑中动脉闭塞模型研究缺血性中风的方法。该方案采用激光多普勒血流仪监测血流变化，通过颅骨钻孔注射ET-1实现快速且侵入性较小的手术操作，适用于神经科学研究。

内皮素-1诱导大鼠缺血性脑卒中模型结合激光多普勒血流仪引导的大脑中动脉阻塞

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